副豬格拉瑟菌OppA過表達(dá)株的構(gòu)建及其對(duì)小鼠免疫保護(hù)性研究

摘 要：

本研究旨在增加副豬格拉瑟菌寡肽滲透酶（oligopeptide permease，OppA）表達(dá)量，構(gòu)建可以過表達(dá)OppA的副豬格拉瑟菌株，并對(duì)其進(jìn)行小鼠的免疫保護(hù)試驗(yàn)以評(píng)價(jià)其作為格拉瑟病弱毒活疫苗的潛力。以副豬格拉瑟菌CF7066株為親本株，利用自然轉(zhuǎn)化和Flp-FRT無抗突變系統(tǒng)構(gòu)建副豬格拉瑟菌OppA過表達(dá)株，通過Western blot檢測(cè)OppA的表達(dá)量，通過阿拉伯糖誘導(dǎo)和提高培養(yǎng)溫度消除抗性基因和Flp表達(dá)質(zhì)粒。進(jìn)行小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)，通過檢測(cè)血清中抗體水平及脾淋巴細(xì)胞增殖、觀察小鼠死亡率。結(jié)果顯示：構(gòu)建了3株副豬格拉瑟菌OppA過表達(dá)株ΔnanH：：oppAR，ΔnanH：：oppA和ΔnanH：：PqseB-oppA。由于ΔnanH：：oppAR株中OppA的表達(dá)量顯著高于CF7066 （Plt;0.001），所以選擇該過表達(dá)株進(jìn)行小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)。小鼠在免疫后進(jìn)行rOppA-ELISA的抗體檢測(cè)，結(jié)果表明，ΔnanH：：oppAR免疫組的OppA抗體水平比CF7066組、ΔnanH組和PBS組高，但低于滅活疫苗組。用rOppA蛋白刺激脾淋巴細(xì)胞，ΔnanH：：oppAR和CF7066組小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖量顯著高于刺激前（P＜0.05），而ΔnanH、滅活疫苗組和PBS對(duì)照組沒有改變。用CF7066菌株進(jìn)行攻毒，其中滅活疫苗組、ΔnanH：：oppAR組、CF7066組對(duì)小鼠的保護(hù)率均為100%，ΔnanH組為75%。當(dāng)前研究構(gòu)建的3株副豬格拉瑟菌重組菌株中，ΔnanH：：oppAR的OppA表達(dá)水平最高，用該菌株免疫小鼠后產(chǎn)生OppA特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫，而且可對(duì)CF7066攻毒提供有效保護(hù)?；诖?，副豬格拉瑟菌OppA過表達(dá)株ΔnanH：：oppAR有望作為副豬格拉瑟菌的減毒活疫苗。

關(guān)鍵詞：

副豬格拉瑟菌；寡肽滲透酶；過表達(dá)；基因工程；弱毒疫苗

中圖分類號(hào)：S852.61

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A """"文章編號(hào)： 0366-6964（2025）02-0860-10

收稿日期：2024-03-21

基金項(xiàng)目：“十四五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 （2022YFD1800902）；湖北省科技重大專項(xiàng)（2021ABA005）

作者簡(jiǎn)介：李枝卉（1998-），女，湖北十堰人，碩士，主要從事副豬格拉瑟菌基因工程疫苗研究，E-mail： 1132879561@qq.com

*通信作者：徐曉娟，主要從事動(dòng)物傳染病診斷試劑和疫苗研究，E-mail：xuxiaojuan@mail.hzau.edu.cn

Construction of the Gleasserella parasuis Strain Overexpressing OppA and Evaluation of

Its Immunogenicity and Efficacity in Mice

LI" Zhihui1， LUO" Jinlin1， XIE" Hong1， LI" Mingkun1， LIN" Yang1， ZHANG" Yujiao1， XU" Yindi2，

CHEN" Huanchun1， CAI" Xuwang1， XU" Xiaojuan1*

（1.National Key Laboratory of Agricultural Microbiology， Key Laboratory of Preventive Veterinary

Medicine in Hubei Province， College of Veterinary Medicine， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China;

2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Research， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002，" China）

Abstract：

The study aims to construct Glaesserella parasuis （G. parasuis） mutants overexpressing oligopeptide permease gene through improvement of its expression capacity， and to evaluate its immunogenicity and efficacity in mice. G. parasuis CF7066 strain being used as the parent strain，the overexpressing mutans were constructed via natural transformation and Flp-FRT markless mutation system. The OppA expression capacity of the overexpression strains was detected by WB，and then strains were induced by arabinose to excise KanR cassette and were cultured at high temperature to eliminated Flp expression plasmid. The mutant of ΔnanH：：oppAR was selected for conductind immunization and challenge experiments in mice. Comprehensive evaluations were conducted on serum antibody levels， spleen lymphocyte proliferation and the murine survival rate. Three overexpressing mutans of ΔnanH：：oppAR， ΔnanH：：oppA andΔnanH：：PqseB-oppA were constructed. Because ΔnanH：：oppAR had the highest capacity for expression of OppA， it wase used for murine immunization experiment. The rOppA-ELISA showed that the mice immunized with ΔnanH：：oppAR strain produced the higher level of OppA antibody than CF7066 and ΔnanH， but lower than the commercial inactivated vaccine group. After being stimulated with rOppA， the number of lymphocyte proliferation were significantly larger than before immunization among the mice immunized with ΔnanH：：oppAR and with CF7066（P＜0.05）， but not in the mice immunized with ΔnanH， the inactivated vaccine and PBS control. The challenge experiment showed that the survival rate were 100% in the mice immunized with ΔnanH：：oppAR and CF7066， and it was 75% in ΔnanH group. Three overexpressing mutants of G. parasuis were constructed， in which ΔnanH：：oppAR has the highest expression capacity of OppA. Immunization and challenge experiments showed that ΔnanH：：oppAR elicited murine antibody production and splenic lymphocyte proliferation specific for OppA protein， and simultaneously provided substantial protection against the wild strain CF7066. Thus， ΔnanH：：oppAR possessed potential as an attenuated vaccine strain for G. parasuis.

Key words：

Glaesserella parasuis; oligopeptide permease; overexpression; genetic engineering; attenuated vaccines

*Corresponding author：" XU Xiaojuan， E-mail： xuxiaojuan@mail.hzau.edu.cn

副豬格拉瑟菌（Glaesserella parasuis，GPS）是定植于豬上呼吸道的一種病原菌，革蘭陰性菌，體外培養(yǎng)依賴NAD。該菌在豬免疫力低下或受到應(yīng)激時(shí)可導(dǎo)致全身性感染，引起以纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征的格拉瑟?。℅lsser’s disease）［1］。格拉瑟病存在于世界上所有養(yǎng)豬的國(guó)家和地區(qū)，在我國(guó)規(guī)?；B(yǎng)殖的豬群中多發(fā)。目前，我國(guó)用于預(yù)防該病的疫苗主要為多價(jià)的滅活苗。眾所周知，細(xì)菌滅活疫苗主要誘導(dǎo)體液免疫，產(chǎn)生血清型特異性的免疫保護(hù)，對(duì)制苗菌株以外血清型的免疫保護(hù)非常有限，而已知副豬格拉瑟菌有15個(gè)已知的血清型和27%的不能分型的菌株。然而，細(xì)菌弱毒苗接種具有與自然發(fā)病類似感染的過程，可提供全面的免疫原性更好的抗原成分，從而能誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，因此可提供針對(duì)不同血清型的交叉保護(hù)。所以，研究副豬格拉瑟菌的弱毒疫苗，可提高格拉瑟病的免疫預(yù)防的效果，對(duì)我國(guó)格拉瑟病防控具有重要意義。細(xì)菌的寡肽輸入是通過一種細(xì)菌外膜的結(jié)合ATP的轉(zhuǎn)運(yùn)體完成，該轉(zhuǎn)運(yùn)體命名為寡肽滲透酶（oligopeptide permease）。寡肽滲透酶由A、B、C、D、F 5種蛋白組成，其中四種蛋白OppBCDF存在于外膜形成孔道，OppA是位于周質(zhì)或外膜的脂蛋白，負(fù)責(zé)結(jié)合細(xì)胞外寡肽并轉(zhuǎn)運(yùn)至外膜［2-3］。研究表明，鼠疫耶爾森菌和卡他莫拉菌的重組OppA蛋白具有良好的免疫原性，在感染中可提供保護(hù)性免疫［4-6］。不僅如此，流感嗜血桿菌的OppA蛋白被證實(shí)可誘導(dǎo)小鼠肺Th17細(xì)胞特異的細(xì)胞免疫，可對(duì)不同血清型的流感嗜血桿菌提供交叉保護(hù)［7］。因此，本研究構(gòu)建了過表達(dá)OppA蛋白并缺失唾液酸酶基因nanH（Neuraminidase H）的GPS突變株ΔnanH：：oppAR，并通過小鼠的免疫保護(hù)試驗(yàn)對(duì)ΔnanH：：oppAR株在小鼠體內(nèi)的免疫原保護(hù)性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）購(gòu)自美國(guó)BD公司。新生犢牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、卡那霉素、慶大霉素購(gòu)自德國(guó)BioFroxx公司。環(huán)磷酸腺苷（cAMP）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。PhantaMax Super-Fidelity DNA Polymerase、2×Rapid Taq Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。Uniclone One Step Seamless Cloning Kit購(gòu)自金沙生物。各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs公司。質(zhì)粒DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)OmeGa Bio-Tek公司。HRPGoat Anti-Mouse IGG（H+L）購(gòu)自武漢愛博泰克生物科技有限公司。WB底物顯色試劑盒（Clarity Western ECL Substrate）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega Biotek公司。副豬格拉瑟菌滅活疫苗購(gòu)自武漢科前生物公司。

1.2 菌株、蛋白和抗血清

GPS菌株使用含有10%胎牛血清和補(bǔ)充20 μg·mL-1 NAD的TSA或者TSB培養(yǎng)，根據(jù)需要加入卡那霉素（50 μg·mL-1）或慶大霉素（20 μg·mL-1）。大腸桿菌BL21（DE3）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。用引物OppA-e-F/R擴(kuò)增去除信號(hào)肽的OppA編碼序列，用30a-F/R擴(kuò)增載體pET-30a的載體骨架，無縫克隆構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-OppA。用表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-OppA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，在16℃條件下用0.2 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)22 h，用鎳柱親和層析純化。純化rOppA分別使用弗式完全佐劑和弗式不完全佐劑乳化蛋白，分兩次免疫小鼠后制備rOppA蛋白的小鼠抗血清。NanH蛋白的抗血清為本實(shí)驗(yàn)室制備并保存［8］。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建

用于構(gòu)建過表達(dá)菌株的質(zhì)粒構(gòu)建方法：首先，使用引物ori-F/R和kan-R/F從pKF-ΔnanH擴(kuò)增質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)和帶有FRT位點(diǎn)的卡那抗性表達(dá)盒，再用引物oppA-F/R、nanH-down-F/R和nanH-up-F/R從CF7066基因組擴(kuò)增oppA基因和nanH基因上游同源臂，上述所得PCR產(chǎn)物純化后通過無縫克隆，獲得質(zhì)粒pKF-ΔnanH-oppA。然后，使用引物P1-F/R從質(zhì)粒pKF-ΔnanH-oppA擴(kuò)增卡那抗性和oppA基因表達(dá)盒，再用引物P2-F/R擴(kuò)增質(zhì)粒其余部分，無縫克隆獲得質(zhì)粒pKF-ΔnanH-oppAR。最后，使用引物對(duì)P3-F/R擴(kuò)增從CF7066株P(guān)qseB啟動(dòng)子，用引物P4-F/R從pKF-ΔnanH-oppA擴(kuò)增無oppA啟動(dòng)子區(qū)域，無縫克隆獲得質(zhì)粒pKF-ΔnanH-PqseB-oppA（表1、2；圖1）。

1.4 過表達(dá)株的構(gòu)建

OppA過表達(dá)菌株的構(gòu)健參照文獻(xiàn)［9］。首先電轉(zhuǎn)化Flp酶表達(dá)質(zhì)粒pGF到CF7066獲得慶大抗性的重組菌株CF7066（pGF），再將質(zhì)粒pKF-ΔnanH-oppA、pKF-ΔnanH-oppAR和pKF-ΔnanH-PqseB-oppA自然轉(zhuǎn)化到CF7066（pGF）中，獲得具有慶大和卡那抗性的突變株CF7066ΔnanH：：oppA：：kan（pGF）、CF7066ΔnanH：：oppAR：：kan（pGF）和CF7066ΔnanH：：PqseB-oppA：：kan（pGF）。最后，經(jīng)10mmol·L-1阿拉伯糖誘導(dǎo)和42℃無抗條件下培養(yǎng)，消除卡那抗性基因和Flp酶表達(dá)質(zhì)粒pGF，最終獲得無抗性和無質(zhì)粒的突變株CF7066ΔnanH：：oppA、CF7066ΔnanH：：oppAR和CF7066ΔnanH：：PqseB-oppA（表2）。

1.5 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將所構(gòu)建的OppA過表達(dá)菌株在無抗的TSA平板上連續(xù)接種3代，挑取單菌落接種于5 mL TSB培養(yǎng)基，于37℃搖床上以200 r·min-1（振蕩培養(yǎng)過夜，按1∶100轉(zhuǎn)接于新鮮TSB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。間隔2 h測(cè)定菌液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD600 nm），記錄OD600 nm并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6 Western blot

菌株接種于TSA平板37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種TSB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600 nm為 1.0時(shí)收

集菌液，離心后取菌體和上清分別制樣。樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，TBST洗滌3次。在含5%脫脂乳的TBST溶液中于室溫封閉2 h后。分別按1∶5 000加入小鼠抗rOppA蛋白的血清和GAPDH單克隆抗體于4℃過夜孵育。TBST洗滌3次后，將PVDF膜放入含5%脫脂乳的TBST溶液中，按1∶5 000加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG （1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，于ECL超敏化學(xué)發(fā)光液中顯色后將PVDF膜置于凝膠成像系統(tǒng)中顯色。

1.7 小鼠免疫試驗(yàn)

6周齡雌性BALB/c小鼠40只，其中30只分為3組，10只·組-1，分別接種CF7066、CF7066ΔnanH、CF7066ΔnanH：：oppAR（8只用于保護(hù)率評(píng)價(jià)，2只用于淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)）。剩余10只分為2組，5只·組-1，接種滅活疫苗和作為攻毒對(duì)照?；罹拿庖邉┝繛?×107 CFU·只-1，免疫途徑為腹腔注射。滅活疫苗頸部肌肉注射。一免后14 d二免，二免后14 d攻毒，攻毒菌株為CF7066，劑量為5×109 CFU·只-1，腹腔注射。攻毒后，觀察小鼠精神狀態(tài)和存活情況，記錄死亡率。對(duì)免疫前后血清中OppA蛋白的抗體通過rOppA-ELISA進(jìn)行檢測(cè)。分別于一免前、一免后7 d、一免后14 d、二免后7 d采血，分離血清檢測(cè)。

1.8 rOppA-ELISA

將表達(dá)純化的rOppA 蛋白用包被液（碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至1.0 μg·mL-1，100 μL·孔-1加入酶標(biāo)板4 ℃包被過夜。用洗滌液（含有0.05%Tween-20的PBS）200 μL·孔-1洗滌3次，加封閉液（含5%脫脂乳的洗滌液）200 μL·孔-137 ℃溫育2h，洗滌3次。用樣品稀釋液（PBS含有0.05%Tween-20，0.5%BSA）將被檢血清做1∶200稀釋，加100 μL·孔-137 ℃作用1 h，洗滌3次。加1∶15 000稀釋的的HPR標(biāo)記的羊抗鼠二抗（ABclonal）100 μL·孔-137 ℃作用60 min，洗滌3次。加底物液四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和30% H2O2各50 μL·孔-1，混勻室溫避光顯色15 min，加50 μL·孔-1終止液氫氟酸（0.25%），10 min內(nèi)在酶標(biāo)儀上測(cè)波長(zhǎng)630 nm處的吸光值（OD630 nm）。

1.9 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

二免后7 d，每組取兩只小鼠，處死后分離脾淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為107·mL-1，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。將均勻分散的脾淋巴細(xì)胞接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入終濃度為10 μg·mL-1的OppA蛋白。對(duì)照組加入終濃度10 μg·mL-1 ConA蛋白，空白組不加僅有細(xì)胞。每組重復(fù)3個(gè)孔，試驗(yàn)重復(fù)兩次。置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中68 h后，每孔加入CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處的吸光值（OD450 nm）。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

小鼠抗體水平檢測(cè)和淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)的結(jié)果分析使用GraphPad9.5.0軟件的雙因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 OppA蛋白的表達(dá)和抗血清制備

通過SignalP軟件預(yù)測(cè)OppA的信號(hào)肽，將去除信號(hào)肽的OppA編碼序列克隆到載體pET-30a，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-OppA。質(zhì)粒測(cè)序正確后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）摸索最佳表達(dá)條件。結(jié)果表明，rOppA可溶性大量表達(dá)的條件是0.8 mmol·L-1 IPTG，16 ℃22 h。用鎳柱對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化，洗脫蛋白的咪唑濃度為100 mmol·L-1（圖2A）。純化蛋白免疫小鼠制備抗血清，通過Western blot檢測(cè)顯示，小鼠抗血清可以與大腸桿菌表達(dá)的rOppA蛋白和CF7066菌株的天然OppA蛋白反應(yīng)，而未免疫小鼠血清均不反應(yīng)（圖2B、C）。CF7066菌體中OppA蛋白的預(yù)期大小為58.3 ku，而rOppA蛋白由于兩端標(biāo)簽和蛋白酶切位點(diǎn)序列的引入，預(yù)期大小為64.3 ku。所以，通過Western blot檢測(cè)天然OppA蛋白和rOppA時(shí)大小不一致是合理的。上述結(jié)果表明，rOppA的免疫原性良好，其抗血清可以對(duì)GPS菌株中天然的OppA蛋白通過Western blot進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 3株過表達(dá)菌株OppA的表達(dá)量

以GPS血清5型分離株CF7066為親本株，通過自然轉(zhuǎn)化和Flp-FRT介導(dǎo)的無抗基因敲除系統(tǒng)［9］，在缺失的nanH基因座插入3種oppA基因表達(dá)盒，構(gòu)建了3株OppA蛋白過表達(dá)株，分別是ΔnanH：：oppA、ΔnanH：：oppAR和ΔnanH：：PqseB-oppA。其中，ΔnanH：：oppA中使用了oppA基因自身啟動(dòng)子，ΔnanH：：oppAR也使用了自身啟動(dòng)子，但oppA基因表達(dá)盒的方向與nanH基因轉(zhuǎn)錄方向相反，ΔnanH：：PqseB-oppA使用了qseB基因的啟動(dòng)子，oppA基因表達(dá)盒的方向也與nanH相反（圖1）。

3株過表達(dá)菌株接種TSA平板活化，接種單菌落在TSB液體培養(yǎng)基至OD600 nm為1.0，收集菌液對(duì)菌體和培養(yǎng)上清中OppA蛋白使用小鼠抗rOppA血清進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果表明，3株過表達(dá)菌株和CF7066的菌體細(xì)胞中OppA蛋白的表達(dá)量差異不顯著（P＞0.5，圖3A、B），而3株過表達(dá)菌株分泌到培養(yǎng)上清中的OppA蛋白的量顯著高于CF7066（P＜0.01，圖3C、D）。值得注意的是，Western blot檢測(cè)到的菌體中OppA蛋白的分子量比在上清中的大，這是由于分泌到上清中的OppA蛋白的信號(hào)肽（26 aa）已被切除。此外，通過Western blot對(duì)唾液酸酶NanH進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)CF7066中有NanH的表達(dá)，而過表達(dá)株都沒有（圖3E），表明所構(gòu)建的過表達(dá)株中nanH基因敲除成功?？傊?，當(dāng)前研究構(gòu)建了3株可以過表達(dá)OppA蛋白的GPS突變株，其過表達(dá)的OppA蛋白分泌到培養(yǎng)上清中以分泌蛋白的形式存在。

2.3 過表達(dá)株ΔnanH：：oppAR株對(duì)小鼠的免疫原性

進(jìn)行了3株過表達(dá)菌株和CF7066的體外培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。結(jié)果顯示，CF7066生長(zhǎng)最快，過表達(dá)株的生長(zhǎng)速度均下降（圖4A）。盡管ΔnanH：：PqseB-oppA體外生長(zhǎng)速度接近親本株，但由于其使用了GPS的qseB基因啟動(dòng)子，可能會(huì)存在潛在的負(fù)面效應(yīng)，而ΔnanH：：oppAR使用了oppA基因天然啟動(dòng)子，而且ΔnanH：：oppAR中OppA表達(dá)量比ΔnanH：：PqseB-oppA高（圖3D）。因此，選擇ΔnanH：：oppAR株作為格拉瑟菌弱毒疫苗候選菌

株進(jìn)行小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)。

BALB/c小鼠分為5組，4組分別接種ΔnanH：：oppAR、ΔnanH、 CF7066和滅活苗進(jìn)行免疫，對(duì)照組注射PBS。在小鼠免疫前和免疫后每間隔一周，用rOppA-ELIA對(duì)每組血清抗體進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，二免后一周（21 d），滅活疫苗組OD630 nm大于2.0，ΔnanH：：oppAR在1.5左右，CF7066、ΔnanH免疫組在1.0左右（圖4B）?？梢姡anH：：oppAR免疫小鼠后能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生更多的OppA特異性抗體。

二免后一周（21d），每組取兩只小鼠，無菌分離小鼠脾淋巴細(xì)胞，用表達(dá)純化OppA蛋白刺激后，CF7066ΔnanH：：oppAR和CF7066免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖量顯著高于刺激前（P＜0.05），而ΔnanH、滅活疫苗組和PBS對(duì)照組幾乎沒有改變（圖4C）。上述結(jié)果表明，ΔnanH：：oppAR免疫小鼠后，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生OppA蛋白致敏的淋巴細(xì)胞。

2.4 過表達(dá)株ΔnanH：：oppAR對(duì)小鼠的免疫保護(hù)

小鼠在二免疫后2周（28d），用CF7066株以109 CFU·只-1的菌量進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。攻毒后小鼠精神萎頓、蜷縮、厭食。滅活疫苗免疫組小鼠在24 h時(shí)恢復(fù)正常，ΔnanH：：oppAR 和CF7066免疫組在48h時(shí)恢復(fù)正常，ΔnanH組有2只死亡，其余6只在48 h時(shí)恢復(fù)正常。PBS對(duì)照組有2只死亡，1只存活（表3）。

3 討 論

本研究使用GPS的無抗突變系統(tǒng)［9］，以GPS的血清5型分離株CF7066為親本株，構(gòu)建了3株過表達(dá)寡肽滲透酶的GPS菌株。其中，ΔnanH：：oppAR在體外培養(yǎng)能夠分泌最多量的OppA蛋白，免疫小鼠后產(chǎn)生了OppA蛋白特異性抗體和致敏脾的淋巴細(xì)胞，而且能夠?qū)γ庖咝∈筇峁┯行ПＷo(hù)。

OppA是一種存在于多種病原菌的位于周質(zhì)或外膜的脂蛋白，可分泌到細(xì)胞外，負(fù)責(zé)結(jié)合細(xì)菌所需要的肽并運(yùn)輸?shù)酵饽ぃ偻ㄟ^寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的外膜組分運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)［2］。OppA在副豬格拉瑟菌中的基因相對(duì)保守，免疫原性良好，使用其作為抗原的間接血凝抗體檢測(cè)方法可以對(duì)GPS所有血清型的抗體做檢測(cè)［10］。另外，在流感嗜血桿菌的研究中發(fā)現(xiàn)，OppA蛋白可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生很強(qiáng)的體液免疫，還可以刺激機(jī)體產(chǎn)生具有交叉保護(hù)的特異性細(xì)胞免疫［7］?？紤]到OppA蛋白免疫原性強(qiáng)，并能提供保護(hù)性的細(xì)胞免疫，所以選擇OppA蛋白作為GPS基因缺失疫苗的過表達(dá)抗原，以期能作為對(duì)多種血清型可產(chǎn)生交叉保護(hù)的副株格拉瑟菌基因工程減毒活疫苗。

為了實(shí)現(xiàn)OppA蛋白的過表達(dá)，起初使用組成型強(qiáng)啟動(dòng)子置換OppA的天然啟動(dòng)子，或者增加啟動(dòng)子拷貝實(shí)現(xiàn)過表達(dá)，但均未能成功。后來，決定構(gòu)建含有雙拷貝的菌株實(shí)現(xiàn)過表達(dá)。唾液酸酶NnaH是人上呼吸道病原菌肺炎鏈球菌的重要毒力因子，其在肺炎鏈球菌導(dǎo)致的敗血癥中發(fā)揮重要作用［11］。考慮到GPS引起仔豬的死亡都是發(fā)生于全身性感染后的敗血癥，所以推測(cè)NanH也很可能與GPS的毒力和致病性相關(guān)。另外，副豬格拉瑟菌的所有血清型菌株都可以表達(dá)唾液酸酶，既可獲取黏膜或漿膜表面的唾液酸作為營(yíng)養(yǎng)，也可將其用于細(xì)菌唾液酸化而實(shí)現(xiàn)免疫逃避［12-13］。因此，本研究將含有oppA啟動(dòng)子和編碼序列的片段重組出缺失了nanH的基因座，在增加oppA基因拷貝的同時(shí)也缺失了nanH基因，以期同時(shí)實(shí)現(xiàn)毒力的致弱和免疫原保護(hù)性的增強(qiáng)。

在小鼠免疫試驗(yàn)中，分別進(jìn)行了OppA的抗體檢測(cè)和淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，過表達(dá)株ΔnanH：：oppAR所產(chǎn)生的抗體水平比CF7066雖然略有上升，但差異并不顯著，而淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)中ΔnanH：：oppAR組小鼠的淋巴細(xì)胞增殖能力比滅活疫苗和ΔnanH免疫組小鼠的高（P＜0.05）。流感嗜血桿菌的研究表明，可對(duì)其不同血清型菌株提供交叉保護(hù)主要是源于特異性的Th17的細(xì)胞免疫而非體液免疫，而Th17細(xì)胞免疫主要是由在不同血清型和未分型菌株間保守的OppA蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生［7］。根據(jù)該研究結(jié)果，再考慮到GPS與流感嗜血桿菌在遺傳學(xué)和致病性上相似性高，由此推測(cè)，雖然ΔnanH：：oppAR在小鼠體內(nèi)刺激的OppA抗體水平上升雖然不明顯，但顯著增加的OppA蛋白特異的細(xì)胞免疫更有助于產(chǎn)生更廣泛的保護(hù)。接下來的攻毒試驗(yàn)也初步說明了這一點(diǎn)，CF7066和ΔnanH：：oppAR提供了100%的保護(hù)，而ΔnanH僅提供了85%的保護(hù)。

在本研究中，通過小鼠的免疫保護(hù)試驗(yàn)，對(duì)OppA過表達(dá)株ΔnanH：：oppAR的免疫保護(hù)性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，證明其可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)OppA蛋白特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫，并對(duì)小鼠提供有效的免疫保護(hù)。但是，由于副株格拉瑟菌的致病力較弱，對(duì)小鼠的免疫和攻毒菌量都較高，而且小鼠也不是格拉瑟病理想的動(dòng)物感染和攻毒模型，所以更應(yīng)該進(jìn)行仔豬的動(dòng)物試驗(yàn)，對(duì)其免疫保護(hù)性進(jìn)行更進(jìn)一步的評(píng)價(jià)。

4 結(jié) 論

1）構(gòu)建的3株過表達(dá)OppA蛋白的GPS菌株在體外分泌表達(dá)OppA的量顯著高于親本株。2）過表達(dá)株ΔnanH：：oppAR株誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的OppA特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫。3）過表達(dá)株ΔnanH：：oppAR免疫小鼠可能產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)。

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（編輯 白永平）