豬流行性腹瀉病毒S1蛋白的原核表達(dá)及其核酸適配體的篩選

摘 要：

本文旨在可溶性原核表達(dá)豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）S1蛋白的C端結(jié)合域（S1-CTD），并利用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選靶向S1-CTD蛋白的DNA適配體，為該病毒治療藥物的開發(fā)以及檢測(cè)方法的建立奠定基礎(chǔ)。采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，將PEDV-S1-CTD質(zhì)粒與帶有麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）、小分子泛素樣修飾蛋白（SUMO）、反轉(zhuǎn)錄終止因子（NusA）、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）四種促溶標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pET21b連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET21b-MBP-S1、pET21b-SUMO-S1、pET21b-NusA-S1、pET21b-GST-S1，將雙酶切鑒定和測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，選擇可溶性好且表達(dá)量高的rMBP-S1重組蛋白進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，Western blot結(jié)果顯示該重組蛋白正確表達(dá)，間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）結(jié)果表明rMBP-S1能與細(xì)胞表面受體結(jié)合。隨后經(jīng)磁珠法篩選得到111條靶向rMBP-S1重組蛋白的候選DNA適配體，其中Apt-S1-3、Apt-S1-11富集程度最高，分別是18%和16.2%，酶聯(lián)適配體吸附試驗(yàn)ELASA（enzyme-linked aptamer sorbent assays，ELASA）測(cè)定適配體Apt-S1-3的解離常數(shù)為2.09 nmol，并且該適配體不與rMBP蛋白、rMBP-gD蛋白、rMBP-GP5蛋白以及BSA蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，表明該適配體具有高親和力與高特異性。此外，使用在線軟件Mfold分析適配體Apt-S1-3形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并且通過分子對(duì)接模擬，發(fā)現(xiàn)該適配體能夠與靶標(biāo)蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物。最后的間接免疫熒光試驗(yàn)表明適配體Apt-S1-3能夠識(shí)別PEDV，流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)證實(shí)該適配體能夠抑制PEDV感染宿主細(xì)胞。本研究篩選得到的DNA適配體能夠與豬流行性腹瀉病毒S1-CTD蛋白高親和力、高特異性結(jié)合，而且能夠抑制豬流行性腹瀉病毒感染細(xì)胞，為PEDV的靶向治療和檢測(cè)方法開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：

豬流行性腹瀉病毒；S1-CTD蛋白；磁珠法；核酸適配體；親和力

中圖分類號(hào)：S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A """"文章編號(hào)： 0366-6964（2025）02-0839-12

收稿日期：2024-03-13

基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)（242102110019）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31972672）

作者簡(jiǎn)介：張冬萱（1999-），女，河南三門峽人，主要從事動(dòng)物生物技術(shù)研究，E-mail 15138163667@163.com

*通信作者：張 超，主要從事動(dòng)物生物技術(shù)研究，E-mail：chaozhang@henau.edu.cn

Prokaryotic Expression of S1 Protein in Porcine Epidemic Diarrhea Virus and Screening of Its Aptamers

ZHANG" Dongxuan， WANG" Zhihao， QIAO" Yan， ZHAO" Xiaoxiao， FAN" Songjie， ZHANG" Chao*

（Key Laboratory of Animal Biochemistry and Nutrition， Ministry of Agriculture and Rural Affairs，

College of Veterinary Medicine， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450046，" China）

Abstract：

This study aimed to express the C-terminal binding domain （S1-CTD） of the porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） S1 protein in a soluble prokaryotic system and to screen DNA aptamers targeting S1-CTD using the systematic evolution of ligands by exponential enrichment （SELEX） technique， laying the foundation for the development of therapeutic drugs and detection methods for the PEDV. The PEDV-S1-CTD plasmid was cloned into prokaryotic expression vectors containing maltose-binding protein （MBP）， small ubiquitin-like modifier （SUMO）， transcription termination factor （NusA）， and glutathione S-transferase （GST） tags. Recombinant plasmids pET21b-MBP-S1， pET21b-SUMO-S1， pET21b-NusA-S1， and pET21b-GST-S1 were constructed and transformed into E. coli BL21 for expression. The rMBP-S1 recombinant protein with good solubility and high expression was selected for further experiments. Western blot and indirect immunofluorescence assay （IFA） confirmed the correct expression and receptor binding of the protein. Aptamer Apt-S1-3 and Apt-S1-11 were enriched with the highest affinity （18% and 16.2%， respectively） and specificity， respectively. ELASA determined a dissociation constant of 2.09 nmol for Apt-S1-3， which showed no cross-reactivity with rMBP， rMBP-gD， rMBP-GP5， or BSA proteins. Mfold analysis and molecular docking simulations revealed the aptamer’s ability to form stable complexes with the target protein. IFA and flow cytometry confirmed the aptamer’s recognition and inhibition of PEDV infection. This study successfully screened a DNA aptamer that binds to the PEDV S1-CTD protein with high affinity and specificity， inhibiting virus infection and providing a foundation for targeted therapy and detection methods for PEDV.

Key words：

porcine epidemic diarrhea virus; S1-CTD protein; magnetic bead method; aptamer; affinity

*Corresponding author：" ZHANG Chao， E-mail： chaozhang@henau.edu.cn

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea， PED），是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）引起的豬腸道傳染性疾病［1］，自20世紀(jì)90年代以來一直在世界范圍內(nèi)流行，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)，特別是仔豬養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2-3］。目前無論是滅活疫苗還是減毒疫苗，都不能對(duì)當(dāng)前流行的PEDV變異毒株提供足夠的保護(hù)［4-5］，早期診斷并加以防治是減少損失的方法。PEDV是一種具有囊膜的正股單鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科（Coronaviridae），α-冠狀病毒屬（Alphacoronavirus），基因組大小約28 kb，編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白，即刺突（S）、包膜（E）、膜（M）和核衣殼（N）蛋白；16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（nsp1-nsp16）和輔助蛋白ORF3［6］。

S蛋白介導(dǎo)病毒進(jìn)入靶細(xì)胞［7］，并在組織和細(xì)胞嗜性中起主要作用［8］，并且S基因的突變通常與病毒嗜性改變和病毒毒力變化相關(guān)，是影響病毒跨物種傳播的潛在危險(xiǎn)因素［9］。PEDV通過兩種方式進(jìn)入靶細(xì)胞：病毒粒子與質(zhì)膜融合后直接進(jìn)入［10-11］以及受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，隨后病毒膜與內(nèi)核體融合［12］。S蛋白包括S1亞基和S2亞基［13］，S1介導(dǎo)病毒與細(xì)胞受體結(jié)合，包括C端結(jié)合域（S1-CTD）和N端結(jié)合域（S1-NTD）兩個(gè)亞基，S1-CTD能識(shí)別病毒受體充當(dāng)主要的受體結(jié)合域，S1-NTD能識(shí)別多糖作為其潛在受體［14］，S2介導(dǎo)膜融合的過程。S蛋白通過和宿主蛋白相互作用在病毒入侵和感染過程中發(fā)揮重要作用［15］。綜合S1-CTD在病毒受體識(shí)別過程中的重要作用，以及能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體，本研究以PEDV的S1-CTD蛋白為研究對(duì)象開展后續(xù)研究。

核酸適配體是基于指數(shù)富集配體進(jìn)化技術(shù)（SELEX）從人工合成的寡核苷酸文庫(kù)中篩選出與靶標(biāo)高特異性、高親和力結(jié)合的單鏈DNA或者RNA，也被稱為“化學(xué)抗體”，與傳統(tǒng)蛋白抗體相似，核酸適配體能與靶標(biāo)高特異性、高親和力結(jié)合，并且核酸適配體容易人工合成和修飾，且可以常溫儲(chǔ)存，因此在病毒檢測(cè)和抗病毒治療中具有廣闊的應(yīng)用前景［16］。

本試驗(yàn)通過添加促溶標(biāo)簽，實(shí)現(xiàn)了PEDV-S1-CTD蛋白的可溶性原核表達(dá)，并且純化得到純度高、具有生物活性的重組S1-CTD蛋白。經(jīng)磁珠法篩選得到靶向S1-CTD蛋白的111條DNA適配體，ELASA（enzyme-linked aptamer sorbent assays， ELASA）測(cè)定發(fā)現(xiàn)Apt-S1-3不僅能夠與S1-CTD蛋白高特異性、高親和力結(jié)合，而且能夠識(shí)別、結(jié)合病毒粒子進(jìn)而影響PEDV感染細(xì)胞。該適配體為抗病毒藥物研發(fā)以及PEDV檢測(cè)方法的建立打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

Ni-NTA親和層析填料購(gòu)自GenScript公司；Ni磁珠購(gòu)自金斯瑞生物公司；鏈霉親和素糖珠購(gòu)自Merck生物公司；TOP10感受態(tài)細(xì)胞由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生化與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；BL21感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于TOLOBIO；BCA試劑盒購(gòu)自鼎國(guó)生物公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、瓊脂糖和HRP標(biāo)記的鏈霉親和素二抗購(gòu)自生工生物公司；T4連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司；PVDF轉(zhuǎn)印膜和ECL化學(xué)發(fā)光顯色液購(gòu)自millipore公司；細(xì)胞膜紅色熒光染色試劑盒（Dil）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；CoraLite 488-Conjuggated Goat Anti-Mouse IgG（H+L）購(gòu)自三鷹生物技術(shù)有限公司；初始寡核苷酸隨機(jī)文庫(kù)、普通引物以及上游FAM標(biāo)記和下游Biotin標(biāo)記引物由金斯瑞生物公司合成，序列見表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 載體構(gòu)建

參考NCBI上PEDV毒株（NC_003436.1： 20638-24789）的S1基因序列，將S1-CTD區(qū)域的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，并在序列兩端引入酶切位點(diǎn)BamH Ⅰ和Xho Ⅰ，該序列由南京金斯瑞公司合成。將合成的PEDV-S1-CTD甘油菌接于含氨芐抗性的液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，收集菌體沉淀，使用小提質(zhì)粒試劑盒進(jìn)行提取，限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ分別酶切PEDV-S1-CTD質(zhì)粒與pET21b-MBP、pET21b-GST、pET21b-SUMO、pET21b-NusA載體質(zhì)粒，對(duì)預(yù)期位置處條帶進(jìn)行切膠回收，回收純化的目的基因與帶不同標(biāo)簽的載體通過T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10感受態(tài)中，通過雙酶切和測(cè)序進(jìn)行重組質(zhì)粒的鑒定，將測(cè)序正確的質(zhì)粒分別命名為pET21b-MBP-S1、pET21b-GST-S1、pET21b-SUMO-S1、pET21b-NusA-S1。

1.2.2 重組蛋白可溶性檢測(cè)

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)中，涂板挑菌，接種于100 mL氨芐抗性液體培養(yǎng)基中擴(kuò)培，在OD值0.4時(shí)加入終濃度0.1 mmol·L-1 IPTG，18℃，200 r·min-1誘導(dǎo)過夜。誘導(dǎo)結(jié)束后收集菌體沉淀，加入9 mL含有5 mmol·L-1咪唑的LE Buffer，1 mL甘油（10%）和20 μL PMSF重懸，冰浴超聲破碎完全后，4℃高速離心分離上清沉淀，上清沉淀分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定可溶性，綜合考慮后選擇pET21b-MBP-S1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，后文簡(jiǎn)稱為rMBP-S1。

1.2.3 純化目的蛋白 "用Ni-NTA親和層析法純化重組蛋白rMBP-S1。吸取2 mL混勻介質(zhì)加入重力柱自由沉降，取10倍柱體積的LE Buffer平衡柱子兩次，10倍柱體積含5 mmol·L-1咪唑的LE Buffer平衡柱子兩次，過濾后上清重復(fù)上樣三次，20倍柱體積洗滌緩沖液洗去雜蛋白，20倍柱體積洗脫緩沖液洗脫目的蛋白并收集洗脫液，取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。洗脫液用50 ku超濾管進(jìn)行超濾濃縮，4℃離心時(shí)不宜使用過大轉(zhuǎn)速，以免損壞超濾管，4 000 r·min-1超濾20 min后根據(jù)所剩洗脫液體積加入適量透析液多次離心稀釋咪唑，將得到的目的蛋白使用BSA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，分裝后保存至-80 ℃冰箱。

1.2.4 驗(yàn)證目的蛋白

利用蛋白免疫印跡法（WB）檢測(cè)目的蛋白。取變性后的蛋白樣品進(jìn)行10%的SDS-PAGE電泳，電泳后通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF膜上，5%脫脂奶封閉1 h，以鼠抗MBP的單抗（1∶1 000）作為一抗4℃過夜孵育。HRP標(biāo)記山羊抗小鼠單抗（1∶5 000）作為二抗室溫震蕩孵育1 h，洗膜四次后采用Thermo的ECL顯色試劑盒進(jìn)行顯色，并且用多功能成像儀記錄結(jié)果。

1.2.5 檢測(cè)蛋白活性

間接免疫熒光檢測(cè)蛋白活性，將細(xì)胞種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板并在底部放入細(xì)胞爬片，細(xì)胞長(zhǎng)至50%左右，取含終濃度為10 μmol·L-1的rMBP-S1蛋白、rMBP蛋白的DMEM置于4℃分別孵育1 h，并設(shè)置空白對(duì)照，然后使用細(xì)胞膜染色試劑Dil處理細(xì)胞，固定封閉，以鼠源抗MBP蛋白單克隆抗體作為一抗，CoraLite 488-Conjuggated Goat Anti-Mouse IgG（H+L）作為二抗，進(jìn)行IFA試驗(yàn)，DAPI染核后制片，用共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.2.6 S1蛋白適配體篩選

將適量重組rMBP-S1蛋白與Ni磁珠置于4℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜，取5 nmol隨機(jī)文庫(kù)加500 μL結(jié)合緩沖液（含0.55 mmol·L-1 MgCl2的PBS），95℃ 5 min，立即冰上10 min，室溫靜置10 min，處理后的文庫(kù)與過夜結(jié)合的S1-磁珠室溫孵育，孵育結(jié)束后Wash Buffer清洗磁珠，隨后加入200 μL DEPC水，95℃ 5 min后收集上清得到能與靶標(biāo)蛋白結(jié)合的隨機(jī)序列，優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件，在最優(yōu)條件下使用FAM標(biāo)記上游引物和Biotin標(biāo)記下游引物進(jìn)行大量擴(kuò)增用于制備次級(jí)ssDNA文庫(kù)。

1.2.7 ssDNA次級(jí)文庫(kù)制備

取適量混勻鏈霉親和素糖珠加PBS洗兩次，與擴(kuò)增產(chǎn)物室溫旋轉(zhuǎn)孵育90 min。PBS潤(rùn)洗空芯柱，將孵育后的擴(kuò)增產(chǎn)物-糖珠過柱，PBS清洗糖珠，隨后加入0.1 mol·L-1 NaOH室溫堿變性5 min后收集，可適當(dāng)重復(fù)幾次收集流穿液得到FAM-ssDNA，使用酚-氯仿抽提，乙醇共沉淀方法回收純化FAM-ssDNA用于下一輪篩選。篩選過程中為了得到高親和力、高特異性的序列，從第四輪正篩選前添加MBP蛋白進(jìn)行負(fù)篩選，并在篩選過程中逐漸增加負(fù)篩選蛋白用量及孵育時(shí)間，減少正篩蛋白用量及孵育時(shí)間，增加洗滌次數(shù)及用量和時(shí)間，以此增加篩選壓力。

1.2.8 篩選進(jìn)程的驗(yàn)證

PCR產(chǎn)物的熔鏈溫度取決于其內(nèi)部結(jié)構(gòu)和雙鏈體穩(wěn)定性，文庫(kù)在PCR過程中會(huì)形成異源雙鏈和同源雙鏈，其比例取決于序列的多樣性，隨著篩選的進(jìn)行，與靶標(biāo)結(jié)合的ssDNA不斷富集，次級(jí)文庫(kù)的序列多樣性下降，PCR過程中會(huì)形成更多較穩(wěn)定的同源雙鏈，熔鏈溫度隨之上升，使用qPCR監(jiān)測(cè)文庫(kù)的復(fù)雜程度。挑選3、7、11、15輪文庫(kù)為模板并用隨機(jī)文庫(kù)作為對(duì)照組進(jìn)行qPCR。使用流式細(xì)胞數(shù)監(jiān)測(cè)富集情況，選擇第3、7、11、15輪FAM標(biāo)記的ssDNA文庫(kù)加500 μL結(jié)合緩沖液（含0.55 mmol·L-1 MgCl2的PBS），95℃ 5 min，立即冰上10 min，室溫靜置10 min處理后與靶蛋白或負(fù)篩蛋白磁珠室溫孵育1 h，棄去孵育液，結(jié)合緩沖液洗3次后各加500 μL結(jié)合緩沖液重懸，使用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)1 000個(gè)事件來確定熒光強(qiáng)度，隨機(jī)文庫(kù)與第15輪文庫(kù)孵育作為陰性對(duì)照。

1.2.9 克隆與測(cè)序

將最后一輪篩選得到的ssDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，3%瓊脂糖核酸膠80 V電泳40 min，得到預(yù)期80 bp的條帶，膠回收目的條帶，連接pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化于DH5α，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布于含氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落培養(yǎng)，隨后進(jìn)行菌液PCR鑒定，將菌液鑒定正確的送往擎科生物公司測(cè)序。

1.2.10 候選適配體親和力及特異性測(cè)定

使用磷酸鹽緩沖液將重組rMBP-S1蛋白稀釋至10 ng·μL-1，4℃包被過夜，不同濃度生物素標(biāo)記的候選適配體（800、400、200、100、50、25、12.5、6.75、3.125、0 nmol·L-1）為一抗，HRP-SA（1∶10 000稀釋）為二抗，檢測(cè)適配體對(duì)重組蛋白的親和力，每組3個(gè)重復(fù)，特異性檢測(cè)使用磷酸鹽緩沖液將重組rMBP-S1蛋白、rMBP蛋白、rMBP-gD蛋白、rMBP-GP5蛋白、BSA蛋白稀釋至10 ng·μL-1，4℃包被過夜，分別加入終濃度為200 nmol·L-1生物素標(biāo)記的候選適配體，以HRP-SA（1∶10 000稀釋）為二抗，檢測(cè)候選適配體的特異性。

1.2.11 候選適配體二級(jí)結(jié)構(gòu)分析及其與靶標(biāo)蛋白的分子對(duì)接

將篩選出的候選適配體使用在線軟件Mfold（http：//www.unafold.org/）分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)，隨后通過在線網(wǎng)站3dRNA/DNA分析該適配體的三級(jí)結(jié)構(gòu)，最后將其與SWISS MODEL同源建模的靶標(biāo)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，模擬出適配體與靶蛋白形成的穩(wěn)定復(fù)合物，并分析參與復(fù)合物形成的可能結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.12 間接免疫熒光驗(yàn)證適配體對(duì)病毒的識(shí)別

提前將細(xì)胞種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板并在底部放入細(xì)胞爬片，次日，對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，加入MOI為0.05的PEDV-HW病毒液，4℃吸附1 h，設(shè)置未加病毒作為對(duì)照組，隨后與終濃度為500 nmol·L-1的適配體Apt-S1-3-FAM室溫孵育1 h，固定、通透、封閉后，以PEDV S蛋白抗體為一抗，Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG（H+L）作為二抗進(jìn)行IFA試驗(yàn)。

1.2.13 流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證適配體對(duì)病毒感染的影響

提前將細(xì)胞種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜，次日，對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算MOI為0.05時(shí)每孔應(yīng)加入的PEDV-GFP病毒量。隨后配制終濃度為0、500、1 000、1 500 nmol·L-1的適配體Apt-S1-3各200 μL，對(duì)應(yīng)濃度隨機(jī)文庫(kù)各200 μL為對(duì)照組，將處理后的試驗(yàn)組和對(duì)照組與PEDV-GFP病毒液體外旋轉(zhuǎn)孵育，將病毒-適配體混合物與細(xì)胞室溫孵育，隨后加1%FBS-DMEM維持液培養(yǎng)過夜，第二天熒光顯微鏡觀察病毒感染情況，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，分析適配體對(duì)病毒感染的影響。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒酶切鑒定

為了驗(yàn)證連四個(gè)不同標(biāo)簽重組質(zhì)粒pET21b-MBP-S1、pET21b-NusA-S1、pET21b-GST-S1、pET21b-SUMO-S1是否構(gòu)建成功，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1，酶切得到片段1 170 bp目的基因片段（紅色箭頭），與預(yù)期結(jié)果相符。進(jìn)一步的測(cè)序結(jié)果表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 重組蛋白的原核表達(dá)及可溶性分析

為了鑒定重組蛋白表達(dá)情況，分別取誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后、超聲后上清、超聲后沉淀的蛋白樣品進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒pET21b-SUMO-S1和pET21b-GST-S1表達(dá)的重組蛋白主要以包涵體形式存在，上清中含量不多，與之不同的是，重組質(zhì)粒pET21b-MBP-S1與pET21b-NusA-S1的重組蛋白主要以可溶形式在上清中存在，而且MBP-S1的純度要高于NusA-S1（圖2A、B，泳道3）。因此本研究以pET21b-MBP-S1進(jìn)行后續(xù)的蛋白純化和研究，后續(xù)試驗(yàn)中簡(jiǎn)稱為rMBP-S1蛋白。

2.3 目的蛋白的純化及蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)

使用Ni-NTA親和層析法純化目的蛋白，將重組質(zhì)粒pET21b-MBP-S1轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21細(xì)胞，用0.1 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)后，收集細(xì)胞超聲破碎，將破碎取樣進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳分析?？捡R斯亮藍(lán)染色，脫色液脫色后結(jié)果如圖3A所示（紅色方框標(biāo)識(shí)），得到目的蛋白大小與預(yù)期一致，且未見明顯雜蛋白，BCA試劑盒測(cè)定該蛋白濃度為1.2 mg·mL -1。隨后，為了檢測(cè)rMBP-S1蛋白是否正確表達(dá)，以抗MBP抗體為一抗進(jìn)行Western blot 鑒定，結(jié)果顯示，rMBP-S1蛋白和rMBP蛋白分別在75 ku和45 ku附近顯色，如圖3B，與預(yù)期大小一致，進(jìn)一步表明成功得到重組rMBP-S1蛋白。

2.4 免疫熒光鑒定重組蛋白的生物活性

為了鑒定rMBP-S1蛋白的生物學(xué)活性，將rMBP-S1、rMBP蛋白與細(xì)胞4℃吸附1 h，Dil染膜，以抗MBP抗體為一抗進(jìn)行IFA試驗(yàn)。結(jié)果證實(shí)，純化后的重組蛋白rMBP-S1可結(jié)合在細(xì)胞的膜表面（黃色顯示），而對(duì)照組MBP蛋白及空白對(duì)照組細(xì)胞膜均未見綠色熒光（如圖4），只有顯示細(xì)胞膜的紅色熒光。該結(jié)果表明該重組蛋白rMBP-S1具有生物活性，能與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合，可用于后續(xù)研究。

2.5 靶向S1蛋白適配體篩選過程中的循環(huán)數(shù)優(yōu)化

本文通過磁珠法篩選核酸適配體，為提高后續(xù)篩選過中PCR的擴(kuò)增效率，確保PCR反應(yīng)的高效性和特異性，提高適配體篩選的準(zhǔn)確性和可靠性，我們對(duì)篩選過程中的PCR循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。通過調(diào)整每輪擴(kuò)增條件，得到特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，各輪最優(yōu)循環(huán)數(shù)如表2。

2.6 篩選進(jìn)程的監(jiān)測(cè)

為了監(jiān)測(cè)篩選進(jìn)程，采用qPCR和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)第3（淺綠色）、7（橙色）、11（藍(lán)色）、15（紅色）輪DNA文庫(kù)的復(fù)雜程度及結(jié)合能力進(jìn)行分析，qPCR結(jié)果顯示隨著篩選進(jìn)行，熔鏈溫度逐漸上升并穩(wěn)定在86℃（圖5A），同時(shí)表明文庫(kù)復(fù)雜程度降低，與靶標(biāo)結(jié)合的序列得到富集。進(jìn)一步的流式細(xì)胞術(shù)分析表明隨著篩選的進(jìn)行，熒光右移（圖5B），與靶標(biāo)結(jié)合的ssDNA得到富集，而且11輪與15輪之間的差異縮小，考慮在15輪結(jié)束篩選。

2.7 菌液PCR鑒定及序列測(cè)定

為了得到篩選所得的與靶標(biāo)蛋白結(jié)合的序列，將第15輪PCR擴(kuò)增的膠回收產(chǎn)物與T載體連接后轉(zhuǎn)化的DH5α感受態(tài)細(xì)胞涂板培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行菌液鑒定，通過瓊脂糖凝膠電泳，鑒定出119個(gè)陽性克隆，將陽性菌液送往擎科生物科技公司測(cè)序，共測(cè)出111條序列，其中S1-3、S1-11重復(fù)率最高，分別為18%和16.2%，作為候選適配體進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，其核苷酸序列見表3。

2.8 適配體親和力和特異性檢測(cè)

為了檢測(cè)篩選所得適配體與靶標(biāo)蛋白結(jié)合情況及其特異性，通過ELASA試驗(yàn)測(cè)定適配體與靶標(biāo)蛋白結(jié)合后在OD450 nm處的吸光值。利用Prism8.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，擬合曲線如圖6A、B，結(jié)果表明S1-3、S1-11核酸適配體與靶蛋白結(jié)合的Kd值分別為2.09 nmol和22.94 nmol，均在納摩爾級(jí)，表明具有較強(qiáng)的親和力。進(jìn)一步的試驗(yàn)顯示適配體S1-3不與rMBP蛋白、rMBP-gD 蛋白、rMBP-GP5蛋白以及BSA蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，具有高特異性（圖6C）。

2.9 適配體二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及其與靶標(biāo)蛋白的分子對(duì)接

利用在線軟件對(duì)適配體Apt-S1-3進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如圖7A所示，該核酸適配體具有穩(wěn)定的莖環(huán)狀和發(fā)卡狀結(jié)構(gòu)，是與靶標(biāo)蛋白S1-CTD蛋白結(jié)合的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。分子對(duì)接結(jié)果顯示，靶標(biāo)蛋白與核酸適配體形成緊密的復(fù)合體，青色顯示靶蛋白，橙色顯示適配體，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)蛋白的氨基酸ARG207、GLN-205與核酸適配體形成了氫鍵，進(jìn)而穩(wěn)定適配體與靶蛋白形成的復(fù)合體，如圖7B所示。

2.10 間接免疫熒光驗(yàn)證適配體與PEDV的識(shí)別

為了驗(yàn)證篩選所得適配體Apt-S1-3是否能夠識(shí)別病毒，利用間接免疫熒光檢測(cè)適配體與病毒的結(jié)合情況，紅色指示PEDV病毒粒子，綠色指示FAM標(biāo)記的DNA適配體。與未攻毒細(xì)胞相比，適配體Apt-S1-3與PEDV發(fā)生共定位，黃色顯示，此結(jié)果說明適配體Apt-S1-3能夠識(shí)別、結(jié)合PEDV（圖8）

2.11 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)適配體抑制病毒感染細(xì)胞效果

為了確定所得適配體對(duì)病毒感染細(xì)胞的影響，將不同濃度適配體與PEDV-GFP病毒孵育1 h后感染細(xì)胞，在5%二氧化碳，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。熒光顯微鏡結(jié)果顯示（圖9A），隨著適配體濃度的升高，病毒的增殖受到顯著抑制，而作為對(duì)照組的隨機(jī)文庫(kù)并未表現(xiàn)明顯抑制效果。流式細(xì)胞術(shù)的定量結(jié)果同樣顯示（圖9B），隨著濃度增加，與隨機(jī)文庫(kù)相比，適配體對(duì)病毒的抑制效果差異顯著。

3 討 論

2010年P(guān)ED在中國(guó)大面積暴發(fā)，主要以7日齡以內(nèi)的哺乳仔豬極高發(fā)病率和死亡率為主要特征，2周齡以上的豬出現(xiàn)不同程度的腹瀉和厭食等癥狀，PEDV嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，但目前仍然缺乏針對(duì)PEDV的有效疫苗［17］，因此，急需新的診斷與治療手段防控PEDV的傳播。PEDV S蛋白在宿主親和力、病毒-細(xì)胞識(shí)別、膜融合和進(jìn)入中起著關(guān)鍵作用，成為抗病毒藥物研發(fā)和疫苗設(shè)計(jì)的重要靶點(diǎn)；S1包含S1和S2兩個(gè)亞基，其中S1亞基包含信號(hào)肽（SP）、N端結(jié)構(gòu)域（NTD）、C端結(jié)構(gòu)域（CTD）、亞結(jié)構(gòu)域1（SD1）和亞結(jié)構(gòu)域2（SD2）［18］。相關(guān)研究表明，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）［19］和二肽基肽酶4（DPP4）［20］是SARS-CoV和MERS-CoV的宿主受體，病毒的受體結(jié)合域（RBD）位于S1亞基（S1-CTDs）的C末端結(jié)構(gòu)域［21］。氨肽酶N（APN）是人冠狀病毒229E（HCoV-229E）［22］和TGEV［23］的宿主受體，其RBD也位于S1-CTD中。因此，S1亞基中的S1-CTD區(qū)域在病毒與宿主細(xì)胞受體的識(shí)別和相互作用中起著關(guān)鍵作用。已有研究證實(shí)PEDV的S1-CTD區(qū)域能夠與pAPN的外結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生相互作用［24］，盡管隨后的研究揭示了pAPN并非豬流行性腹瀉病毒的實(shí)際功能性受體［25］，但這并不影響我們對(duì)病毒入侵機(jī)制的理解。而且在變體PEDV中，S1-CTD結(jié)構(gòu)域比S1-NTD結(jié)構(gòu)域更保守。因此，PEDV的 S1-CTD成為抗病毒研究的重要靶點(diǎn)。

核酸適配體具有無免疫原性、穩(wěn)定性強(qiáng)，成本低等優(yōu)勢(shì)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要潛在價(jià)值［26］。本文通過磁珠法篩選出的一條高親和力、高特異性的核酸適配體Apt-S1-3，對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性分析，發(fā)現(xiàn)該適配體與靶標(biāo)S1-CTD蛋白的結(jié)合具有高的親和力和特異性，該適配體具有具有典型的莖環(huán)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，是適配體與靶標(biāo)蛋白結(jié)合的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［27］。分子對(duì)接模型圖中，當(dāng)聚焦于結(jié)合區(qū)域時(shí)，發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)蛋白的ARG207和GLN206與核酸適配體形成氫鍵，這是二者形成穩(wěn)定復(fù)合物的化學(xué)基礎(chǔ)。與以往的研究結(jié)果一致，氫鍵在核酸適配體與靶蛋白結(jié)合過程中具有重要作用［28］，隨后又通過間接免疫熒光試驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)證實(shí)適配體Apt-S1-3能夠識(shí)別、結(jié)合PEDV并抑制病毒感染。本研究篩選得到的DNA適配體不僅能夠特異結(jié)合PEDV的S1-CTD蛋白，還能夠識(shí)別、結(jié)合PEDV病毒粒子，可以作為檢測(cè)和治療PEDV的試劑進(jìn)行開發(fā)。

目前對(duì)病毒蛋白表達(dá)主要有真核表達(dá)系統(tǒng)或原核表達(dá)系統(tǒng)。真核系統(tǒng)在外源蛋白翻譯后可以對(duì)外源蛋白進(jìn)行加工和修飾［29］，其構(gòu)象更接近于外源蛋白本身的空間結(jié)構(gòu)，但其成本高于原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)量也比原核表達(dá)系統(tǒng)低［30］。雖然大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)量高、價(jià)格低、易于批量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，但是目前對(duì)PEDV S蛋白的原核表達(dá)主要以包涵體形式存在表達(dá)［31-32］，雖然包涵體可以經(jīng)過變性、復(fù)性操作，得到正確折疊的活性蛋白，但效率一般較低，只能達(dá)到30%左右［33］。本試驗(yàn)通過添加促融標(biāo)簽MBP使PEDV-S1-CTD蛋白實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，從而容易獲得大量PEDV-S1-CTD重組蛋白，降低了生產(chǎn)成本。而且為S1-CTD蛋白功能性研究、抗體的制備、新型疫苗研發(fā)及新型檢測(cè)方法的建立打下基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究篩選得到的DNA適配體Apt-S1-3能夠與豬流行性腹瀉病毒S1-CTD蛋白高親和力、高特異性結(jié)合，而且能夠抑制豬流行性腹瀉病毒感染細(xì)胞，為PEDV的靶向治療和檢測(cè)方法開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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（編輯 白永平）