?竹柏腋芽離體培養(yǎng)再生芽誘導體系中激素配比優(yōu)化研究

摘要：以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量配比的NAA和6-BA，對竹柏帶莖腋芽離體培養(yǎng)，分析不同處理對離體竹柏腋芽的愈傷組織和再生芽的誘導效果，篩選離體帶莖竹柏腋芽愈傷組織和再生芽誘導體系中NAA和6-BA最優(yōu)配比。結(jié)果表明：NAA和6-BA對竹柏帶莖腋芽的愈傷組織形成和分化出再生芽均具有極顯著的影響，且存在互作效應(yīng)；誘導愈傷組織形成的主次順序為NAA＞6-BA，最優(yōu)激素配比為： 0.50 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA；愈傷組織分化形成再生芽的主次順序為6-BA＞

NAA，最優(yōu)激素配比為： 0.50 mg/L 6-BA + 0.10 mg/L NAA。

關(guān)鍵詞：竹柏；腋芽離體培養(yǎng)；愈傷組織；再生芽

中圖分類號：S567.1+9; S339.4+9 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2025）02-0013-04

Optimization of Hormone Ratios in the Regenerated Shoot Induction System for in vitro Culture of Nageia nagi Axillary Buds

GONG Yuan，WU Chao-nan，LIU Fang，CHEN Jian-rong

（College of Biological and Chemical Engineering， Changsha University， Changsha 410022， PRC）

Abstract： Nageia nagi axillary buds were cultured in vitro in the basic media of MS supplemented with different mass ratios of NAA and 6-BA. The effects of different treatments on callus formation and regenerated shoot induction were observed to identify the optimal hormone ratio for callus and regenerated shoot induction systems. The results showed that both NAA and 6-BA had highly significant impacts on callus formation and shoot differentiation from stem-attached axillary buds of N. nagi and they exerted evident interactive effects. NAA had stronger effect on callus induction than 6-BA， and the optimal hormone combination was 0.50 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA. For shoot differentiation from callus， 6-BA had stronger effect than NAA， and the optimal hormone combination was 0.50 mg/L 6-BA + 0.10 mg/L NAA.

Key words： Nageia nagi; in vitro culture of axillary buds; callus; regenerated shoots

竹柏[Podocarpus nagi（Thunb.）Zoll. et Mor ex Zoll.]，別名羅漢柴，羅漢松科竹柏屬的喬木。竹柏是古老的裸子植物，被人們稱為活化石，是中國國家珍稀瀕危二級保護植物，廣泛分布于浙江、福建、江西、湖南、廣東、廣西、海南和四川等地[1] 。竹柏具有較高的觀賞、生態(tài)、藥用和經(jīng)濟價值[2]?！兑巴庵胁菟幾R別手冊》記載：“葉：止血，接骨，消腫，用于骨折、拔彈頭；莖皮及根祛風除濕，用于風濕疼痛”?，F(xiàn)代研究表明，竹柏葉片及枝條中的揮發(fā)油具有驅(qū)蟲、殺菌功效[3]，可開發(fā)生物驅(qū)蟲劑、滅菌劑；竹柏的根莖葉都可以入藥，其功效有舒筋活血、治療腰肌勞損、止血接骨、精神疾病、狐臭、眼疾、感冒、風濕性關(guān)節(jié)炎等[4]；竹柏葉中揮發(fā)油的主要成分欖香烯類化合物具有較強的抗腫瘤活性[5]；此外葉中富含黃酮，具有控制血糖和增強免疫力等功效，可以用于中藥開發(fā)[6]。

竹柏可以通過播種、扦插、嫁接的方式進行繁殖[7-10]。傳統(tǒng)的繁殖方式存在諸多限制，植物組織培養(yǎng)具有種質(zhì)保存、繁殖速度快、繁殖系數(shù)大、后代整齊一致、可獲得無毒苗、不受季節(jié)限制以及經(jīng)濟效益高等優(yōu)點，是當代生物學科中重要研究技術(shù)和手段[11]，但目前尚未找到利用竹柏植株營養(yǎng)體組織培養(yǎng)獲得無毒苗的研究報道。

本試驗以野生竹柏腋芽為組織培養(yǎng)材料，以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量配比的植物生長激素NAA與細胞分裂素6-BA，對竹柏腋芽進行離體培養(yǎng)，篩選誘導竹柏腋芽愈傷組織與再生芽形成的最優(yōu)激素配比方案，擬建立高效穩(wěn)定的誘導竹柏再生芽組織培養(yǎng)體系，為獲得大量竹柏試管苗提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

外植體：在連續(xù)晴3 d的2023年2月1日下午于長沙學院園林中采集竹柏無病蟲害一年生枝條，剪去葉片，露出腋芽，從腋芽上、下端各2 cm剪取帶莖健康腋芽（外植體）。

10%次氯酸鈉溶液、100%酒精、純水、MS粉末、瓊脂粉末、蔗糖粉末、0.2 mg/mL NAA，1 mg/mL 6-BA溶液。電子天平（FA2004，上海舜宇恒平科學儀器有限公司），結(jié)凈工作臺（SW-CJ-1F，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），高壓蒸汽滅菌器（OSI-30/L，上海申安醫(yī)療器械廠），萬用電爐（D/L，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9203A6，上海培英實驗儀器有限公司）。

1.2 試驗設(shè)計

按2因素4水平（表1）的正交試驗設(shè)16個處理，編號為：1（A1B1）、2（A1B2）、3（A1B3）、4（A1B4）、5（A2B1）、6（A2B2）、7（A2B3）、8（A2B4）、9（A3B1）、10（A3B2）、11（A3B3）、12（A3B4）、13（A4B1）、14（A4B2）、15（A4B3）、16（A4B4）。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基 以MS （Murashige and Skoog， 1962）為基本培養(yǎng)基，添加9 g/L瓊脂和30 g/L蔗糖，按照試驗設(shè)計加入不同質(zhì)量6-BA、NAA， 調(diào)pH值至 5.8，121℃滅菌30 min。每處理配置5瓶，共90瓶，標記好各處理編號。

1.3.2 外植體消毒處理 在超凈工作臺上進行外植體消毒處理：將采集的外植體先用75%乙醇浸泡30 s，再用3%～5%次氯酸鈉浸泡6 min，然后用無菌水洗滌5次，用濾紙吸干外植體表面的水分，備用。

1.3.3 愈傷組織誘導及增殖分化培養(yǎng) 將處理好的外植體接入MS培養(yǎng)基中，每瓶接種2個帶莖腋芽，每處理接種5瓶，用透氣組培瓶蓋蓋住瓶口，置于光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)，保持光照12 h/d、溫度25℃、濕度60%。

1.4 數(shù)據(jù)采集與分析

培養(yǎng)40 d觀察統(tǒng)計統(tǒng)計各處理外植體愈傷組織誘導率，90 d統(tǒng)計各處理再生芽增值數(shù)，觀察生長情況；用高清相機拍攝不同培養(yǎng)階段各處理外植體形態(tài)及愈傷組織、再生芽發(fā)生情況；采用 Microsoft Excel 2010 進行數(shù)據(jù)整理， 采用 SPSS 26.0 軟件進行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理竹柏外植體培養(yǎng)40 d愈傷組織誘導效果分析

由表2可知，處理1、12～16外植體培養(yǎng)40 d未形成愈傷組織，說明不添加A和B或添加A濃度為0.20 mg/L時，外植體均不能形成愈傷組織；不添加A僅添加B的處理2、3、4的愈傷組織誘導率分別為30%、10%、10%，處理2與處理3、4差異顯著，說明合適的6-BA的濃度為0.50 mg/L；不添加B僅添加A的處理5、9、13愈傷組織誘導率分別為70%、50%、0，且隨濃度的增加而顯著降低，說明合適的NAA的濃度為0.05 mg/L；不同A、B質(zhì)量配比處理中，處理6的愈傷組織誘導率（100%）顯著高于其他處理，其脫分化效果最好。

不同處理竹柏帶莖腋芽培養(yǎng)40 d愈傷組織誘導效果表明，NAA和6-BA對竹柏帶莖腋芽的愈傷組織形成具有極顯著的影響，且存在互作效應(yīng)，誘導作用的主次順序為NAA＞6-BA；合適的質(zhì)量濃度NAA為0.05 mg/L、6-BA為0.50 mg/L；以MS為基本培養(yǎng)基的竹柏帶莖腋芽愈傷組織誘導的最優(yōu)激素配比為： 0.50 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA。

2.2 不同處理竹柏外植體培養(yǎng)90 d再生芽增殖效果分析

由表5可知，不同處理竹柏外植體培養(yǎng)90 d均生長出再生芽，但處理1、13～16的增殖系數(shù)≤1；不添加A僅添加B的處理2、3、4的增殖系數(shù)分別為2.6、1.3、0.5，且隨濃度的增加而降低，處理間差異顯著，說明0.50 mg/L、1.00 mg/L的6-BA均能誘導產(chǎn)生叢生芽，合適的濃度為0.50 mg/L；不添加B僅添加A的處理5、9、13的增殖系數(shù)分別為1.2、1.5、0.7，處理9顯著高于處理5、13，說明0.05 mg/L、0.10 mg/L的NAA均能誘導產(chǎn)生叢生芽，合適的濃度為0.10 mg/L，但誘導效果顯著低于單獨添加0.50 mg/L的6-BA；不同濃度A、B配比處理中，處理10再生芽增殖系數(shù)（5.0）顯著高于其他處理，外植體生長良好，接種芽向上生長1cm，其中有5個接種芽生長出叢生芽。

3 討論

影響植物組織培養(yǎng)因素包括植物種類及外植體、滅菌消毒、培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑、培養(yǎng)環(huán)境等[12-15]，

在組織培養(yǎng)過程中易出現(xiàn)污染、褐化、黃化等諸多問題[16-17]。竹柏組織培養(yǎng)難度較大，因內(nèi)生菌造成外植體染菌率高，田小芳[18]采用傳統(tǒng)的組織表面消毒法對其內(nèi)生菌進行分離，總共獲得6株細菌、2株真菌，說明竹柏中含有多種內(nèi)生菌。本試驗中外植體染菌率達到50%左右，雖然所用竹柏帶莖腋芽采集的季節(jié)、天氣、時間符合文天崇等[19]研究的采集外植體污染率最低的條件，但外植體消毒方法與田小芳[18]的相近，很難殺死內(nèi)生菌，這可能是導致染菌率高的主要原因。

培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分及不同激素濃度對植物愈傷組織誘導、生根、分化的影響不同[20-21]。本試驗的外植體愈傷組織和再生芽分化誘導用1種培養(yǎng)基1次完成，培養(yǎng)基的養(yǎng)分和植物生長調(diào)節(jié)劑的不同配比可能對愈傷組織分化再生芽的效果產(chǎn)生一定影響。

不同光質(zhì)對植物組織培養(yǎng)的影響不同[22-23]。李丹[24]研究表明，紅光有利于竹柏幼苗的生長，不同光質(zhì)和光強培養(yǎng)中，紅光培養(yǎng)下竹柏的成活率最好，高達96.33%，地莖、株高、新生葉片數(shù)量最高；藍光培養(yǎng)下竹柏總根長、總根表面積、根尖數(shù)、根分支數(shù)生長最好。本試驗選擇普通暖光下照射12 h/d，可能影響再生芽的分化和生長。

4 結(jié)論

以MS為基本培養(yǎng)基，添加NAA和6-BA的不同質(zhì)量濃度配比，對竹柏帶莖芽培養(yǎng)，結(jié)果表明，NAA和6-BA對竹柏帶莖腋芽的愈傷組織形成和分化出再生芽均具有極顯著的影響，且存在互作效應(yīng)；誘導愈傷組織形成的主次順序為NAA＞6-BA，最優(yōu)激素配比為： 0.50 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA；愈傷組織分化形成再生芽的主次順序為6-BA＞NAA，

最優(yōu)激素配比為： 0.50 mg/L 6-BA + 0.10 mg/L NAA。

參考文獻：

[1] 謝黛，杜紅光，劉瑤. 竹柏葉的生藥鑒定[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2007，18（10）：2511.

[2] 呂金海．竹柏的植物文化及園林應(yīng)用研究[J]．現(xiàn)代園藝，2019（7）：65-67．

[3] 胡文杰，楊永紅，皮雪甜. 竹柏葉片及其枝條中揮發(fā)油化學成分分析與比較[J]. 西部林業(yè)科學，2014，43（5）： 135-138，159.

[4] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草-9[M]．上海：上?？茖W技術(shù)出版社，1999：582-587．

[5] 曾錚，申偉培，黃振光，等.瑤藥竹柏葉揮發(fā)油的成分及其抗腫瘤活性研究[J]．廣西醫(yī)科大學學報，2019，36（12）：2014-2016.

[6] 徐懷春，解成駿. 瑤藥竹柏的藥用研究[J]. 文山師范高等?？茖W校學報，2007，20（3）：104-107.

[7] 潘漢周. 竹柏的播種繁殖技術(shù)要求[J]. 廣東科技，2014，23（12）：147，141.

[8] 盧勝芬. 竹柏扦插育苗技術(shù)研究[J]. 防護林科技， 2016（8）：55-57.

[9] 魏洪，李偉生. 竹柏[Podocarpus nagi（thunb.）zoll.et Mor ex Zoll]扦插繁殖技術(shù)[J]. 中國科技信息，2015（23）：44-45.

[10] 紀成據(jù). 竹柏嫁接技術(shù)研究[J]. 農(nóng)業(yè)開發(fā)與裝備，2021（12）：247-248.

[11]張東旭，周增產(chǎn)，卜云龍，等．植物組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用研究進展[J]."北方園藝，2011（6）：209-213．

[12] 沈逢源，李高燕，劉思琪. 植物組織培養(yǎng)過程中的影響因素[J]. 現(xiàn)代園藝，2011（5）：12，21.

[13] 馬文科，朱雨瑩，陳兆貴，等. ‘克新13號’馬鈴薯植株再生和轉(zhuǎn)化技術(shù)[J].湖南農(nóng)業(yè)科學，2024（1）：7-13.

[14] 顧美影，李振洲，劉明鏑，等. 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對大果榛子扦插與組織培養(yǎng)效果的影響[J]. 中南農(nóng)業(yè)科技，2024，45（10）：262-264.

[15] 李文超，張明艷，葉鵬，等. 6-BA與NAA不同配比在毛建草組織培養(yǎng)中的作用研究[J]. 種子科技，2021，39（22）：25-26.

[16] 張清鳳，李啟菊，馬梅見，等. 植物組織培養(yǎng)中的常見問題及對策[J]. 現(xiàn)代園藝，2022（10）：177-179.

[17] 尤小婷，經(jīng)福林，張曼其，等. 植物組織培養(yǎng)褐化現(xiàn)象的發(fā)生及防治措施[J]. 山地農(nóng)業(yè)生物學報，2024，43（2）：34-39.

[18] 田小芳．竹柏內(nèi)生菌的分離篩選及DYSL5、LR5 16SrDNA的擴增[J]．熱帶農(nóng)業(yè)工程，2019，43（4）：31-37．

[19] 文天崇，乾朝陽，李布野. 植物組織培養(yǎng)外植體滅菌技術(shù)研究進展[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2024（13）：72-76.

[20] 王曉煒， 孫媛， 張成鴻， 等. 苦苣菜下胚軸愈傷組織分化及試管苗

培養(yǎng)研究[J]. 湖南文理學院學報（自然科學版），2014，26（4）：28-31.

[21] 王樹耀， 黃白紅. 大巖桐的組培快繁技術(shù)研究[J]. 湖南文理學院學報（自然科學版）， 2004，16（1）：43–44.

[22] 呂永平，陳志，李坤峰，等. 光照環(huán)境對大花月季組織培養(yǎng)的影響[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學報，2017，29（8）：1297-1304.

[23] 郭麗，朱飛雪，寇艷玲，等. 不同光質(zhì)對牡丹烏龍捧盛不定芽誘導的影響[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2021，60（7）：84-86，89.

[24] 李丹．竹柏幼苗生長和光合作用對光環(huán)境的響應(yīng)研究[D]．福州：福建農(nóng)林大學，2016：17-52．

（責任編輯：謝培庚）