東江水系大刺鰍線粒體基因組研究

摘要：采用PCR和DNA基因測序技術(shù)對東江大刺鰍線粒體基因組（mtDNA）測序，使用DNAstar、MEGA 11.0、MITOS Webserver、tRNAscan SE 1.21、Clustal Omega等軟件對所測得序列進行分析、比對，了解其mtDNA結(jié)構(gòu)與組成等特征。結(jié)果表明：東江大刺鰍mtDNA總長度為16 493 bp，具有明顯的AT堿基偏好性（54.4%），共37個編碼基因（蛋白編碼基因13個、rRNA基因2個和tRNA基因22個）和2個非編碼區(qū)（OL區(qū)和D-loop區(qū)），9個編碼基因分布在輕鏈（L鏈）上、28個編碼基因位于重鏈（H鏈）上；存在9處不同長度的基因間隔區(qū)，間隔長度為1～5 bp不等；存在6處基因重疊，位于ATP8和ATP6間的基因重疊最大，長度為10 bp；OL區(qū)位于tRNAAsn和tRNACys之間，長度為30 bp可以折疊成莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)，其莖區(qū)序列（5'-3'）為TCCCCGCC/AGGGGCGG，環(huán)區(qū)長度為13 bp；D-loop區(qū)位于tRNAPro和tRNAPhe基因之間，序列長度為871 bp，分為終止序列區(qū)（TAS）、中央保守區(qū)（CD）和保守序列區(qū)（CSB）3個區(qū)域；13個蛋白編碼基因中，COI的起始密碼子為GTG，其他均為ATG，終止密碼子包括TAG（COI）、TAA（ATP8、ND1、ND4L、ND5、ND6）和不完整終止密碼子TA（COIII、ND2、ATP6）、T（COII、ND3、ND4、Cyt b）4種；22個tRNA基因中，除了tRNASer（AGC）外其余都能折疊成典型的三葉草結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，東江大刺鰍與北江大刺鰍親緣關(guān)系較近。

關(guān)鍵詞：線粒體基因組；全序列分析；系統(tǒng)發(fā)育；東江大刺鰍

中圖分類號：S917.4 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2025）02-0073-08

Study of the Mitochondrial Genome of Mastacembelus armatus in Dongjiang River

WANG Kai-feng，CHEN Ding-xian，LIU Lan-yuan，LIN Sheng-yue，ZHANG Jie-ming，

LIANG Wei-qian，LI Qiang，GUI Lin

（School of Life Sciences， Guangzhou University， Guangzhou 510006， PRC）

Abstract： The mitochondrial genome of Mastacembelus armatus in Dongjiang River was sequenced by PCR and DNA sequencing. DNAstar， MEGA 11.0， MITOS Webserver， tRNAscan SE 1.21， and Clustal Omega were used for the comparison and analysis of the obtained sequences， on the basis of which the characteristics of the mitochondrial genome were elucidated. The results showed that the mitochondrial genome of M. armatus in Dongjiang River had a total length of 16 493 bp， distinct AT base preference （54.4%）， 37 coding genes （13 protein-coding genes， 2 rRNA genes， and 22 tRNA genes）， and 2 non-coding regions （OL region and D-loop region）. Nine and 28 coding genes existed on the light chain and heavy chain， respectively. There were 9 intergenic spacers with lengths ranging from 1 bp to 5 bp. Six instances of gene overlap were observed， with the largest overlap of 10 bp occurring between ATP8 and ATP6. The OL region， located between tRNAAsn and tRNACys， was 30 bp in length and could fold into a stem-loop secondary structure. Its stem sequence （5'-3'） was TCCCCGCC/AGGGGCGG， and the loop region was 13 bp long. The D-loop region， situated between tRNAPro and tRNAPhe genes， was 871 bp in length and was composed of three regions： the termination-associated sequence （TAS）， the central conserved domain （CD）， and the c onserved sequence block （CSB）. Among the 13 protein-coding genes， the start codon of COI was GTG， while that of the others were ATG. The stop codons included TAG （COI）， TAA （ATP8， ND1， ND4L， ND5， and ND6）， TA （COIII， ND2， ATP6）， and T （COII， ND3， ND4， and Cyt b）. Of the 22 tRNA genes， others except tRNASer （AGC） could fold into a typical cloverleaf structure. The phylogenetic analysis indicated that the M. armatus in Dongjiang River was closely related to that in Beijiang River.

Key words： mitochondrial genome; complete sequence analysis; phylogeny; Mastacembelus armatus in Dongjiang River

大刺鰍（Mastacembelus armatus）是合鰓魚目（Synbranchiformes）刺鰍科（Mastacembelidae）刺鰍屬（Mastacembelus）魚類，別名有納錐、石錐、粗麻割、辣椒魚等，廣泛分布于非洲、東亞及南亞地區(qū)[1]，在我國主要分布于長江、珠江等流域，是具有重要經(jīng)濟價值的魚類[2]。大刺鰍肉質(zhì)細嫩，蛋白質(zhì)含量高，含有15種氨基酸和19種脂肪酸，不飽和脂肪酸及人體必須氨基酸和脂肪酸占比較高，營養(yǎng)價值高，具有益氣壯陽、消渴利尿等功效，深受消費者喜愛[3-6]。然而，作為一種重要的經(jīng)濟魚類，其種群面臨著過度捕撈、水污染和棲息地破壞等挑戰(zhàn)，近年來大刺鰍的野生資源逐漸減少[7]。

在大刺鰍種群分化研究方面，高尚等[8]對華南地區(qū)7個獨立水系的16個地理群體大刺鰍的遺傳結(jié)構(gòu)與群體動態(tài)歷史研究發(fā)現(xiàn)，華南地區(qū)大刺鰍群體在百萬年前分化為3個譜系（I、II和III），群體遺傳分化符合距離隔離模式，現(xiàn)今不同譜系群體存在共域分布的現(xiàn)象；詹華偉等[9]通過測定廣東地區(qū)6個水系大刺鰍地理群體的線粒體Cyt b序列發(fā)現(xiàn)，廣東地區(qū)的大刺鰍種群分為Ⅰ和Ⅱ兩支，其中，支系Ⅰ包含了西江、北江、鑒江和漠陽江群體的部分樣本以及東江和韓江群體的全部樣本；支系Ⅱ包含了西江、北江、鑒江和漠陽江群體的部分樣本。

魚類線粒體DNA（mtDNA）結(jié)構(gòu)同大多數(shù)動物mtDNA結(jié)構(gòu)基本一樣，為共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA，是細胞核外具自主復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯能力的遺傳因子，長度為15～20 kb，約占總DNA含量的１％，與核DNA相比，具有分子較小、結(jié)構(gòu)簡單、進化速度快、編碼效率高、遺傳相對獨立性和母系遺傳等特點[10-12]。

多數(shù)魚類mtDNA編碼區(qū)包括13個蛋白質(zhì)編碼基因（PCG）、2個編碼核糖體核糖核酸（rRNA）基因、22個編碼轉(zhuǎn)移核糖核酸（tRNA）基因，非編碼區(qū)包括1個控制區(qū)（control region， CR。又稱D-loop區(qū)）和1個OL區(qū)[13]。因mtDNA具有的特點，且隨著DNA測序技術(shù)的逐漸成熟， 魚類mtDNA已被作為分子標記廣泛應(yīng)用于魚類種質(zhì)資源保護、群體多態(tài)性以及系統(tǒng)進化發(fā)育研究等領(lǐng)域[8-9， 14]。目前針對大刺鰍遺傳背景的研究較少，相關(guān)研究主要集中在形態(tài)學(xué)[15]、生殖學(xué)[16]、發(fā)育學(xué)[17]、營養(yǎng)學(xué)[18]等方面。

東江水系作為珠江流域干流之一，魚類資源豐富，其中的大刺鰍為1個地理種群。本研究采用PCR和DNA基因測序技術(shù)，對東江大刺鰍mtDNA的結(jié)構(gòu)與組成等特征進行分析，旨在為東江水系大刺鰍遺傳育種及種群資源利用和保護提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2023年9月10日于浰江大刺鰍黃顙魚國家級水產(chǎn)種質(zhì)資源保護區(qū)采大刺鰍（東江群體）樣品，剪取的尾鰭樣品用95%乙醇固定后于-20℃冰箱保存。

1.2 DNA提取與PCR擴增

DNA提取。使用從生工生物工程（上海）股份有限公司購買的“基因組DNA抽提試劑盒”，采用該試劑盒自帶方法提取。

mtDNA PCR擴增。根據(jù)需要擴增的mtDNA目標片段，采用Primer5設(shè)計相應(yīng)的18對上、下游引物（表1），設(shè)計的引物委托上海生工生物公司合成。分18次擴增，每次的PCR反應(yīng)體系為2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、目標片段的上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、模板DNA 3 μL、ddH2O 7.5 μL，用ddH2O代替模板DNA做陰性對照。PCR 擴增反應(yīng)條件設(shè)置為：94℃預(yù)變性 5 min；95℃變性 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸 5 min結(jié)束反應(yīng)。擴增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢驗合格后進行純化測序。

mtDNA測序。由上海生工生物公司對檢驗合格的擴增產(chǎn)物進行純化并測序。

1.3 序列處理及分析

測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST序列分析后，用DNAstar軟件和MEGA 11.0軟件對所測序列與GenBank數(shù)據(jù)庫下載序列比對，并進行人工校正；通過MITOS Webserver [MITOS Web Server （uni-leipzig. de）][19]識別并確定13種蛋白編碼基因的位點；利用tRNAscan SE 1.21識別出東江大刺鰍線粒體的tRNA基因和rRNA基因，并預(yù)測tRNA的二級結(jié)構(gòu)[20]；

利用Clustal Omega將東江大刺鰍mtDNA D-loop序列進行對比，使用ESPript3.0繪制與其他刺鰍科魚類mtDNA D-loop序列的多序列比對圖，對大刺鰍mtDNA D-loop結(jié)構(gòu)進行分析；根據(jù)tRNAAsn基因和tRNACys基因識別出OL區(qū)的長度與位置，通過RNA Structure Webserver模擬OL區(qū)二級結(jié)構(gòu)；使用Mitofish（https：//mitofish.aori.u-tokyo.ac.jp）制作mtDNA圖譜；利用MEGA 11.0軟件統(tǒng)計東江大刺鰍mtDNA堿基組成情況。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

以黃鱔（Monopterus albus）為外類群，使用MEGA 11.0將測得的東江大刺鰍mtDNA全基因組與Genbank數(shù)據(jù)庫中已有7種刺鰍的mtDNA全基因組進行多重比對，選擇鄰接法（Neighbour-Joining， NJ法）構(gòu)建9種魚類系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Bootstrap（1 000次重復(fù)）檢驗各分支節(jié)點的置信度。研究涉及的物種信息見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 東江大刺鰍mtDNA結(jié)構(gòu)與組成分析

東江大刺鰍mtDNA全序列長度為16 493 bp，包括蛋白編碼基因13個、tRNA基因22個、rRNA基因2個、OL區(qū)和D-loop區(qū)（表3）；mtDNA堿基含量：A、T、C、G 分別為29.1%、25.3%、30.9%、14.6%，A+T為54.4%，C+G為45.5%，A+T含量明顯高于C+G含量，表現(xiàn)出A+T偏好性，與脊椎動物的AT堿基偏好性一致。蛋白質(zhì)編碼基因的A+T含量為53.1%，tRNAs的A+T含量為55.8%，rRNAs的A+T含量為55.2%，D-loop具有最高的A+T含量（68.1%）（表4）。

9個編碼基因分布在輕鏈（L鏈）上，分別為ND6、tRNAGln、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr、tRNASer（UCA）、tRNAGlu和tRNAPro；28個編碼基因位于重鏈（H鏈）上，包括14個tRNA基因、12個蛋白編碼基因和2個rRNA基因（表3）。

東江大刺鰍mtDNA的不同基因或非編碼區(qū)之間存在間隔和重疊，在不同位置共檢測到9處基因間隔區(qū)，間隔長度為1～5 bp；存在6處基因重疊，其中，位于ATP8基因和ATP6基因間的基因重疊最大，長度為10 bp（表3）。

2.2 東江大刺鰍mtDNA非編碼區(qū)（D-loop、OL）序列分析

由表3、表4可知，東江大刺鰍mtDNA D-loop區(qū)位于tRNAPro和tRNAPhe基因之間，序列長度為871 bp，A、T、C、G堿基含量分別為32.6%、35.5%、

19.2%、1.6%，A+T含量為68.1%，遠高于全基因組A+T含量（54.4%），是整個線粒體基因組序列長度變異最大的區(qū)域，同時也是轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的起始位點。通過與刺鰍屬魚類的同源序列比較，繪制網(wǎng)紋刺鰍、東江大刺鰍和紅紋刺鰍D-loop序列的比對圖（圖1），識別出東江大刺鰍的D-loop分為3個區(qū)段：終止序列區(qū)（TAS）、中央保守區(qū)（CD）和保守序列區(qū)（CSB）；通過比對分析，成功在D-loop找出TAS區(qū)、三個中央保守區(qū)模塊（CSB-F，CSB-E和CSB-D）和三個保守區(qū)模塊（CSB-1，CSB-2和CSB-3）。通過三條刺鰍D-loop序列的比對可以看出同屬內(nèi)不同物種的中央控制區(qū)存在一定差異。

由表3可知，東江大刺鰍mtDNA OL區(qū)位于tRNAAsn和tRNACys之間，長度為30 bp，是L鏈復(fù)制的起始區(qū)。模擬東江大刺鰍、中華刺鰍（Sinobdella sinensis）和黃鱔（Monopterus albus）的OL區(qū)二級結(jié)構(gòu)（圖2）顯示，東江大刺鰍OL區(qū)可以折疊成莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)，其莖區(qū)序列（5'-3'）為TCCCCGCC/AGGGGCGG，環(huán)區(qū)長度為13 bp。東江大刺鰍OL莖區(qū)中具有8對堿基，其中7對為C-G堿基對，與北江大刺鰍和中華刺鰍OL莖區(qū)序列相同；而黃鱔OL莖區(qū)序列中僅存在6對C-G堿基對，且OL區(qū)二級結(jié)構(gòu)與刺鰍屬魚類存在明顯差別。

2.3 東江大刺鰍mtDNA編碼基因

由表3可知，東江大刺鰍mtDNA編碼基因組成、位置及作用如下。

2.3.1 蛋白編碼基因 東江大刺鰍mtDNA共有蛋白編碼基因13個，編碼3 796個氨基酸，除ND6蛋白編碼基因分布在L鏈上，其余12個蛋白編碼基因均位于H鏈上。其中，除COI的起始密碼子為GTG外，其他12個蛋白編碼基因起始密碼子均為ATG；COI的終止密碼子為TAG，ATP8、ND1、ND4L、ND5、ND6的終止密碼子為TAA，COIII、ATP6的終止密碼子為TA，COII、ND2、ND3、ND4、Cyt b的終止密碼子為T。在COIII、ATP6、COII、ND2、ND3、ND4、Cyt b這7種蛋白質(zhì)編碼基因中，存在不完整終止密碼子（T或TA）。

2.3.2 tRNA基因和rRNA基因 東江大刺鰍mtDNA

共有22個tRNA基因，其中8個tRNA編碼基因位于L鏈上、14個tRNA編碼基因位于H鏈上，總長度為1 553 bp。tRNA基因的長度在67 bp到 75 bp之間，其中tRNALys基因長度最長，為75 bp。tRNA基因中存在2個tRNASer基因（IUB code為AGC和UCA）和2個tRANLeu基因（IUB code為UUA和CUA）。除了tRNASer（AGC）缺少二氫尿嘧啶（DHU臂）外，余下tRNA基因均呈現(xiàn)出典型的三葉草二級結(jié)構(gòu)。同時，tRNA的二級結(jié)構(gòu)中存在一定數(shù)量的錯配現(xiàn)象。

東江大刺鰍mtDNA含有2個rRNA基因，即12S rRNA（950 bp）和16S rRNA（1 671 bp），均位于H鏈上，被tRNAVal基因隔開。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

采用鄰接法（Neighbor-Joining algorithm），構(gòu)建9種魚類mtDNA系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)果表明，刺鰍屬物種中每個魚種都獨立分支，不存在種屬之間的混合現(xiàn)象。東江大刺鰍與北江大刺鰍具有較近的進化關(guān)系，聚為一小支，置信度為100%；后又與海南大刺鰍聚為一支，推測東江、北江和海南地區(qū)大刺鰍親緣關(guān)系較近；另外，所有刺鰍科魚類最終構(gòu)成一支，形成單系群，且不存在交叉。

3 討論

東江大刺鰍的mtDNA包括37個編碼基因（蛋白編碼基因13個、rRNA基因2個和tRNA基因22個）和2個非編碼序列區(qū)（OL區(qū)和控制區(qū)），A+T含量（54.4%）明顯高于C+G含量（45.5%），表現(xiàn)為AT偏好性，這與吻鰕虎魚屬（Rhinogobius）、渭河高原鰍（Triplophysa weiheensis）等魚類[21-23]相似。東江大刺鰍13個蛋白編碼基因中有4種終止密碼（TAG、TAA、TA、T），其中有7種蛋白編碼基因為不完全終止密碼子（以TA或T結(jié)尾），可能是在轉(zhuǎn)錄過程中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加接上多腺苷酸[Ploy（A）]后形成UAA終止密碼子，來完成終止翻譯的功能[24]。

有研究表明，OL莖區(qū)序列相對保守，而環(huán)區(qū)多變[25]。東江大刺鰍線粒體的OL區(qū)位于5個tRNA基因組成的WANCY簇區(qū)內(nèi)，可以形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。蒲友光等[26]認為該結(jié)構(gòu)特征可能具有種屬特異性，并推測它在脊椎動物mtDNA中是一個比較進化的特征，目前在鳥類[27]、蟹類[28]等尚未發(fā)現(xiàn)，在兩棲類[29]、爬行類[30]和哺乳類[31]mtDNA中存在OL區(qū)，且其環(huán)形結(jié)構(gòu)為T堿基密集，而在已報道的硬骨魚類OL區(qū)結(jié)構(gòu)中，則為C堿基密集[32]。東江大刺鰍的OL區(qū)環(huán)形結(jié)構(gòu)中C堿基含量為30.9%，可以判斷為C堿基密集，與已報道的硬骨魚類特征相似。對比東江大刺鰍、中華刺鰍和黃鱔mtDNA OL區(qū)二級結(jié)構(gòu)，黃鱔OL區(qū)二級結(jié)構(gòu)與刺鰍屬魚類存在明顯差別，可以初步推測刺鰍屬魚類與其他魚類OL莖區(qū)存在差異。保守序列5'-GCCGG-3'被公認為是參與RNA引物合成的序列[33]，在東江大刺鰍的OL區(qū)中未發(fā)現(xiàn)。

系統(tǒng)發(fā)育學(xué)（Phylogenetics）研究的是有機體的進化關(guān)系，系統(tǒng)發(fā)育樹（Phylogenetictree）為描述有機體各個類群進化順序的拓撲結(jié)構(gòu)[12]。東江大刺鰍和北江大刺鰍親緣關(guān)系最近，首先聚為一支，然后與其余刺鰍屬魚類相聚，表明線粒體基因組序列適用于刺鰍屬魚類的系統(tǒng)發(fā)育分析。

4 結(jié)論

東江大刺鰍mtDNA總長度為16 493 bp，具有明顯的AT堿基偏好性（54.4%），共有37個編碼基因（蛋白編碼基因13個、rRNA基因2個和tRNA基因22個）和2個非編碼區(qū)（OL區(qū)和D-loop區(qū)），9個編碼基因分布在輕鏈（L鏈）上、28個編碼基因位于重鏈（H鏈）上；存在9處不同長度的基因間隔區(qū)，間隔長度為1～5 bp不等；同時存在6處基因重疊，位于ATP8和ATP6間的基因重疊最大，長度為10 bp。OL區(qū)位于tRNAAsn和tRNACys之間，序列長度為30 bp，可以折疊成莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)，其莖區(qū)序列（5'-3'）為TCCCCGCC/AGGGGCGG，環(huán)區(qū)長度為13 bp；莖區(qū)8對堿基中7對為C-G堿基對，與北江大刺鰍和中華刺鰍OL莖區(qū)序列相同。D-loop區(qū)位于tRNAPro和tRNAPhe基因之間，序列長度為871 bp，分為終止序列區(qū)（TAS）、中央保守區(qū)（CD）和保守序列區(qū)（CSB）3個區(qū)域，且與同屬的網(wǎng)紋刺鰍和紅紋刺鰍的D-loop區(qū)序列存在差異。13個蛋白編碼基因中，COI的起始密碼子為GTG，其他均為ATG；終止密碼子包括TAG（COI）、TAA（ATP8、ND1、ND4L、ND5、ND6）和不完整終止密碼子TA（COIII、ND2、ATP6）、T（COII、ND3、ND4、Cyt b）4種。22個tRNA基因中，除了tRNASer（AGC）外其余都能折疊成典型的三葉草結(jié)構(gòu)。東江大刺鰍mtDNA組成、長度和基因排列順序與典型的脊椎動物相似，其線粒體基因組序列適用于東江的系統(tǒng)發(fā)育分析，且親緣關(guān)系與北江大刺鰍相近。

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（責(zé)任編輯：謝培庚）