豬肺炎支原體強(qiáng)弱毒株的生物學(xué)特性及比較基因組學(xué)分析

摘 要：

旨在為更好地理解豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）強(qiáng)弱毒株在物質(zhì)代謝、毒力變化的差異，本研究基于Mhp強(qiáng)毒株ES-2株及其傳代致弱株ES-2L株，開展二者的生長(zhǎng)特性、黏附細(xì)胞能力、代謝產(chǎn)生過氧化氫水平、生物被膜形成能力等生物學(xué)特性及比較基因組學(xué)研究。在生長(zhǎng)特性方面，ES-2L株的生長(zhǎng)速度和滴度要高于ES-2株，其顏色改變單位（color change unit，CCU）為1.0×1010 CCU·mL-1，在培養(yǎng)基上具有更好的適應(yīng)性。在與毒力變化相關(guān)的特性方面，ES-2和ES-2L株均可以形成生物被膜，但ES-2L株的生物被膜形成能力要弱于ES-2株。ES-2L株代謝甘油產(chǎn)生過氧化氫的水平要低于ES-2株，且其對(duì)支氣管上皮細(xì)胞的黏附能力要弱于ES-2株。ES-2和ES-2L基因組共線性比對(duì)分析結(jié)果表明，二者的總體共線性良好，但ES-2L株存在幾處基因的缺失、倒位現(xiàn)象，對(duì)ES-2L株中的缺失基因進(jìn)行定位分析，共檢測(cè)到9個(gè)大片段（gt;500 bp）的基因缺失，這9個(gè)片段共包含18個(gè)缺失基因。SNP（單核苷酸多態(tài)性）和Indel（插入與缺失突變）分析表明，共檢測(cè)到348個(gè)SNVs（單核苷酸突變），這些SNVs主要分布于99個(gè)基因上，并且有22個(gè)dels（缺失突變）主要分布于19個(gè)基因上。基因島分析結(jié)果表明，ES-2L株在395～425 kb有一個(gè)基因島編碼序列，ES-2株在354～364、920～945 kb有兩個(gè)基因島編碼序列。這些缺失或發(fā)生SNP的基因、基因島的變化可能與ES-2L毒力下降及生長(zhǎng)特性改變有關(guān)。綜上，本研究闡明了Mhp強(qiáng)弱毒株在物質(zhì)代謝、毒力變化的差異，并采用比較基因組學(xué)的方法，分析了二者在基因水平的變化，為進(jìn)一步理解Mhp致病機(jī)制和毒力因子挖掘提供一種視角。

關(guān)鍵詞：

豬肺炎支原體；毒力；比較基因組學(xué)；生物被膜

中圖分類號(hào)：S852.62

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A """"文章編號(hào)： 0366-6964（2025）02-0851-09

收稿日期：2024-03-13

基金項(xiàng)目：河南省高等教育教學(xué)改革研究與實(shí)踐重大項(xiàng)目（2021SJGLX652）

作者簡(jiǎn)介：李真亞（1992-），男，河南鄲城人，講師，博士，主要從事動(dòng)物傳染病研究，E-mail：1906981786@qq.com

*通信作者：賈榮玲，主要從事動(dòng)物傳染病研究，E-mail：jrlplay@163.com

Biological Characteristics and Comparative Genomic Analysis of Virulent and Attenuated

Strains of Mycoplasma hyopneumoniae

LI" Zhenya1，2，3， LIU" Jie 1， LI" Yun1， WANG" Fei1， KONG" Yuanyuan1， LI" Yong1， JIA" Rongling1，2，3*

（1.Nanyang Agricultural Vocational College， Nanyang 473000，" China;

2.Henan Normal University，

Xinxiang 453007，" China;

3.Nanyang Key Laboratory of Animal Disease Prevention and Control， Nanyang 473000，" China）

Abstract：

In order to better understand the differences in material metabolism and virulence changes between virulent and attenuated strains of Mycoplasma hyopneumoniae （Mhp）， this study was based on the virulent strain ES-2 and the attenuated strain ES-2L induced by passaging of strain ES-2.The growth characteristics， cell adhesion ability， metabolic production of hydrogen peroxide level， biofilm formation ability and other biological characteristics and comparative genomics of the two strains were studied. In terms of growth characteristics， the growth rate and titer of ES-2L strain were higher than that of ES-2 strain， and its color change unit （CCU） was 1.0×1010 CCU·mL-1， which had better adaptability on medium. In terms of virulence changes， both ES-2 and ES-2L strains could form biofilm， but the biofilm formation capacity of ES-2L strain was weaker than that of ES-2 strain. The level of metabolizing glycerol to produce hydrogen peroxide of ES-2L strain was lower than that of ES-2 strain， and its adhesion ability to bronchial epithelial cells was weaker than that of ES-2 strain. The results of genome collinearity comparison between ES-2 and ES-2L showed that the overall collinearity of the two strains was good， but there were several gene deletion and inversion in ES-2L strains. The localization analysis of the deletion genes in ES-2L strains showed that a total of 9 large fragments （gt;500 bp） of gene deletion were detected， and these 9 fragments contained a total of 18 deletion genes. Analysis of SNP （single nucleotide polymorphism） and Indel （Insertion and deletion variation） showed that 348 SNVs （single nucleotide variations） were detected， which were mainly distributed in 99 genes， and 22 dels （deletion variations） were mainly distributed in 19 genes. The results of gene island analysis showed that ES-2L had a gene island coding sequence ranging from 395 to 425 kb， and ES-2 had two gene island coding sequences ranging from 354 to 364 kb， and 920 to 945 kb.These deletion or SNP genes and gene island changes may be related to the decrease of virulence and the change of growth characteristics of ES-2L. In summary， this study clarified the differences in material metabolism and virulence changes between virulent and attenuated strains of Mhp， and analyzed the changes of the two strains at the gene level by using comparative genomics method， providing a perspective for further understanding the pathogenic mechanism of Mhp and mining virulence factors.

Key words：

Mycoplasma hyopneumoniae; virulence; comparative genomics; biofilm

*Corresponding author：" JIA Rongling， E-mail：jrlplay@163.com

Mhp是支原體屬中的一個(gè)重要成員，其可以引起豬的地方性肺炎（enzootic pneumonia，EP）［1］。EP是一種慢性呼吸道疾病，各個(gè)年齡階段的豬都能夠被感染，臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽和氣喘、消瘦，導(dǎo)致豬生長(zhǎng)性能、飼料轉(zhuǎn)化率顯著降低［2-3］。在實(shí)際生產(chǎn)中，已經(jīng)感染Mhp的豬群更容易繼發(fā)感染細(xì)菌性病原體，同時(shí)在與其他病毒性病原體的混合感染下，引起豬呼吸道疾病綜合征，使臨床上豬的呼吸道疾病更加復(fù)雜多變，難于防治。Mhp自二十世紀(jì)六十年代首次被鑒定以來，目前已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛流行和傳播，嚴(yán)重危害著集約化養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展［4-5］。

Mhp的表面黏附因子和代謝產(chǎn)物與其致病性密切相關(guān)［6-7］。不像其他細(xì)菌性病原，Mhp沒有內(nèi)、外毒素這樣的毒力因子，其重要的毒力因子就是其表面的黏附蛋白。Mhp對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞的黏附在其定植侵入宿主中具有關(guān)鍵作用，Mhp感染豬后，細(xì)菌表面的黏附因子首先與豬呼吸道纖毛上皮細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合，造成纖毛大面積脫落，呼吸道黏膜屏障結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞，并且激發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)［8-9］。Mhp黏附宿主細(xì)胞的能力往往與其毒力強(qiáng)弱密切相關(guān)。代謝甘油產(chǎn)生H2O2是Mhp致病的一個(gè)重要機(jī)制。Ferrarini等［10］研究比較了無毒力J菌株和高毒力7488菌株在代謝甘油產(chǎn)生H2O2水平的差異。細(xì)菌生物被膜的形成是抵抗抗生素殺菌和宿主免疫反應(yīng)的一個(gè)重要機(jī)制，人的肺炎支原體可以通過釋放胞外DNA而形成生物被膜［11］。Raymond等［12］報(bào)道了Mhp可以在宿主細(xì)胞和無機(jī)質(zhì)玻璃上形成生物被膜，但Mhp強(qiáng)弱毒株形成生物被膜的差異還不清楚。三代測(cè)序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于基因組測(cè)序，比較基因組學(xué)方法也越來越多地被用來進(jìn)行微生物毒力基因的挖掘及病原與宿主互作機(jī)制的研究［13-14］。為了更好地理解Mhp強(qiáng)弱毒株在物質(zhì)代謝、毒力變化的差異，本研究基于Mhp強(qiáng)毒株ES-2株及其傳代致弱株ES-2L株，開展二者的生長(zhǎng)特性、黏附細(xì)胞能力、生物被膜形成能力等生物學(xué)特性及比較基因組學(xué)研究，為理解其致病機(jī)制和毒力因子挖掘提供一種視角。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

Mhp強(qiáng)毒ES-2株及其傳代致弱株ES-2L株來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑

豬血清購(gòu)自Gibco公司；PPLO肉湯粉、PPLO Agar均購(gòu)自Difco公司；腦心浸出物購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；水解乳蛋白、1%結(jié)晶紫溶液購(gòu)自Sigma公司；酵母浸出物購(gòu)自O(shè)xoid公司；酚紅、甘油、丙酮酸鈉、葡萄糖及配制Hanks’平衡鹽緩沖液所需試劑購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司；青霉素鈉、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Biosharp公司。過氧化氫檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；支原體全基因組提取試劑盒購(gòu)自Biomiga公司。

1.3 ES-2和ES-2L株生長(zhǎng)特性和菌體形態(tài)的比較

不同于常規(guī)細(xì)菌的計(jì)數(shù)方法，Mhp一般采取顏色變化單位（colour change unit，CCU）的方法來進(jìn)行計(jì)數(shù)，其原理是Mhp可以代謝葡萄糖產(chǎn)酸，從而可致培養(yǎng)基的pH發(fā)生變化，以培養(yǎng)基中的酚紅作為指示劑，便可間接測(cè)定培養(yǎng)物中的微生物含量，具體方法：將分離的Mhp菌液按1∶10的比例接種于改良Friis液體培養(yǎng)基，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)2～3 d，待培養(yǎng)基顏色變黃時(shí)，此時(shí)pH下降至6.8左右（處于對(duì)數(shù)期），準(zhǔn)備13個(gè)7 mL的無菌西林瓶，每個(gè)瓶中先加入1.8 mL的培養(yǎng)基，取長(zhǎng)至穩(wěn)定期的菌液200 μL，10倍倍比稀釋至1013，同時(shí)以未加入菌液的培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，放置37 ℃ 5% CO2中培養(yǎng)并觀察14 d，每天記錄培養(yǎng)基顏色變化情況。以第14天最后一個(gè)西林瓶中的培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化的稀釋倍數(shù)為最終判定結(jié)果。

將長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的 ES-2和ES-2L株菌液100 mL，6 000 ×g離心15 min，離心后棄掉上清，經(jīng)PBS洗滌3次后，收集菌體沉淀，沉淀用電鏡固定液于4 ℃固定24 h后，送武塞維爾生物科技有限公司進(jìn)行透射電鏡觀察。

1.4 生物被膜的檢測(cè)

2 mL ES-2和ES-2L株菌液分別在共聚焦培養(yǎng)皿上連續(xù)培養(yǎng)4～5代［15］，同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)基對(duì)照，每個(gè)菌株做3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)結(jié)束后，將菌液棄掉，用無菌PBS洗滌3次，然后加入1mL甲醛進(jìn)行固定10 min，棄去甲醛，再用PBS洗滌3次，拍干。加入1 mL 1%結(jié)晶紫染液，染色30 min，棄掉染色液，用PBS洗滌3次，拍干。最后于每個(gè)培養(yǎng)皿中加入1 mL無水乙醇，吹打培養(yǎng)皿底部4～5次，靜置10 min，取200 μL置于96孔板中，測(cè)定590 nm波長(zhǎng)吸光度，統(tǒng)計(jì)分析通過GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行，數(shù)據(jù)采用方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估，P值lt;0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*）。

1.5 H2O2水平的檢測(cè)

2 mL ES-2和ES-2L株菌液置于37 ℃ 5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)48～60 h至對(duì)數(shù)期，每個(gè)菌株做3個(gè)重復(fù)，同時(shí)做培養(yǎng)基對(duì)照。將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期菌液以4 000 ×g離心15 min，收獲菌體，PBS洗滌一次。然后用PBS重懸菌體。加入甘油至其終濃度為1 mmol·L-1，在37 ℃，5% CO2溫箱中孵育6 h，并進(jìn)行CCU測(cè)定。孵育結(jié)束后，取出100 μL液體，進(jìn)行過氧化氫水平檢測(cè)，具體檢測(cè)步驟參考試劑盒說明書，統(tǒng)計(jì)分析通過GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行，數(shù)據(jù)采用方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估，P值lt;0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*）。

1.6 細(xì)胞黏附能力的檢測(cè)

將豬氣管上皮細(xì)胞（STEC 細(xì)胞）接種于6孔板，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿50%時(shí)，用2 mL含2%胎牛血清的DMEM 維持液重懸Mhp菌株，然后接種于鋪細(xì)胞的孔，接種劑量均為1×108CCU。待Mhp 和STEC 細(xì)胞互作24h，棄培養(yǎng)液，PBS洗2 次。加入1 mL含0.5%胰蛋白酶消化液，在37℃培養(yǎng)箱消化2min，消化完成后，加入1 mL PBS吹打混懸細(xì)胞液，對(duì)混勻后的細(xì)胞懸液采用支原體全基因組提取試劑盒提取基因組（具體步驟參考試劑盒說明書），采用前期已經(jīng)建立的熒光定量PCR方法［16］，進(jìn)行細(xì)胞載菌量的檢測(cè)比較。數(shù)據(jù)采用方差分析，P值lt;0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*）。

1.7 ES-2與ES-2L株的比較基因組學(xué)分析

從NCBI上分別下載ES-2株（GenBank：CP038641.1），ES-2L株（GenBank：CP058578.1）全基因序列，運(yùn)用Mauve 2.3.1 genome alignment software對(duì)二者進(jìn)行共線性比對(duì)分析。用 GATK Haplotype Caller、FreeBayes和samtools mpileup三種軟件對(duì)ES-2和ES-2L株進(jìn)行SNP（單核苷酸多態(tài)性）和Indel（插入與缺失）變異分析。采IslandViewer 4軟件對(duì)ES-2L和ES-2株進(jìn)行基因島結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié) 果

2.1 ES-2和ES-2L株生長(zhǎng)特性和菌體形態(tài)的比較

CCU測(cè)定結(jié)果顯示，相比于ES-2株，ES-2L株在培養(yǎng)的第24小時(shí)開始變色，在第48小時(shí)即可達(dá)到生長(zhǎng)的最高峰，其CCU為1.0×1010 CCU·mL-1。ES-2株在培養(yǎng)的第36小時(shí)開始變色，在第72小時(shí)達(dá)到生長(zhǎng)的最高峰，其CCU為1.0×108CCU·mL-1。透射電鏡結(jié)果顯示，ES-2L株和ES-2株菌體形態(tài)基本相似，都呈圓形或橢圓形，且細(xì)胞大小不等，無細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)含有多種胞質(zhì)顆粒。相比于ES-2株，ES-2L株存在少許大細(xì)胞突變體，見圖1。這些大細(xì)胞突變體利用代謝營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力強(qiáng)于正常細(xì)胞體，推測(cè)這可能與ES-2L株在培養(yǎng)基中具有更好的適應(yīng)性有關(guān)。

2.2 生物被膜的檢測(cè)

生物被膜的形成與細(xì)菌毒力密切相關(guān)，結(jié)果顯示，ES-2和ES-2L株均可以形成生物被膜，二者的OD590 nm吸光值相比于培養(yǎng)基對(duì)照組均具有顯著差異；并且相比于ES-2株，ES-2L株的生物被膜形成能力要弱于ES-2株，二者具有顯著差異（圖2）。

2.3 H2O2水平的檢測(cè)

H2O2水平檢測(cè)結(jié)果顯示，在甘油存在的情況下，相比于ES-2株，ES-2L株產(chǎn)生過氧化氫的水平要低于ES-2株，二者具有顯著差異（圖3）。這說明Mhp菌株毒力的強(qiáng)弱與其代謝產(chǎn)生的H2O2水平具有相關(guān)性。

2.4 細(xì)胞黏附能力的檢測(cè)

利用qPCR方法分別檢測(cè)ES-2ES-2L感染STEC細(xì)胞后的菌體載量，ES-2組平均菌體載量為1×106.17copy·mL-1；ES-2L組平均菌體載量為1×104.73copy·mL-1，二者有顯著差異（P＜0.05），詳見圖4。表明ES-2L株對(duì)STEC細(xì)胞的黏附能力弱于ES-2株。

2.5 ES-2和ES-2L共線性比對(duì)分析

ES-2L株相比于ES-2株，二者的總體共線性良好，但存在幾處基因缺失、倒位現(xiàn)象（圖5）。進(jìn)一步地對(duì)ES-2L株中的缺失基因進(jìn)行定位分析，共檢測(cè)到9個(gè)大片段（gt;500 bp）的基因缺失，這9個(gè)片段共包含18個(gè)缺失基因（表1）。

2.6 SNP和Indel變異分析

SNP和Indel分析顯示，共檢測(cè)到348個(gè)SNVs，這些SNVs主要分布于99個(gè)基因上。并且有22個(gè)dels主要分布于19個(gè)基因上。這些缺失或SNVs的基因，會(huì)影響基因功能的表達(dá)，這可能跟ES-2L株毒力下降及生長(zhǎng)特性的改變有關(guān)。

2.7 基因島分析

IslandViewer 4分析結(jié)果顯示，ES-2L株在395～425 kb有1個(gè)基因島編碼序列，ES-2株在354 ～364、920～945 kb有2個(gè)基因島編碼序列（圖6）。

3 討 論

ES-2L株由ES-2株通過連續(xù)體外傳代致弱而來［15-17］，在二者的生長(zhǎng)特性方面，CCU生長(zhǎng)曲線結(jié)果說明：相比于ES-2株，ES-2L生長(zhǎng)速度更快且生長(zhǎng)滴度更高，ES-2L株對(duì)培養(yǎng)基具有更好的適應(yīng)性。此外，少數(shù)ES-2L株菌體細(xì)胞發(fā)生變化產(chǎn)生大細(xì)胞突變體，這些大細(xì)胞突變體對(duì)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝能力更強(qiáng)，與典型的菌體形態(tài)相比，這些大細(xì)胞突變包含更多的DNA，推測(cè)這可能與ES-2L株在培養(yǎng)基中具有更好的適應(yīng)性有關(guān)，但也有可能與生物被膜的形成有關(guān)［18］。生物被膜的形成與細(xì)菌毒力密切相關(guān)，Tassew等［19］報(bào)道指出Mhp可以在非生物表面和呼吸道單層上皮細(xì)胞表面形成生物被膜，生物被膜參與了Mhp的抗生素抵抗，增強(qiáng)了其體外生存能力，但關(guān)于Mhp生物被膜的形成機(jī)制還未闡明。有研究指出，在生物被膜形成的過程中，會(huì)出現(xiàn)一種不穩(wěn)定的大細(xì)胞突變體，其包含更多的DNA，裂解釋放的DNA是形成生物被膜所必須的［12］。目前，還沒有關(guān)于Mhp強(qiáng)弱毒株之間生物被膜形成能力的其他研究，本研究為理解生物被膜的形成及其所扮演的毒力重要性提供了一個(gè)新的視角。ES-2L弱毒株代謝甘油產(chǎn)生過氧化氫的水平和生物被膜形成能力都要低于ES-2株。Ferrarini等［10］研究比較了Mhp強(qiáng)毒株7488株，弱毒J株在代謝甘油產(chǎn)生過氧化氫的水平的差異：強(qiáng)毒株7488株產(chǎn)生過氧化氫的水平要遠(yuǎn)高于弱毒J株。Rasheed等［20］研究也表明牛支原體與其傳代致弱株在產(chǎn)生過氧化氫水平能力上具有顯著差異，這與本研究結(jié)果是一致的。黏附定植宿主細(xì)胞是Mhp入侵細(xì)胞的第一步，對(duì)宿主細(xì)胞的黏附能力大小，往往與其毒力密切相關(guān)，ES-2L黏附能力的下降，可能與相關(guān)黏附基因缺失或黏附蛋白表達(dá)量下降有關(guān)［17］。

ES-2L和ES-2株全基因組大小分別為918 900、956 514 bp，相比于ES-2，其少了 37 614 bp。在連續(xù)傳達(dá)的過程中，基因的缺失是經(jīng)常發(fā)生的。Rasheed等［20］研究報(bào)道，牛支原體HB0801株在連續(xù)體外傳代時(shí)，發(fā)生了一個(gè)14.2 kb大小的基因片段的缺失。ES-2L和ES-2株比較基因組學(xué)結(jié)果表明，相比于ES-2，ES-2L株有3個(gè)大的基因片段缺失，這些片段包含18個(gè)基因，遺憾的是，這些基因的功能大都是未知的，還需要進(jìn)一步研究。其中的1個(gè)缺失基因E5E95_01860，編碼乙醇脫氫酶 （AdhE），是乙醇厭氧發(fā)酵途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，調(diào)節(jié)細(xì)菌中乙醇的產(chǎn)生［21-22］。在氧缺乏條件下，AdhE的缺失能夠減少乙醇的合成，進(jìn)而減少過氧化氫的產(chǎn)生，而過氧化氫被認(rèn)為與支原體毒力密切相關(guān)［23-24］。Liu等［14］進(jìn)行了168株及其弱毒株168L之間的共線性分析，其二者之間也存在基因大片段的缺失、倒位等基因重排現(xiàn)象。這些結(jié)構(gòu)變化的基因應(yīng)當(dāng)是以后人們重點(diǎn)關(guān)注和研究的基因。基因島被認(rèn)為與基因間的水平轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，目前的研究表明，基因島上編碼的基因主要與微生物的毒力、致病性、代謝和抗生素抵抗等相關(guān)［25-26］。ES-2L和ES-2株的基因島結(jié)構(gòu)分析表明，ES-2株有2個(gè)基因島編碼序列。在ES-2株的2個(gè)基因島中，其中一個(gè)基因島位于920 852～943 294 bp位點(diǎn)，其編碼10個(gè)基因。其中的2個(gè)基因E5E95_03750和E5E95_03795分別編碼LppA 家族脂蛋白和轉(zhuǎn)錄延伸因子GreA，其他的研究已指出，Mhp表面的LppA家族脂蛋白和轉(zhuǎn)錄延伸因子在Mhp黏附和入侵宿主細(xì)胞中起重要作用［27-29］。因此，作者推測(cè)，基因島上的編碼基因可能與ES-2毒力和生長(zhǎng)特性的改變有直接關(guān)系。SNP分析結(jié)果表明，ES-2L株存在348個(gè) SNVs，這些 SNVs主要分布于99個(gè)基因上并可能影響了這些基因的功能。其中1個(gè)基因E5E95_00610被NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)注釋為一個(gè)黏附素蛋白基因，該基因在傳代過程中經(jīng)歷了兩處非同義基因突變（C-G和C-T），這些核苷酸突變可能影響了其正常黏附功能的發(fā)揮。Liu等［14］通過對(duì)Mhp菌株168和168L的比較基因組學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)168L有大量的SNVs，而這些 SNVs影響了一些重要黏附素基因的功能表達(dá)，例如 P97、P102、P46和P65等。在本研究中，由于缺乏成熟的基因操作平臺(tái)，Mhp蛋白體外表達(dá)的困難［30-31］，目前在技術(shù)上還不能通過構(gòu)建基因缺失株的方法來證實(shí)Mhp強(qiáng)弱毒株之間這些缺失基因的功能。但隨著相關(guān)技術(shù)的成熟及研究的不斷深入，人們對(duì)這些基因功能的認(rèn)識(shí)也會(huì)越來越清晰。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)Mhp強(qiáng)毒株ES-2株和弱毒株ES-2L株進(jìn)行生物學(xué)特性及比較基因組學(xué)析。結(jié)果表明ES-2和ES-2L株均可以形成生物被膜，ES-2L株的生物被膜形成能力要弱于ES-2株。ES-2L株代謝甘油產(chǎn)生過氧化氫的水平要低于ES-2株，且其對(duì)支氣管上皮細(xì)胞的黏附能力要弱于ES-2株。比較基因組學(xué)結(jié)果表明，相對(duì)于ES-2，ES-2L共計(jì)存在9個(gè)大片段，18個(gè)基因的缺失。348個(gè)SNVs和22個(gè)Indel主要分布于ES-2L的118個(gè)基因中，而這些缺失或變異的基因可能與ES-2L株的毒力下降及生長(zhǎng)特性改變有關(guān)。本研究為進(jìn)一步理解Mhp致病機(jī)制和毒力因子挖掘提供一種視角。

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（編輯 白永平）