豬捷申病毒5型VP1蛋白的原核表達及間接ELISA檢測方法的建立

摘 要：

旨在建立針對豬捷申病毒（porcine teschovirus，PTV）5型的間接ELISA檢測方法，為其防控提供物質(zhì)儲備。PTV是豬的一種急性、烈性病原，以高發(fā)病率和高致死率為主要特征。其臨床表現(xiàn)包括腦炎、肺炎、繁殖障礙、心肌炎及腹瀉等多種癥狀。但該病原亞型眾多，不同亞型間臨床表現(xiàn)差異較大，且缺乏高效、特異的血清學(xué)檢測方法，阻礙了對PTV-5的防治。本研究針對危害較大的PTV-5構(gòu)建了pET-30a-VP1重組質(zhì)粒，通過原核表達獲得了VP1蛋白，以純化的VP1為包被抗原，經(jīng)條件優(yōu)化成功建立了針對PTV-5的間接ELISA方法。該方法與常見豬源病毒標準陽性血清無交叉反應(yīng)，最低檢測稀釋度為1∶3 200，批內(nèi)與批間變異系數(shù)均低于10%，具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性。利用該方法對東北地區(qū)279份臨床樣本進行檢測，其陽性率為67.74%，與報道的流行情況相符。本研究建立的間接ELISA檢測方法綜合評價良好，為PTV-5的臨床檢測提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：

豬捷申病毒；VP1蛋白；原核表達；間接ELISA

中圖分類號：

S855.3 """"文獻標志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0883-07

收稿日期：2024-03-13

基金項目：甘肅省自然科學(xué)基金（22JR5RA027）

作者簡介：邵永恒（1996-），男，甘肅天水人，碩士生，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail：1203552240@qq.com

*通信作者：王雯慧，主要從事動物黏膜免疫學(xué)與黏膜免疫病理學(xué)、動物疾病病理學(xué)研究，E-mail：wwh777@126.com；陳佳寧，主要從事豬消化道疫病相關(guān)研究，E-mail：chenjianing@caas.cn

Prokaryotic Expression of VP1 Protein to Porcine Teschovirus Type 5 and the Establishment of an Indirect ELISA Detection Method

SHAO" Yongheng1， NI" Minting2，4， GAO" Mengling2， TANG" Jiao2，3， ZHANG" Gengxin2，4， LIN" Shengyu2，5， LIU" Guangliang2， CHEN" Jianing2*， WANG" Wenhui1*

（1.College of Veterinary Medicine， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070，" China;

2.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention， Lanzhou Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730000，" China;

3.College of Veterinary Medicine， Shanxi Agricultural University， Jinzhong 030801，" China;

4.College of Animal Science and Technology， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319，" China;

5.College of Animal Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002，" China）

Abstract：

The aim of this study was to establish an indirect ELISA method for the detection of porcine teschovirus （PTV） type 5 and to provide a material reserve for its prevention and control. PTV is an acute virulent pathogen of pigs， which is characterized by high morbidity and mortality. The clinical manifestations include encephalitis， pneumonia， reproductive disorders， myocarditis， and diarrhea. PTV can be divided into various subtypes. The clinical symptoms vary from each other. Therefore， lacking of efficient and specific serological detection methods blocks the control and prevention of PTV-5. This study inserted the VP1 gene of PTV-5 into pET-30a plasmid and obtained the VP1 protein. After optimizing the conditions， an indirect ELISA method against the VP1 of PTV-5 was successfully established. The method has no cross-reactivity with the standard positive sera of common porcine viruses. The lowest detection dilution was 1∶3 200， and the coefficients of variation were less than 10% both intra-and inter-batch， showing good specificity， sensitivity， and reproducibility of the method. A total of 279 clinical samples collected from the northeast were detected by this method. The results showed that the positive rate was 67.74%， which was in consistent with previous report. The indirect ELISA assay established in this study has a good overall evaluation and provides technical support for the clinical detection of PTV-5.

Key words：

porcine teschovirus; VP1; prokaryotic expression; indirect ELISA

*Corresponding authors： WANG Wenhui，E-mail：wwh777@126.com；CHEN Jianing，E-mail：chenjianing@caas.cn

豬捷申?。╬orcine teschen disease，PTD）是豬的一種烈性傳染病，以高發(fā)病率和高死亡率為主要特征。各年齡段的豬均對該病易感，但不同基因型引起的臨床癥狀不盡相同，主要包括豬腦炎、繁殖障礙、肺炎、腹瀉、心包炎、心肌炎以及皮膚損傷等［1-2］。該病最早發(fā)生于1929年原捷克斯洛伐克捷申地區(qū)［3］，因此命名為“豬捷申病”。目前還沒有PTD被凈化的成功案例。該病的病原為豬捷申病毒（porcine teschovirus，PTV），屬于小RNA病毒科捷申病毒屬，是一種單股正鏈RNA病毒，病毒粒子直徑22～33 nm，多為圓型，無囊膜［4］。其基因組全長約7.2 kb，擁有一個大的開放閱讀框［5］，長度約6 000 bp，編碼一個多聚蛋白［6-7］，在宿主蛋白酶作用下產(chǎn)生4種結(jié)構(gòu)蛋白，分別命名為VP1、VP2、VP3和VP4，它們共同構(gòu)成了病毒粒子的衣殼蛋白。

有研究發(fā)現(xiàn)，VP1蛋白是其主要的保護性抗原，位于病毒粒子的表面，可刺激病豬產(chǎn)生保護性抗體［8］。同時VP1蛋白也作為PTV不同基因型分類的主要依據(jù)［9］。

目前，國內(nèi)外用于PTV檢測的主要有間接免疫熒光試驗（IFA）［10］、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）［3］等血清學(xué)檢測方法。IFA需要特定的儀器，不適宜用于大面積的臨床診斷和篩查，難以在實際生產(chǎn)中推廣使用［11］。相比之下，ELISA診斷方法具有敏感性高、操作簡單、成本低以及適用于批量樣本檢測等優(yōu)點。因此，在動物傳染病檢疫、流行病學(xué)調(diào)查和免疫監(jiān)測等領(lǐng)域廣泛采用［3］。

現(xiàn)階段，PTV-2、PTV-3、PTV-5、PTV-6以及PTV-8等亞型毒株在國內(nèi)流行，其中PTV-1和PTV-5危害較大。研究發(fā)現(xiàn)，PTV-1和PTV-5均能引起豬腦脊髓灰質(zhì)炎［12］，PTV-5還與豬的肺炎和腹瀉相關(guān)。而目前市場上用于PTV檢測的ELISA試劑盒主要是世界動物衛(wèi)生組織推薦的進口產(chǎn)品［13］ ，但大多是基于PTV-1型開發(fā)的，針對其它基因型的檢測試劑盒目前尚未有相關(guān)報道。這極大地阻礙了對該病的檢測與凈化。因此，本研究擬基于實驗室分離的PTV-5型毒株建立VP1的間接ELISA方法，以期為PTV的流行病學(xué)調(diào)查和防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

豬捷申病毒5型分離毒株LZ-2022（GenBank序列號：OR962090），豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（porcine circovirus type 2，PCV-2）、塞內(nèi)卡病毒（Seneca valley virus，SVV）以及PTV標準血清（滅活后的PTV-5型毒株3次免疫仔豬制備）由本實驗室保存?zhèn)溆茫籔TV標準陰性血清（采自經(jīng)檢測無常見豬源病毒及任何基因型PTV感染的仔豬）、豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）、豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）、輪狀病毒（rotavirus，RV）標準血清以及279份臨床血清樣品由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物疾病研發(fā)與診斷實驗室惠贈。

1.2 主要試劑

HRP-山羊抗豬IgG（H+L）購自蘇州博特龍免疫技術(shù)有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、BamH Ⅰ、Xho Ⅰ、T4 DNA ligase、GeneJET PCR純化試劑盒、GeneJET質(zhì)粒小提試劑盒（Thermo Fisher）；2×Phanta Flash Master Mix（Vazyme）；DNA片段純化回收試劑盒Gel Extraction Kit（Omega公司）；DH5α、BL21（DE3）由本實驗室自制；96孔可拆式酶標板（Corning公司）；BSA（BioFROXX公司）；TMB底物顯色液（BioFX公司）。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)本研究前期分離得到的毒株LZ-2022，用Prime premier5軟件設(shè)計VP1全長的擴增引物：PTV- VP1-BamH Ⅰ-F： 5′-CGGGATCCATGGGTAATGTGGACTCTCCCCT-3′，PTV-VP1-Xho Ⅰ-R： 5′-CCGCTCGAGTTGTAGCATGGTAGTCATTGCT-3′，由北京擎科生物科技股份有限公司西安分公司合成。

1.4 VP1的擴增及pET-30a-VP1質(zhì)粒的構(gòu)建

取LZ-2022毒株，提取病毒總RNA，并利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲取病毒cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系：總RNA 1 μL，隨機引物1 μL，ddH2O 10 μL，混勻后在65℃水浴鍋中孵育5 min，緊接著加入RiboLock RNase Inhibitor 1 μL，10 mmol·L－1 dNTP混合物2 μL，5×反應(yīng)液4 μL，RevertAid M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，瞬離混勻。反應(yīng)程序：25℃反應(yīng)5 min，42℃反應(yīng)1 h。VP1擴增體系：ddH2O 7 μL，2× Phanta Flash Master Mix 10 μL，上游引物和下游引物各1 μL，cDNA 1 μL。隨后，經(jīng)BamH Ⅰ、Xho Ⅰ雙酶切，將目的片段與pET-30a載體連接，16℃反應(yīng)12 h，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆，經(jīng)雙酶切和測序鑒定正確后，將構(gòu)建成功的質(zhì)粒命名為pET-30a-VP1。

1.5 VP1蛋白的原核表達、鑒定及純化

將pET-30a-VP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，隨后陽性克隆在37℃恒溫搖床上擴培，當OD600值達到0.4～0.6時，加入IPTG，誘導(dǎo)蛋白表達并持續(xù)12 h。低溫離心，菌體超聲破碎，用SDS-PAGE和Western blot鑒定表達。Western blot的一抗分別采用His標簽的小鼠單抗和PTV-5豬陽性血清，37℃，2 h；二抗分別使用1∶5 000稀釋的Alexa Fluor 680標記山羊抗小鼠IgG和Alexa Fluor 488標記的山羊抗豬IgG，37℃，1 h。充分洗滌后，拍照記錄。最后，純化VP1并測定蛋白濃度。

1.6 VP1間接ELISA的條件優(yōu)化

在酶標板分別包被不同濃度的VP1抗原（每孔100、200、400、600、800 ng），以確定最佳抗原包被濃度；采用不同稀釋倍數(shù)（1∶100～1∶6 400）的PTV陽性血清，以確定最佳一抗稀釋比；利用棋盤法確定抗原包被條件和酶標二抗最佳稀釋比；嘗試使用1%脫脂乳、5%脫脂乳、2% BSA和2.5% BSA作為封閉液，在37℃分別封閉0.5、1、2、2.5 h，探索最佳封閉液和封閉時間；進一步優(yōu)化底物顯色時間（2～10 min）。通過比較陽性血清與陰性血清的OD450比值（P/N值），確定最佳反應(yīng)條件。

1.7 VP1間接ELISA判定標準的建立

使用之前優(yōu)化確定的最佳反應(yīng)條件，對已經(jīng)確定為PTV抗體陰性的12份豬血清進行檢測。酶標儀讀數(shù)后，計算標準陰性血清OD450的平均值（X）和標準差（S），根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理，樣本OD450≤X+2S判定為陰性，樣本OD450≥X+3S判定為陽性。

1.8 特異性試驗

按照已建立的間接ELISA方法對PEDV、TGEV、CSFV、FMDV、PRRSV、PRV、PCV-2、RV、SVV陽性血清進行間接ELISA檢測，同時設(shè)置PTV-5陰性和陽性血清及空白組作為對照，評估該方法的特異性。

1.9 敏感性試驗

使用已確定的標準PTV陽性豬血清，按照1∶800～1∶12 800的倍數(shù)稀釋，利用已建立的ELISA方法進行PTV抗體檢測，評估其敏感性。

1.10 重復(fù)性試驗

選取5份血清樣品，用同一批次包被的3個不同ELISA板對5份血清進行批內(nèi)重復(fù)性檢驗，同時用3個不同批次包被的ELISA板對5份血清進行批間重復(fù)性檢測；計算批內(nèi)或批間變異系數(shù)，計算公式為：CV=SD/X×100%，檢驗該方法的重復(fù)性。

1.11 臨床樣品的檢測

利用本研究中建立的間接ELISA抗體檢測方法對采集自東北地區(qū)的279份血清進行檢測。279份臨床血清樣品采自3～5月齡臨床健康豬，部分豬曾在早期出現(xiàn)呼吸道癥狀，但采樣時癥狀均已消失。樣品采集自吉林省大安市以及黑龍江省哈爾濱、大慶地區(qū)等16個豬場，其中12個豬場的糞樣中均檢出過PTV片段。

1.12 PTV國內(nèi)流行毒株VP1氨基酸序列一致性比較

從美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）中下載參考株（PTV-2、3、5、6以及8型）的VP1序列，將LZ-2022序列的VP1與參考株序列的VP1用EditSeq和MegAlign軟件進行序列比對，分析同源性。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的擴增和重組質(zhì)粒的構(gòu)建

通過PCR擴增獲得了約750 bp大小的片段，與預(yù)期相符（圖1A）。對重組質(zhì)粒進行PCR、雙酶切以及測序鑒定（圖1B），結(jié)果表明VP1基因成功插入到pET-30a質(zhì)粒中，且測序結(jié)果與參考序列完全一致。

2.2 重組蛋白的表達及鑒定

經(jīng)過超聲破碎處理后的菌體，利用SDS-PAGE鑒定，結(jié)果顯示重組蛋白大小為40 ku，并且以包涵體形式表達（圖2A）。分別采用His標簽的小鼠單抗和PTV-5豬陽性血清進行Western blot驗證，結(jié)果顯示，特異的蛋白條帶出現(xiàn)在與目的蛋白大小一致的位置（圖2B和2D）。經(jīng)透析純化后，可以在40 ku處觀察到相對單一的條帶（圖2C）。

2.3 VP1間接ELISA的條件優(yōu)化結(jié)果

通過棋盤法對各項條件進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)VP1抗原的理想包被濃度為100 ng·孔－1（圖3A）；包被條件和時間為4℃，12 h；一抗最佳稀釋比1∶1 600，孵育時間為37℃，1 h（圖3B）；同時間接免疫熒光檢測也表明血清稀釋比在1∶1 600時熒光信號最強（圖3E）；最佳封閉液為5%脫脂乳，封閉時間為37℃，2 h（圖3C）；HRP-山羊抗豬IgG（H+L）最佳稀釋比1∶10 000，孵育時間為37℃，1 h；底物最佳顯色條件為37℃反應(yīng)5 min（圖3D）。

2.4 VP1間接ELISA臨界值的確定

利用本研究建立的方法檢測12份PTV陰性血清后，計算得出平均值為0.227 7，標準差為0.065 9，因此當OD450≥0.425 4時判定為陽性，OD450≤0.359 5判定為陰性，0.359 5lt;OD450lt;0.425 4時判定為可疑樣品，需要重新測定。

2.5 特異性、敏感性、重復(fù)性試驗

利用本研究建立的方法對PEDV、TGEV、CSFV、FMDV、PRRSV、PRV、PCV-2、RV、SVV陽性血清進行檢測，結(jié)果顯示其它常見豬源病毒陽性血清的檢測值在0.10～0.25之間，均低于臨界值0.4254，表明本研究建立的間接ELISA方法與其它常見病毒血清之間無交叉反應(yīng)，特異性較強。敏感性試驗結(jié)果顯示，PTV陽性血清在1∶800和1∶1 600稀釋時OD值高于臨界值0.425 4，1∶3 200稀釋時OD值為0.479 3，接近臨界值0.425 4，在1∶6 400和1∶12 800稀釋時OD值在0.17～0.28之間，低于臨界值0.425 4。因此判定該間接ELISA方法對PTV陽性血清的最低檢測稀釋度為1∶3 200。重復(fù)性試驗得出批內(nèi)重復(fù)性試驗的變異系數(shù)為0.39%～8.43%；批間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)為0.33%～5.98%。批內(nèi)與批間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)均低于10%，表明以VP1蛋白作為檢測抗原所建立的間接ELISA方法具有良好的重復(fù)性。

2.6 臨床樣品檢測

利用本研究建立的間接ELISA方法檢測采集自東北地區(qū)的279份豬血清樣品，結(jié)果顯示其陽性率為67.74%（圖4），該結(jié)果進一步說明PTV在臨床中普遍存在，對它的防控亟待加強［14］。

2.7 PTV國內(nèi)流行毒株VP1氨基酸序列一致性比較

本研究中LZ-2022與PTV-5參考毒株VP1的氨基酸一致性達92%，而與PTV-2、3、6及8型毒株VP1的氨基酸一致性在72.0%～74.6%之間，同源性較低，同時缺乏其它亞型毒株的陽性血清，因此對其它亞型毒株的檢測能力存疑。

3 討 論

自1929年P(guān)TV被發(fā)現(xiàn)以來，該病毒在世界各個地區(qū)均有檢出。目前報道的約有22種基因型，不同基因型之間不存在交叉免疫保護，且臨床癥狀差異大［15］。其中PTV-1和PTV-5均能引起豬的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，感染前中期，病豬出現(xiàn)發(fā)熱、精神沉郁、厭食和行為失調(diào)等癥狀。隨著感染的持續(xù)，病豬所表現(xiàn)出來的角弓反張、非自主性眼球震顫及運動失調(diào)等癥狀進一步加重，病豬呈犬坐姿勢或者臥地不起，最終會因呼吸肌麻痹窒息而亡。而目前市售的PTV檢測試劑盒大多基于PTV-1毒株開發(fā)，導(dǎo)致PTD的凈化受限，同時PTV-5不同于其它基因型毒株，該毒株可導(dǎo)致豬只出現(xiàn)腦炎、肺炎和腹瀉等多種癥狀，甚至造成仔豬的死亡。鑒于以往“舊病再發(fā)”的經(jīng)歷，應(yīng)該時刻警惕該病帶來的潛在威脅。因此，對不同毒株的準確鑒定和診斷變得尤為重要。

作為一種快速準確的血清學(xué)檢測方法，ELISA自問世以來就被廣泛應(yīng)用于病原檢測領(lǐng)域。在豬捷申病的研究中，相關(guān)研究人員已經(jīng)將該技術(shù)應(yīng)用于PTV的檢測［16］，但國內(nèi)目前還沒有針對PTV-5相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)報道。本研究利用pET-30a-VP1重組質(zhì)粒，通過原核表達后純化獲得的VP1蛋白作為包被抗原，經(jīng)過條件優(yōu)化后建立的間接ELISA方法具有敏感性高、特異性強及重復(fù)性好等特點。通過對采集自東北地區(qū)臨床樣品檢測結(jié)果的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，PTV抗體陽性率為67.74%，說明該病毒在臨床中普遍存在［10，17］。

4 結(jié) 論

本研究以LZ-2022毒株的VP1蛋白為包被抗原，成功建立了針對PTV-5型毒株的間接ELISA方法，該方法具有敏感性高、穩(wěn)定性好、特異性強等優(yōu)勢，為PTV-5的臨床檢測提供了技術(shù)支持，同時該方法具有良好的應(yīng)用價值及進一步開發(fā)前景。

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（編輯 范子娟）