體外對(duì)牛冠狀病毒復(fù)制具有抑制效應(yīng)藏藥的篩選

摘 要：

本研究旨在篩選出對(duì)牛冠狀病毒（BCoV）體外復(fù)制具有抑制效應(yīng)的藏藥。構(gòu)建BCoV核衣殼（N）蛋白原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)后將純化的蛋白分別免疫小鼠和兔，獲得鼠抗和兔抗N蛋白多克隆抗體，建立用于測(cè)定BCoV復(fù)制的Western blot和間接免疫熒光法（IFA）；水煎法獲得21種候選藏藥的水提物，CCK-8法測(cè)定水提物對(duì)人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞（HCT-8）的最大安全濃度，以BCoV感染HCT-8細(xì)胞為研究對(duì)象，分別設(shè)置BCoV感染組、藏藥水提物處理組、利巴韋林處理組，在BCoV感染24 h后分別應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot、IFA測(cè)定細(xì)胞中BCoV復(fù)制量，統(tǒng)計(jì)分析藏藥水提物對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用，篩選對(duì)BCoV具有顯著抑制作用的藏藥。結(jié)果顯示：分別制備鼠抗與兔抗BCoV N蛋白多克隆抗體，建立了檢測(cè)BCoV的Western blot與IFA方法；21種藏藥中的15種具有顯著抑制BCoV復(fù)制效應(yīng)（P＜0.01），其中青藏大戟、訶子、瑞香狼毒3種藏藥對(duì)BCoV復(fù)制的抑制作用優(yōu)于利巴韋林。本研究篩選到15種對(duì)BCoV體外復(fù)制具有抑制效應(yīng)的藏藥，其中青藏大戟、訶子、瑞香狼毒3種藏藥抑制作用效果顯著，為BCoV防治藥物的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：

牛冠狀病毒；核衣殼蛋白；多克隆抗體；藏藥；病毒復(fù)制

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.659.6;S85331

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A """"文章編號(hào)： 0366-6964（2025）02-0826-13

收稿日期：2024-04-02

基金項(xiàng)目：西藏自治區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（XZ202101YD0001C）；寧夏回族自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021BEF03005）；青海省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2022-NK-118）

作者簡(jiǎn)介：趙 龍（1994-），男，四川德陽(yáng)人，博士生，主要從事動(dòng)物疫病致病機(jī)制和防控技術(shù)研究，E-mail：448069517@qq.com

*通信作者：郭抗抗，主要從事動(dòng)物疫病致病機(jī)制和防控技術(shù)研究，E-mail：guokk2007@nwsuaf.edu.cn；李生慶，主要從事高原動(dòng)物疫病診斷與防控技術(shù)研究，E-mail：lsq.8008@163.com

In vitro Screening of Tibetan Medicine with Inhibitory Effects on Bovine Coronavirus

Replication

ZHAO" Long1， LIN" Jingyi1， DOU" Wei1， XU" Tingxuan1， GU" Qingyun2， GAO" Haihui1， 3， LI" Shengqing4*， GUO" Kangkang1*

（1.College of Veterinary Medicine， Northwest Aamp;F University， Yangling， Shaanxi 712100，" China;

2.Tibet Veterinary Medicine Key Laboratory of Xizang Vocational and Technical College， Lhasa， Tibet 850030，" China;

3.Institute of Animal Science， Ningxia Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Yinchuan， Ningxia 750002，" China;

4.Qinghai Academy of Animal and Veterinary Sciences， Xining， Qinghai 810016，" China）

Abstract：

This study was aimed at screening Tibetan medicines exerting inhibitory effects on the in vitro replication of Bovine coronavirus （BCoV）. To achieve this， a prokaryotic expression vector encoding the BCoV nucleocapsid （N） protein was constructed. Following induced expression， the purified N protein was used to immunize mice and rabbits， resulting in the production of mouse anti-N protein polyclonal antibodies and rabbit anti-N protein antibodies. Western blot and indirect immunofluorescence assay （IFA） techniques were subsequently developed to assess BCoV replication. The water extract of 21 candidate Tibetan medicines was obtained by water decoction method. The maximum safe concentration of water extract on human colorectal adenocarcinoma cells （HCT-8） was determined by CCK-8. HCT-8 cells infected with BCoV were used as the research object， and BCoV infection group， Tibetan medicine water extract treatment group and ribavirin treatment group were set up respectively. After 24 h of BCoV infection， real-time fluorescence quantitative PCR， Western blot and IFA were used to determine the replication of BCoV in cells. The inhibitory effect of Tibetan medicine on virus replication was statistically analyzed， and Tibetan medicine with significant inhibitory effect on BCoV was screened. The polyclonal antibodies of mouse anti-BCoV N protein and rabbit anti-BCoV N protein were prepared respectively， and the Western blot and IFA methods for detecting BCoV were established. Among the 21 Tibetan medicines， 15 had significant inhibitory effects on BCoV replication （Plt;0.01）. Among them， the inhibitory effects of three Tibetan medicines， Euphorbia altotibetica Paulsen， Terminalia chebula Retz.， and Stellera chamaejasme L. on BCoV replication were better than those of ribavirin. In this study， 15 Tibetan medicines with inhibitory effects on BCoV replication in vitro were screened. Among them， three Tibetan medicines， Euphorbia altotibetica Paulsen， Terminalia chebula Retz.， and Stellera chamaejasme L. had significant inhibitory effects， which laid a foundation for the development of BCoV prevention and treatment drugs.

Key words：

bovine coronavirus; N protein; polyclonal antibody; Tibetan medicine; viral replication

*Corresponding authors：" GUO Kangkang， E-mail： guokk2007@nwsuaf.edu.cn; LI Shengqing， E-mail： lsq.8008@163.com

牛冠狀病毒（bovine coronavirus，BCoV）廣泛流行于我國(guó)各地區(qū)的不同牛群中［1-2］。該病毒主要引起犢牛腹瀉或呼吸道病癥，還可引起成年牛冬季痢疾［3］。病?？砷L(zhǎng)期帶毒排毒，引發(fā)大規(guī)模感染，導(dǎo)致?tīng)倥０l(fā)育遲緩，飼料利用率降低，給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［4］。BCoV是單股正鏈RNA病毒，具有5種結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白（S蛋白）、血凝素酯酶蛋白（HE蛋白）、小衣殼蛋白（E蛋白）、跨膜蛋白（M蛋白）以及核衣殼蛋白（N蛋白）［5］。N蛋白是病毒編碼蛋白中表達(dá)量最高的蛋白［6］，并且高度保守，具有良好的免疫原性，是冠狀病毒診斷與抗體制備的主要靶標(biāo)［7-9］。對(duì)于BCoV感染的防治目前暫無(wú)有效藥物，制備相關(guān)抗體對(duì)開(kāi)展抗BCoV藥物的研究具有重要意義。

篩選、鑒定抗病毒天然產(chǎn)物是近些年來(lái)研究熱點(diǎn)，藏藥是發(fā)源于青藏高原的古老民族藥，藥物種類(lèi)繁多，資源豐富，也是開(kāi)發(fā)新型抗病毒、抗菌新產(chǎn)品的重要研究對(duì)象。有大量的臨床實(shí)踐證明藏藥在預(yù)防和治療病毒性疾病方面具有顯著的療效［10］，有研究發(fā)現(xiàn)藏藥訶子提取物對(duì)單純皰疹病毒（HSV）、人免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）等病毒均具有較好的體外抑制作用［11-13］；甘青烏頭提取物對(duì)HSV和BVDV具有體外抑制作用［12，14］；矮紫堇提取物對(duì)BVDV也有較好的體外抑制作用［12］。這些研究說(shuō)明，從藏藥中篩選抗病毒物質(zhì)具有可行性和良好前景。目前國(guó)內(nèi)暫無(wú)可用于防治BCoV的特效藥物或疫苗，臨床上大多使用抗生素治療防止繼發(fā)感染，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性日益嚴(yán)重。隨著我國(guó)“禁抗減抗”政策施行，迫切需要從傳統(tǒng)藏藥中開(kāi)發(fā)出新的可用于畜牧業(yè)的天然、綠色、高效抗病毒天然產(chǎn)物［15］。本研究團(tuán)隊(duì)近年來(lái)在寧夏、青海等地腹瀉牛主要病原檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)BCoV的檢出率平均達(dá)到50%左右，部分區(qū)域甚至可以達(dá)到70%左右，提示BCoV在誘導(dǎo)犢牛腹瀉中具有重要作用。在前期研究中發(fā)現(xiàn)部分藏藥水提物在體外對(duì)BCoV的復(fù)制具有抑制作用，為此開(kāi)展了抗BCoV藏藥的篩選研究。本研究基于前期初選的21種藏藥，對(duì)其體外抑制BCoV復(fù)制作用進(jìn)行研究，以期篩選到對(duì)BCoV復(fù)制具有顯著抑制效應(yīng)的藏藥，為下一步抗病毒藏藥篩選及產(chǎn)品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物、細(xì)胞、病毒等

新西蘭大白兔2只、SPF昆明小鼠5只（18～22g）由西北農(nóng)林科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物試驗(yàn)經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)審核通過(guò)（XN2021-0601）；HCT-8傳代細(xì)胞系、BCoV毒株（105.50 TCID50·mL-1）由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)公共衛(wèi)生與畜禽產(chǎn)品安全實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并命名保存（GenBank： OP866727.1），HCT-8傳代細(xì)胞系也由該實(shí)驗(yàn)室保存并提供；大腸桿菌（E. coli）BL21 （DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于擎科生物有限公司。

1.1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑AG RNAex Pro Reagent、Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Pro Taq HS購(gòu)自艾科瑞生物公司；高保真Taq 酶Prime STARMax DNA Polymerase購(gòu)自TaKaRa生物有限公司；XhoⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB（北京）有限公司；HRP-linked Antibody、FITC熒光標(biāo)記IgG購(gòu)自Cell Signaling Technology（CST）公司；佐劑購(gòu)自麥克林公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購(gòu)自賽澳美細(xì)胞技術(shù)有限公司；Anti-His Tag Monoclonal Antibody、Ni-TED Beads 6FF重力柱、利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品（貨號(hào)：SR8570）、pET-28a原核表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；鼠抗GAPDH抗體購(gòu)買(mǎi)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；蛋白超濾濃縮管購(gòu)自Millipore公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自ZHHC公司；CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)買(mǎi)于米鼠生物科技公司。超聲細(xì)胞破碎儀購(gòu)于寧波新芝生物科技股份有限公司；凝膠成像系統(tǒng)Doc2000與蛋白質(zhì)電泳儀購(gòu)于Bio-Rad公司；基因擴(kuò)增儀購(gòu)于Applied Biosystem公司；熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本尼康公司。

1.1.3 藏藥

藏藥瑞香狼毒、五脈綠絨蒿、長(zhǎng)松蘿、盤(pán)花垂頭菊、青藏大戟、烏奴龍膽、獨(dú)一味、甘青烏頭、矮紫堇、螃蟹甲、甘青青蘭、綠蘿花、蒺藜、鐵棒錘、余甘子、川西獐牙菜、短穗兔耳草、藍(lán)花荊芥、訶子、藏木香、虎耳草，共21種，采購(gòu)自拉薩市西藏?？》忌锟萍脊?。

1.2 方法

1.2.1 BCoV N蛋白多克隆抗體制備

1.2.1.1 N基因原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建：

以BCoV cattle_F226/2021毒株基因組（GenBank登錄號(hào)： OP866727.1）為參考，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增完整N基因（1344 bp），引物分別帶有酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和XhoⅠ（下劃線(xiàn)處），由西安擎科生物有限公司進(jìn)行合成。引物序列為BCN-EcoRⅠ： CCGGAATTCATGTCTTTTACTCCTGGTAAG，BCN-XhoⅠ： CCGCTCGAGTATTTCTGAGGTGTCTTC-AGT。根據(jù)RNA提取試劑盒與RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)提取BCoV病毒總RNA并制備成cDNA用于擴(kuò)增N基因。按照高保真Taq 酶Prime STARMax DNA Polymerase說(shuō)明書(shū)反應(yīng)程序與體系擴(kuò)增N基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后使用膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收。參照XhoⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA連接酶說(shuō)明書(shū)將PCR產(chǎn)物與pET-28a原核表達(dá)載體的質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli BL21 （DE3）感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定。

1.2.1.2 重組N蛋白的表達(dá)與純化：

將鑒定正確的重組表達(dá)菌液培養(yǎng)至OD值為0.6，加入終濃度為0.5 mmol·L-1的IPTG在37℃，220 r·min-1的條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)6 h后4000 r·min-1離心10 min，棄上清收集菌體，適量PBS重懸超聲破碎，12 000 r·min-1離心15 min后收集上清和沉淀（包涵體）。上清與沉淀經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，使用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜3次后加入Anti-His抗體（1∶4 000）室溫孵育2 h，洗膜后加入HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，洗膜后加顯色液使用蛋白凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行印跡分析。根據(jù)Ni-TED Beads 6FF說(shuō)明書(shū)采用鎳柱親和層析法純化重組N蛋白。將純化后的重組N蛋白轉(zhuǎn)入超濾離心管，4 000 r·min-1，4℃離心至濃縮液體積為1 mL，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)濃度。

1.2.1.3 重組N蛋白多克隆抗體制備：

將濃縮后的重組N蛋白與佐劑乳化。新西蘭大白兔與昆明小鼠采取背部皮下分點(diǎn)注射免疫4次，首免為弗氏完全佐劑，剩余3次免疫均為弗氏不完全佐劑。首次免疫后14、24、34 d進(jìn)行免疫，每次免疫劑量新西蘭大白兔為300 μg·只-1，小鼠為50 μg·只-1，最后一次免疫結(jié)束后10 d采集動(dòng)物血清。

1.2.1.4 Western blot鑒定N蛋白多克隆抗體：

將HCT-8細(xì)胞接種于12孔板，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%，接種BCoV cattle_F226/2021毒株（MOI=1）后置于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24、36、48 h。收集細(xì)胞后加入200 μL RIPA（含1% PSMF）冰上裂解細(xì)胞30 min，12 000 r·min-1，4℃離心15 min取上清制備細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，使用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜3次后分別加入鼠抗N蛋白多克隆抗體（1∶12 000）、兔抗N蛋白多克隆抗體（1∶4 000）、GAPDH抗體（1∶12 000），室溫孵育2 h，洗膜后加入抗鼠或抗兔HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，洗膜后加顯色液使用蛋白凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行印跡分析。

1.2.1.5 IFA鑒定N蛋白多克隆抗體：

HCT-8細(xì)胞接種病毒24 h后經(jīng)5%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次后加入0.5% Triton-100室溫穿透15 min，加入5%脫脂奶粉4 ℃封閉過(guò)夜，洗板后加入鼠抗N蛋白多克隆抗體（1∶100）或兔抗N蛋白多克隆抗體（1∶100）室溫孵育1 h，洗板后加入抗兔或抗鼠FITC熒光標(biāo)記抗體（1∶500）孵育1 h，洗板后加入10 μg·mL-1 DAPI染核10 min，洗板后觀察熒光。

1.2.2 抗BCoV藏藥體外篩選

1.2.2.1 藏藥水提取物的制備與稀釋?zhuān)?/p>

采用傳統(tǒng)水煎法提取藏藥有效成分。將藏藥取50 g粉碎后加入500 mL去離子水于4 ℃浸泡12 h，轉(zhuǎn)入砂鍋中大火煮沸，然后用文火煎煮1 h，用4層紗布過(guò)濾，收集濾液，重復(fù)3次后混合濾液，以5 000 r·min-1離心10 min，取上清液真空干燥制成干粉后密封，4℃避光保存。根據(jù)各種藏藥水提物干燥粉末的物理狀態(tài)，選擇不同體積DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行溶解，以此為原始濃度進(jìn)行倍比梯度稀釋。稀釋后的藥液經(jīng)0.45 μm濾器過(guò)濾，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 藥物對(duì)HCT-8細(xì)胞最大安全濃度測(cè)定：

HCT-8細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)接種于96孔板，生長(zhǎng)至單層細(xì)胞后加入不同稀釋梯度藥物，每孔100 μL，每個(gè)稀釋度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立正常細(xì)胞和無(wú)細(xì)胞對(duì)照，待細(xì)胞病變不再繼續(xù)時(shí)，用PBS液洗板3次，每孔加入10% CCK-8后將96孔板在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm處OD值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率=［ （As-Ab） / （Ac-Ab） ］ × 100%，As=加藥組OD值，Ab=無(wú)細(xì)胞組OD值，Ac=正常細(xì)胞組OD值。90%以上的細(xì)胞存活的藥物濃度為最大安全濃度。

1.2.2.3 抑制病毒藏藥體外篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)：

將HCT-8細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)接種于12孔板，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%密度后棄去培養(yǎng)液，洗板后加入安全濃度的藥物置于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中預(yù)處理1 h，同時(shí)取BCoV cattle_F226/2021毒株等體積與藥物混合，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中滅活處理1 h，使得藥物終濃度為最大安全濃度，病毒MOI=0.1。隨后將滅活處理后的病毒混合物接種預(yù)處理細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h后棄去病毒液，加入含最大安全濃度藥物培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞樣本，用于測(cè)定藏藥的抑制病毒復(fù)制效應(yīng)。同時(shí)設(shè)置利巴韋林治療組、未用藥組（BCoV組），每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。

1.2.2.4 藏藥抑制胞內(nèi)BCoV增殖測(cè)定：

使用本研究制備的多克隆抗體按照“1.2.1.4”與“1.2.1.5”進(jìn)行Western blot與IFA檢測(cè)藥物處理后胞內(nèi)病毒增殖感染情況，并使用熒光定量PCR對(duì)胞內(nèi)病毒N相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)SYBR Green Pro Taq HS說(shuō)明書(shū)反應(yīng)程序與體系，以BCoV N基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)引物：N-F：CGTTCTGGTAATGGCATCCTTA，N-R：GTTTGCTTGGGTTGAGC-TCTTCTA；以GAPDH作為內(nèi)參基因設(shè)計(jì)引物：AAGGCTGTGGGCAAGG，GAPDH-R：TGGAGGAGTGGGTGTCG。

1.2.2.5 藏藥對(duì)病毒滴度影響測(cè)定：

將BCoV（MOI=0.1）接種于常規(guī)培養(yǎng)的12孔板HCT-8細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱1 h后棄去病毒液，使用PBS清洗3次，加入含最大安全濃度藥物培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，測(cè)定上清液中病毒滴度。同時(shí)設(shè)置利巴韋林治療組、未用藥組（BCoV組），每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的病毒使用96孔培養(yǎng)板進(jìn)行滴度測(cè)定，使用本研究制備的多克隆抗體，參照“1.2.1.5” IFA進(jìn)行病毒陽(yáng)性感染孔判定，按照Reed-Muench氏法計(jì)算病毒TCID50。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用2-ΔΔCt法計(jì)算胞內(nèi)病毒N基因的相對(duì)表達(dá)量；使用GraphPad Prism 8.02進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與制圖；使用ImageJ對(duì)蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行灰度值分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Student’s t檢驗(yàn)進(jìn)行各組的差異顯著性分析：*. Plt;0.05，**. Plt;0.01，***. Plt;0.001，ns 表示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BCoV N基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒構(gòu)建

使用特異性引物對(duì)N基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定出目的條帶與預(yù)期的1 344 bp一致（圖1A）。將PCR產(chǎn)物與pET-28a質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，連接構(gòu)建pET-28a-BCoV-N重組原核表達(dá)載體，將構(gòu)建完成的pET-28a-BCoV-N載體成功轉(zhuǎn)化至E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定（圖1B）。菌液質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ與XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切后pET-28a-BCoV-N載體較小目的條帶與預(yù)期1 344 bp一致，較大目的條帶與pET-28a 載體片段大小吻合（圖1C），測(cè)序比對(duì)顯示序列無(wú)突變，成功構(gòu)建了BCoV N基因原核表達(dá)載體。

2.2 重組N蛋白表達(dá)及其多克隆抗體鑒定

將菌液以0.5 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)6 h后，使用His標(biāo)簽抗體在破碎菌體的上清與沉淀中均鑒定出重組N蛋白正確表達(dá)（圖2A）。由于上清中的可溶性蛋白具有更好的生物活性，因此選擇上清中的可溶性蛋白進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。將破碎菌體上清通過(guò)鎳柱親和層析法純化出重組N蛋白，SDS-PAGE結(jié)果顯示，在0.1 mol·L-1咪唑洗脫液位置出現(xiàn)單一目的蛋白條帶，與預(yù)期60 ku相符（圖2B）。純化后的重組N蛋白濃縮后經(jīng)BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度為0.68 mg·mL-1。

Western blot結(jié)果表明，免疫兔與小鼠制備的重組N蛋白多克隆抗體均可有效識(shí)別BCoV感染HCT-8細(xì)胞中表達(dá)的天然N蛋白，并且在感染后12～48 h，N蛋白表達(dá)量隨時(shí)間逐漸增加（圖2C）；同時(shí)IFA結(jié)果表明，在BCoV感染24 h后的細(xì)胞內(nèi)能觀察到綠色的病毒特異性熒光（圖2D），說(shuō)明制備的鼠源和兔源抗體均能有效識(shí)別病毒感染過(guò)程中表達(dá)的N蛋白。表明制備的鼠源和兔源N蛋白多克隆抗體具有良好的反應(yīng)性，可用于后續(xù)抗病毒藥物的篩選。

2.3 藏藥對(duì)HCT-8細(xì)胞最大安全濃度測(cè)定

21種藏藥水提物經(jīng)濃縮干燥后，所得干粉重量為9.32～18.39 g（表1）。根據(jù)不同藥物粉末狀態(tài)稀釋得到不同藥物初始濃度，使用CCK-8測(cè)得每種藥物在HCT-8細(xì)胞上的最大安全濃度為0.024～111.61 mg·mL-1，詳見(jiàn)圖3。

2.4 藏藥抑制病毒基因轉(zhuǎn)錄測(cè)定

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，在21種藏藥的最大安全濃度作用下，余甘子、綠蘿花、烏奴龍膽、訶子、藏木香、青藏大戟、藍(lán)花荊芥、瑞香狼毒共8種藏藥以及利巴韋林組病毒N基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平極顯著低于BCoV感染組（P＜0.01）（圖4），各組N基因轉(zhuǎn)錄水平依次為：青藏大戟＜瑞香狼毒＜利巴韋林＜訶子＜綠蘿花＜藏木香＜余甘子＜藍(lán)花荊芥＜烏奴龍膽＜BCoV感染組。其中青藏大戟、瑞香狼毒對(duì)病毒基因轉(zhuǎn)錄抑制作用優(yōu)于利巴韋林。

2.5 藏藥抑制病毒蛋白表達(dá)測(cè)定

進(jìn)一步對(duì)胞內(nèi)病毒N蛋白表達(dá)的Western blot測(cè)定結(jié)果表明，在21種藏藥的最大安全濃度作用下，余甘子、綠蘿花、烏奴龍膽、訶子、青藏大戟、藍(lán)花荊芥、瑞香狼毒、甘青烏頭、矮紫堇、盤(pán)花垂頭菊、五脈綠絨蒿共11種藏藥以及利巴韋林組病毒N蛋白表達(dá)量極顯著低于BCoV感染組（P＜0.01）（圖5）。余甘子、綠蘿花、烏奴龍膽、訶子、青藏大戟、藍(lán)花荊芥、瑞香狼毒對(duì)病毒蛋白表達(dá)抑制作用與基因轉(zhuǎn)錄結(jié)果一致。藏木香處理組N蛋白表達(dá)量也略低于BCoV感染組，但無(wú)顯著性差異。甘青烏頭、矮紫堇、盤(pán)花垂頭菊、五脈綠絨蒿對(duì)病毒基因轉(zhuǎn)錄無(wú)抑制作用，但對(duì)病毒蛋白的表達(dá)卻表現(xiàn)出顯著的抑制作用。各組N蛋白表達(dá)量依次為：瑞香狼毒＜青藏大戟＜訶子＜烏奴龍膽＜利巴韋林＜五脈綠絨蒿＜藍(lán)花荊芥＜甘青烏頭＜矮紫堇＜余甘子＜綠蘿花＜盤(pán)花垂頭菊＜BCoV感染組。其中瑞香狼毒、青藏大戟、訶子、烏奴龍膽對(duì)病毒N蛋白表達(dá)的抑制作用優(yōu)于利巴韋林。

2.6 藏藥抑制病毒滴度測(cè)定

在21種藏藥的最大安全濃度作用下，余甘子、綠蘿花、烏奴龍膽、訶子、甘青青蘭、藏木香、青藏大戟、瑞香狼毒、甘青烏頭、矮紫堇、短穗兔耳草共11種藏藥以及利巴韋林組病毒滴度極顯著低于BCoV感染組（P＜0.01）（圖6），各組病毒滴度依次為：青藏大戟＜訶子＜瑞香狼毒＜利巴韋林＜甘青烏頭＜藏木香＜烏奴龍膽＜矮紫堇＜綠蘿花＜甘青青蘭＜余甘子＜短穗兔耳草＜BCoV感染組，其中青藏大戟、訶子、瑞香狼毒對(duì)病毒滴度抑制作用優(yōu)于利巴韋林。

綜上可知，本研究成功從21種藏藥種篩選出余甘子、綠蘿花、烏奴龍膽、訶子、甘青青蘭、藏木香、青藏大戟、瑞香狼毒、甘青烏頭、矮紫堇、藍(lán)花荊芥、短穗兔耳草、甘青烏頭、盤(pán)花垂頭菊、五脈綠絨蒿共15種藏藥水提物具有極顯著抑制BCoV復(fù)制效應(yīng)（P＜0.01），而鐵棒錘、虎耳草、螃蟹甲、川西獐牙菜、長(zhǎng)松蘿、蒺藜6種藏藥未表現(xiàn)出抑制作用，其中青藏大戟、訶子、瑞香狼毒這3種藏藥在抑制BCoV N蛋白表達(dá)以及降低病毒滴度效果均優(yōu)于利巴韋林，表明這3種藏藥抑制病毒復(fù)制作用最為顯著。

3 討 論

BCoV與當(dāng)前全球流行的SARS-CoV-2均屬于 β 冠狀病毒屬成員，由于生物安全限制SARS-CoV-2病原培養(yǎng)，因此BCoV是用于替代SARS-CoV-2篩選抗冠狀病毒藥物的理想模型［16-18］。但目前可用于藥物篩選的BCoV商品抗體較少，極大地限制了BCoV作為模式病毒的研究。因此，鑒于N蛋白的高保守性和良好的免疫原性，本研究選擇N蛋白為靶標(biāo)成功表達(dá)了可溶性重組N蛋白，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了該重組蛋白具有良好的生物活性，值得進(jìn)一步用于ELISA診斷試劑盒的研發(fā)。隨后我們成功制備了N蛋白多克隆抗體，Western blot與IFA鑒定表明兩種不同來(lái)源的動(dòng)物抗體均具特異性結(jié)合BCoV N蛋白，但免疫昆明小鼠獲得的多克隆抗體稀釋比更高，這可能是由于免疫劑量與不同物種差異所致［19］，本研究制備的N蛋白多克隆抗體為BCoV的基礎(chǔ)研究以及抗病毒藥物篩選提供了重要的基礎(chǔ)材料。

病毒性感染引起的傳染病因具有種類(lèi)繁多、傳染性強(qiáng)、病死率高、變異速度快等特點(diǎn)，一直持續(xù)威脅著人體健康及養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。例如由SARS-CoV-2引起的新型冠狀病毒肺炎［20］、非洲豬瘟病毒（ASFV）引起的非洲豬瘟等［21］，均造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于畜牧業(yè)疫苗研發(fā)欠缺和抗病毒藥物使用限制，許多病毒性疫病仍缺乏有效的預(yù)防措施和治療藥物［22-24］，因此迫切需要尋找和開(kāi)發(fā)可用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)中高效、低毒、抗耐藥性的抗病毒藥物。本研究以BCoV為靶標(biāo)病原，使用制備的多克隆抗體對(duì)病毒的增殖情況進(jìn)行測(cè)定，對(duì)病毒基因表達(dá)、蛋白表達(dá)、病毒滴度3個(gè)方面進(jìn)行測(cè)定，選擇21種價(jià)格低廉且具有抗病毒潛力的藏藥，成功篩選出15種藏藥水提物對(duì)BCoV復(fù)制具有抑制效應(yīng)，其中訶子、矮紫堇、甘青烏頭的抑制作用與王丹陽(yáng)等［12］的研究結(jié)果一致，余甘子的抑制作用與吉守祥等［25］研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了這些藏藥對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用。并且青藏大戟、訶子、瑞香狼毒這3種藏藥在體外抑制BCoV N蛋白表達(dá)以及降低病毒滴度效果均優(yōu)于利巴韋林，值得進(jìn)一步開(kāi)展臨床靶動(dòng)物體內(nèi)抗病毒作用測(cè)定，為新型抗病毒藏藥的研發(fā)提供參考。

本研采取傳統(tǒng)水煎法對(duì)藏藥進(jìn)行提取，水煎法操作簡(jiǎn)單，成本低，但有效成分提取率相對(duì)較低［26］，用水煎法得到的水提物并不能代表藏藥的全部有效成分［27］。此外，本研究在藥物篩選的試驗(yàn)設(shè)計(jì)中包含了藥物對(duì)病毒的直接殺滅作用、藥物對(duì)宿主細(xì)胞影響、以及藥物對(duì)病毒復(fù)制周期的影響測(cè)定，適用于抗病毒藥物大量初步篩選。后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)藏藥提取工藝以及對(duì)抑制病毒復(fù)制機(jī)制進(jìn)一步研究，從而挖掘出更多具有抗病毒潛力的藏藥。

4 結(jié) 論

本研究篩選出15種對(duì)BCoV體外復(fù)制具有極顯著抑制效應(yīng)的藏藥，其中青藏大戟、訶子、瑞香狼毒這3種藏藥抑制作用最佳，可作為開(kāi)發(fā)防治BCoV感染的候選藥物。

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