扎那米韋類衍生物的分子對(duì)接、3D-QSAR和分子設(shè)計(jì)研究

探討扎那米韋類衍生物對(duì)禽流感病毒神經(jīng)氨酸酶（NA）的抑制作用，為新的NA抑制劑的研發(fā)和設(shè)計(jì)提供有用的結(jié)構(gòu)信息，進(jìn)而對(duì)流感病毒的新藥研發(fā)產(chǎn)生一定的積極意義.首先，選取22個(gè)扎那米韋類的合成化合物為配體，與PDB（protein data bank）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的3BEQ受體蛋白進(jìn)行對(duì)接.然后，采用CoMFA和CoMSIA方法建立3D-QSAR預(yù)測(cè)模型，其中，CoMFA和CoMSIA模型的交叉驗(yàn)證系數(shù)q2分別為0.599和0.592，非交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)R2分別為0.999和0.775，這一結(jié)果表明2種模型都具有良好的預(yù)測(cè)能力.最后，根據(jù)對(duì)接結(jié)果和3D-QSAR模型的預(yù)測(cè)分析，設(shè)計(jì)得到2種對(duì)禽流感病毒抑制活性更高的分子.

扎那米韋衍生物; 神經(jīng)氨酸酶抑制劑; 分子對(duì)接; 3D-QSAR; 分子設(shè)計(jì)

O62

A

0367-08

03.007

神經(jīng)氨酸酶（NA）是位于流感病毒表面的包膜糖蛋白，其結(jié)構(gòu)類似于蘑菇云狀的4個(gè)相同亞基組成的四聚體結(jié)構(gòu)，每個(gè)亞基都是由一個(gè)6葉片螺旋槳狀結(jié)構(gòu)組成，每個(gè)單體都有球狀的頭部和桿狀的莖部^[1].NA是一種糖苷水解酶，在流感病毒的復(fù)制和傳播中起到重要作用.NA能夠水解唾液酸與細(xì)胞表面糖蛋白的糖苷鍵，促進(jìn)病毒在上呼吸道的傳播和子代病毒的釋放，進(jìn)而感染更多細(xì)胞^[2-3].以NA為靶點(diǎn)的選擇性抑制藥能夠與病毒的NA特異性結(jié)合，阻斷該酶的活性，促進(jìn)病毒彼此凝集，使其難以從已經(jīng)被感染的細(xì)胞表面釋放.

研究發(fā)現(xiàn)，NA的活性位點(diǎn)分為5個(gè)區(qū)域（s1～s5）^[4-5].扎那米韋抑制劑通過(guò)結(jié)構(gòu)中的胍基與流感病毒NA活性部位的氨基酸殘基產(chǎn)生氫鍵、靜電作用力和范德瓦爾斯力^[6-7].2002年，Honda等^[8]設(shè)計(jì)合成了7-烷氧基系列衍生物，Masuda等^[9]合成了一系列雙環(huán)醚類NA抑制劑，這些化合物主要對(duì)A型病毒有抑制作用.Yamashita等^[10]研究出了新的NA抑制劑CS-8958（3），活性測(cè)試比扎那米韋好而且更長(zhǎng)效.

扎那米韋作為第一個(gè)上市的NA抑制劑，其對(duì)流感病毒的抑制是以慢結(jié)合的方式進(jìn)行的，具有高度特異性.慢結(jié)合是本品分子中胍基部分的作用，且對(duì)流感A型病毒有特異性，對(duì)B型病毒作用較弱^[11].因此，開發(fā)活性更高的NA抑制劑成為近期藥物研究的熱點(diǎn).

1 研究方法

1.1 軟件程序 選用SYBYL-Dock軟件進(jìn)行分子對(duì)接研究，具體采用的是基于SYBYL-X2.0軟件上進(jìn)行的計(jì)算，若無(wú)特別說(shuō)明，各參數(shù)均為SYBYL默認(rèn)值.3D-QSAR定量構(gòu)象關(guān)系是通過(guò)CoMFA和CoMSIA模型了解分子的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)參數(shù)，找到結(jié)構(gòu)與活性之間的量變規(guī)律，以此預(yù)測(cè)新的分子的活性^[12-13].

1.2 數(shù)據(jù)來(lái)源及結(jié)構(gòu)優(yōu)化選取文獻(xiàn)[14]中合成的22個(gè)扎那米韋類化合物作為NA抑制劑，其母環(huán)結(jié)構(gòu)式如圖1所示，圖中的R取代基的結(jié)構(gòu)式列于表1.采用半數(shù)抑制濃度IC50的負(fù)對(duì)數(shù)作為他們的生物活性指標(biāo)，即pIC50進(jìn)行量度，pIC50數(shù)據(jù)值來(lái)自文獻(xiàn)[14].在22個(gè)化合物中隨機(jī)抽取4個(gè)化合物，即5號(hào)、10號(hào)、15號(hào)和20號(hào)為測(cè)試集化合物，其余18個(gè)化合物為訓(xùn)練集化合物.所有配體分子均采用tripos力場(chǎng)＼，添加氫原子和Gasteiger-Huckel電荷進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，Maxiterations設(shè)為1 000，Termination設(shè)為0.001，迭代算法選擇Force，優(yōu)化后得到的穩(wěn)定對(duì)象保存為mol2格式.

施建成，等：扎那米韋類衍生物的分子對(duì)接、3D-QSAR和分子設(shè)計(jì)研究

1.3 NA受體蛋白的獲取處理及對(duì)接設(shè)置 本研究選用PDB（protein data bank）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)且選其編號(hào)3BEQ作為N1亞型的受體蛋白，圖2為3BEQ受體蛋白的X衍射的晶體結(jié)構(gòu)圖.在對(duì)接的處理中將蛋白保留一個(gè)單體，刪去其他結(jié)構(gòu)和水分子，加上氫原子.NA受體蛋白的活性口袋高度保守，活性口袋為ARG118、GLU119、ASP151、ARG152、ARG156、TRP178、ARG224、GLU227、SER246、GLU276、ARG292和TYR406^[15].將22個(gè)優(yōu)化后的配體小分子分別與處理后的3BEQ蛋白受體進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接結(jié)果見表1.

1.4 3D-QSAR模型建立

將測(cè)試集化合物以共同骨架分子疊合，分別計(jì)算CoMFA和CoMSIA模型的參數(shù)值.其中，CoMFA模型包括立體場(chǎng)和靜電場(chǎng)，

CoMSIA模型包括立體場(chǎng)、靜電場(chǎng)、疏水場(chǎng)、氫鍵供體場(chǎng)和氫鍵受體場(chǎng).采用抽一法（leave-one-out）^[9]

對(duì)訓(xùn)練集化合物進(jìn)行交叉驗(yàn)證，計(jì)算模型的擬合能力和其他性質(zhì).通過(guò)所建立的CoMFA模型和CoMSIA模型，預(yù)測(cè)所有化合物的生物活性，并對(duì)所建立的模型進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 分子對(duì)接結(jié)果與分析 運(yùn)用SYBYL-X2.0軟件的Surflex-Dock功能模塊進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果用打分函數(shù)Total-Score、Crash、Polar等展示出來(lái)，其中Total-Score函數(shù)考慮了極性作用、疏水作用、焓和溶劑化等因素，該值越大對(duì)接復(fù)合物越穩(wěn)定^[16-17].22個(gè)化合物的對(duì)接打分情況（表1）顯示，21號(hào)化合物的對(duì)接打分最高，Total-Score打分為7.893 9，Crash值為-2.864 2，Polar值為5.902 1.下面以21號(hào)化合物的對(duì)接模型進(jìn)行分析.圖3為化合物21與3BEQ受體蛋白活性位點(diǎn)主要氨基酸殘基的作用模式，圖中加粗的球棍模型為21號(hào)化合物，熒光部分為21號(hào)化合物與周圍氨基酸形成的氫鍵.

由圖3可見，化合物21與氨基酸殘基的作用模式主要包括以下幾種情況：

1） 化合物21的胍基基團(tuán)與氨基酸殘基Asp151形成氫鍵;

2） 取代基中的醚鍵與Arg118形成2個(gè)氫鍵;

3） 母環(huán)六元環(huán)的OH基團(tuán)與氨基酸殘基Trp178形成氫鍵，共有4個(gè)氫鍵作用力;

4） 醚鍵、萘基與Ser246產(chǎn)生疏水作用;

5） 母環(huán)六元環(huán)的長(zhǎng)碳鏈與氨基酸殘基Glu227產(chǎn)生疏水作用.

此外，還有7個(gè)極性、疏水性和親水性的殘基，這表明化合物與殘基之間也有其他疏水作用和靜電作用產(chǎn)生，這表明在化合物21與氨基酸殘基之間主要產(chǎn)生氫鍵作用、疏水作用和靜電作用.根據(jù)對(duì)接結(jié)果，說(shuō)明Arg118、Glu119、Asp151、Arg152、Arg156、Trp178、Arg224、Glu227、Ser246、Glu276、Arg292和Tyr406是活性位點(diǎn)的主要氨基酸殘基.

2.2 CoMFA模型建立與分析

本研究在SYBYL-X2.0的QSAR板塊上進(jìn)行CoMFA計(jì)算，分析力場(chǎng)包括靜電場(chǎng)和立體場(chǎng).靜電場(chǎng)能和立體場(chǎng)能的enengy cutoff值為30.0 kJ/mol，網(wǎng)格點(diǎn)步長(zhǎng)為默認(rèn)值.如表2中所示，CoMFA模型交叉驗(yàn)證系數(shù)q2的值為0.599，最佳主成分?jǐn)?shù)n為6.由最佳主成分?jǐn)?shù)進(jìn)行非交叉驗(yàn)證建立的CoMFA模型得到的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.009，相關(guān)系數(shù)R2為0.999，F(xiàn)值為3 361.011，立體場(chǎng)和靜電場(chǎng)的貢獻(xiàn)值S＼，E分別為76.4%＼，23.6%.通過(guò)數(shù)據(jù)分析可知，基團(tuán)的空間效應(yīng)和電性分布對(duì)活性均有影響，立體場(chǎng)的影響高于靜電場(chǎng).

2.3 CoMSIA模型建立與分析 在SYBYL-X2.0的QSAR板塊上進(jìn)行CoMSIA計(jì)算，網(wǎng)格點(diǎn)步長(zhǎng)為默認(rèn)值.如表2中所示，采用5個(gè)組合的情況建立CoMSIA模型，因?yàn)閝2的值為0.592（gt;0.5），所以本模型為有效的預(yù)測(cè)模型，最佳主成分?jǐn)?shù)n為1，標(biāo)準(zhǔn)偏差SEE為0.157，相關(guān)系數(shù)R2為0.775，F(xiàn)為55.056，立體場(chǎng)貢獻(xiàn)值S為21.6%＼，靜電場(chǎng)貢獻(xiàn)值E為31.9%＼，疏水場(chǎng)貢獻(xiàn)值H為22%＼，氫鍵供體場(chǎng)的貢獻(xiàn)值D為13.6%，以及氫鍵受體場(chǎng)貢獻(xiàn)值A(chǔ)為10.9%.

2.4 3D-QSAR模型的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證所得到的CoMFA和CoMSIA模型的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)能力，將18個(gè)訓(xùn)練集化合物和4個(gè)測(cè)試集化合物利用已經(jīng)構(gòu)建好的3D-QSAR模型進(jìn)行生物活性的預(yù)測(cè)計(jì)算，得到22個(gè)化合物抑制活性的預(yù)測(cè)值，列于表1中.將預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行線性擬合，如圖4所示，圖中小方塊代表訓(xùn)練集化合物的擬合值，圓點(diǎn)為測(cè)試集化合物的擬合值.可以看出，所有訓(xùn)練集化合物的預(yù)測(cè)活性和實(shí)驗(yàn)活性數(shù)據(jù)線性關(guān)系比較理想，實(shí)驗(yàn)值和測(cè)試值的殘差不大，進(jìn)一步證明此模型具有較好的預(yù)測(cè)能力，可以用于預(yù)測(cè)與骨架結(jié)構(gòu)相似的化合物的活性.

2.5 3D-QSAR模型的三維等值線圖分析

2.5.1CoMFA模型的三維等值線圖分析選擇表1中活性最高的6號(hào)化合物為模板分子，CoMFA立體場(chǎng)和靜電場(chǎng)的三維等值線圖見圖5.

由圖5（a）可見，在化合物6的萘基和S鍵處適合引入更長(zhǎng)的碳鏈或者在碳鏈上連接大體積基團(tuán)，可在第一個(gè)環(huán)上引入一定體積的基團(tuán)，比如試著連接甲基、乙基等，可提高活性^[18-19].由圖5（b）可見，在化合物6的胍基下方和萘基的右下方處適合連接吸電子基團(tuán)，降低環(huán)上電子云密度以提高活性，結(jié)合立體場(chǎng)模型，萘基右下方適合加入較大體積的吸電子基團(tuán)，可以加入取代基如碳鏈來(lái)提高活性，胍基基團(tuán)處不宜改變體積.在取代基的正下方處適合加入大體積的且具有較大電負(fù)性的基團(tuán)，比如F-、Cl-、Br-、—CO羰基等基團(tuán).模型中立體場(chǎng)的貢獻(xiàn)值為76.4%，大于靜電場(chǎng)的貢獻(xiàn)值23.6%.因此，對(duì)化合物的修飾改造應(yīng)先考慮空間體積位阻的要求，再考慮靜電效應(yīng)的作用^[18-19].

2.5.2CoMSIA模型的三維等值線圖分析 圖6是表1中化合物6的CoMSIA模型的立體場(chǎng)、靜電場(chǎng)、疏水場(chǎng)、氫鍵供體場(chǎng)和氫鍵受體場(chǎng)的三維等值線圖.

由圖6（a）表明，增大取代基的體積以提高活性，可以將萘基上或者長(zhǎng)碳鏈S鍵處加入大體積基團(tuán)，例如甲基、乙基等.這個(gè)與之前的CoMFA的立體場(chǎng)模型一致^[20-21].由圖6（b）發(fā)現(xiàn)，CoMSIA模型的靜電場(chǎng)和CoMFA的靜電場(chǎng)部分相似，但也有不同處.由圖6（b）表明，在化合物6的胍基處適合連接吸電子基團(tuán)，降低環(huán)上電子云密度以提高活性，結(jié)合立體場(chǎng)模型，這里適合加入較小體積的吸電子基團(tuán)^[22-23].

由圖6（c）表明，化合物6的取代基加入體積大的疏水性基團(tuán)，可連接例如烴基、鹵素等結(jié)構(gòu).在醚鍵處加入親水性基團(tuán)，可將醚鍵改為羰基，有利于提高活性^[24-25].由圖6（d）和圖6（e）表明，增加小體積的氫鍵受體且氫鍵受體基團(tuán)是由電負(fù)性大的原子組成，其外層有未共用的電子對(duì)，可提高活性.另外，在胍基的其中一個(gè)氨基處加入氫鍵供體基團(tuán)可提高活性.CoMSIA模型的預(yù)測(cè)能力比CoMFA模型要強(qiáng)，因此在對(duì)化合物修飾改造時(shí)要優(yōu)先考慮CoMSIA模型.

3 分子設(shè)計(jì)

根據(jù)本文所建立的3D-QSAR模型的研究，對(duì)表1活性最高的化合物6號(hào)分子進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾.在化合物6的萘基基團(tuán)處加入大體積的取代基，并加入吸電子基團(tuán)以提高活性，根據(jù)這一結(jié)果，共設(shè)計(jì)了2個(gè)新的分子（表3），其中預(yù)測(cè)活性最高的為7.797，均高于表1中化合物6的活性（7.697）.

4 結(jié)論

本文緊密結(jié)合全球抗擊禽流感病毒藥物研究的新成果，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)＼，分子模擬為手段，研究了扎那米韋類衍生物對(duì)禽流感病毒神經(jīng)氨酸酶（ＮＡ）的抑制作用.首先，選取22個(gè)扎那米韋類的合成化合物為配體，與PDB（protein databank）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的3BEQ受體蛋白進(jìn)行對(duì)接.然后，采用CoMFA和CoMSIA方法建立3D-QSAR預(yù)測(cè)模型，其中，CoMFA和CoMSIA方法模型的交叉驗(yàn)證系數(shù)q2分別為0.599和0.592，非交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)R2分別為0.999和0.775，這一結(jié)果表明2種方法模型都具有良好的預(yù)測(cè)能力.最后，從三維等值線圖直觀地解釋了化合物的構(gòu)效關(guān)系，從立體場(chǎng)、靜電場(chǎng)、疏水場(chǎng)、氫鍵供體場(chǎng)和氫鍵受體場(chǎng)全方面解釋了影響化合物活性的結(jié)構(gòu)特征，根據(jù)這些分析結(jié)果，設(shè)計(jì)得到2種對(duì)NA抑制活性更好的分子，為進(jìn)一步開發(fā)治療禽流感的新型藥物提供理論基礎(chǔ).

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Molecular Docking，3D-QSAR and Molecular DesignStudies on Zanamivir Derivatives

SHI Jiancheng， ZHAO Dan

（1. School of Chemistry and Materials， Nanning Normal University， Nanning 530001， Guangxi;

2. Key Laboratory of Macromolecular Chemistry and Physics， Nanning Normal University， Nanning 530001， Guangxi）

To study the inhibitory activity of zanamivir derivatives on the virus neuraminidase of the avian influenza， 22 zanamivir derivatives were selected as ligands and docked with the 3BEQ receptor protein that was downloaded from the PDB（Protein Data Bank）database. The 3D-QSAR model was established by CoMFA and CoMSIA methods， where the cross validation coefficient q2 was 0.599 and non-cross validation coefficient R2 was 0.999 for CoMFA model， while the cross validation coefficient q2 was 0.592 and non-cross validation coefficient R2 was 0.775 for CoMSIA model. The results reveal that both models have good predictive capability. Based on the docking results and 3D-QSAR models， the novel melecules with stronger inhibitory activity were designed. The results are expected to provide useful structural information for the development of new neuraminidase inhibitors and have positive significance for the development of new drugs for influenza virus.

zanamivir derivatives; neuraminidase inhibitors; molecular docking; 3D-QSAR; molecular design

（編輯 余 毅）