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    貓傳染性腹膜炎病毒mRNA疫苗轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建與鑒定

    2025-03-20 00:00:00盧娜高鈺趙嘉偉蘇迪陳家磊羅忠禮
    畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2025年2期
    關(guān)鍵詞:小鼠

    摘 要:

    本研究旨在設(shè)計(jì)貓傳染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus,F(xiàn)IPV)mRNA疫苗體外轉(zhuǎn)錄載體,并評(píng)估其轉(zhuǎn)錄出的FIPV mRNA疫苗的免疫原性。選取FIPV的核衣殼(nucleocapsid,N)蛋白,通過(guò)序列優(yōu)化,結(jié)合CureVac mRNA技術(shù)平臺(tái),選擇合適的非編碼序列、信號(hào)肽序列和poly A尾部。將構(gòu)建完成的目的序列克隆到pBluescript II KS(+)載體上,經(jīng)過(guò)載體的線性化單酶切后,在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,合成編碼FIPV N 基因的mRNA,并經(jīng)過(guò)加帽、純化和瓊脂糖凝膠電泳分析。通過(guò)體外轉(zhuǎn)染試驗(yàn)驗(yàn)證抗原蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。在小鼠體內(nèi)接種FIPV N-mRNA疫苗后,檢測(cè)其體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。瓊脂糖凝膠試驗(yàn)表明,設(shè)計(jì)的mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體成功制備出穩(wěn)定單一的mRNA序列。轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞后,可在12~24 h內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)目標(biāo)抗原蛋白。ELISA試驗(yàn)結(jié)果顯示FIPV N-mRNA疫苗在小鼠體內(nèi)引起了強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng),其特異性抗體、IL-4、TNF-α水平明顯高于對(duì)照組。Elispot試驗(yàn)結(jié)果顯示FIPV N-mRNA組脾細(xì)胞分泌的IFN-γ的含量顯著高于對(duì)照組。以FIPV N蛋白為抗原的體外轉(zhuǎn)錄載體所轉(zhuǎn)錄的mRNA疫苗,在細(xì)胞內(nèi)能夠高效表達(dá)目的蛋白,具有良好的免疫原性,有效引起小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。FIPV N-mRNA疫苗有望成為貓傳染性腹膜炎的潛在候選疫苗,mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體的制備為傳染性疾病mRNA疫苗的設(shè)計(jì)與研發(fā)提供了重要的參考價(jià)值。

    關(guān)鍵詞:

    貓傳染性腹膜炎;貓傳染性腹膜炎病毒N蛋白;mRNA疫苗;體外轉(zhuǎn)錄載體

    中圖分類號(hào):

    R318 """"文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A """"文章編號(hào): 0366-6964(2025)02-0803-11

    收稿日期:2024-04-01

    作者簡(jiǎn)介:盧 娜(1997-),女,漢族,安徽界首人,碩士,主要從事冠狀病毒mRNA疫苗及遞送載體的研究,E-mail:lunar@stu.cqmu.edu.cn

    *通信作者: 羅忠禮,教授,主要從事納米生物醫(yī)學(xué)、創(chuàng)傷修復(fù)、組織工程、特種醫(yī)學(xué)、膜蛋白穩(wěn)定及晶體解析研究,E-mail:Zhongli luo@163.com

    Construction and Characterization of Transcription Vectors for Feline Infectious Peritonitis Virus mRNA Vaccines

    LU" Na, GAO" Yu, ZHAO" Jiawei, SU" Di, CHEN" Jialei, LUO" Zhongli*

    (College of Basic Medical Sciences, Molecular Medicine and Cancer Research Center, Chongqing Medical University, Chongqing 400016," China)

    Abstract:

    This study aimed to design an mRNA vaccine vector for feline infectious peritonitis virus (FIPV) and evaluate the immunogenicity of the transcribed FIPV mRNA vaccines. The nucleocapsid (N) protein of FIPV was selected, and its sequence was optimized, Using CureVac′s mRNA technology platform, appropriate non-coding sequence, signal peptide sequences, and poly A tails were chosen. The synthesized target sequence was cloned into the pBluescript II KS(+) vector, linearized by a single enzyme digestion, and transcribed in vitro to synthesize mRNA encoding the FIPV N gene. The transcribed mRNA sequence was capped, purified, and analyzed by agarose gel electrophoresis. In vitro transfection assays were used to verify the expression of antigen proteins in cells. Subsequently, mice were immunized with the FIPV N-mRNA vaccine and their humoral and cellular immune responses were assessed. Agarose gel electrophoresis confirmed the successful preparation of a stable single mRNA sequence using the designed mRNA transcription vector. After transfection into cells, the target antigen protein could be expressed stably within 12-24 hours. ELISA results showed a robust humoral immune response to the FIPV N-mRNA vaccine in mice, with significantly higher levels of specific antibodies, IL-4, and TNF-α compared to the control groups. Elispot assay results demonstrated significantly higher levels of IFN-γ secreted by spleen cells in the FIPV N-mRNA group compared to the control groups. The mRNA vaccine transcribed by the vector targeting the FIPV N protein efficiently expressrs the desired protein in cells and exhibits good immunogenicity, eliciting both humoral and cellular immune response in mice. The FIPV N-mRNA vaccine may be a preparation of mRNA transcription vector provides important reference value for the design and development of mRNA vaccines against infectious diseases.

    Key words:

    feline infectious peritonitis virus; nucleocapsid protein; mRNA vaccines; in vitro transcription vectors

    *Corresponding author:" LUO Zhongli, E-mail: Zhongli luo@163.com

    貓傳染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus,F(xiàn)IPV)是一種單股正鏈RNA冠狀病毒[1],能引起貓群中高致死率的傳染病,可在貓任何年齡階段被感染發(fā)?。?]。通常情況下,病毒在患貓中反復(fù)感染,會(huì)導(dǎo)致病毒基因獲得持續(xù)性突變,從而引發(fā)患貓全身炎癥反應(yīng),其特征性病變?yōu)闈B出性肉芽腫[2]。目前針對(duì)貓傳染性腹膜炎(feline infectious peritonitis, FIP)尚無(wú)安全有效、統(tǒng)一的治療方法,多數(shù)治療方案?jìng)?cè)重于對(duì)癥治療和減輕炎癥。盡管多種抗病毒藥物,如:GC376、GS-441524、貓ω感染素被使用治療FIP,但由于用藥量不規(guī)范,用藥效果并不理想[1,3]。

    因此,當(dāng)前的研究熱點(diǎn)集中在貓傳染性腹膜炎的預(yù)防上,早在1990年,針對(duì)FIPV的減毒疫苗—Primucell FIP被研發(fā)出來(lái),但在后續(xù)的市場(chǎng)驗(yàn)證中,該疫苗的保護(hù)性存在很大的爭(zhēng)議[4]。因此該疫苗并不被推薦使用[5]。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn),刺突蛋白(spike protein, SP)的單克隆抗體能夠介導(dǎo)機(jī)體引起嚴(yán)重的抗體依賴增強(qiáng)效應(yīng)(antibody-dependent potentiating effects,ADE)[6-7]。兩種重組亞單位疫苗PBFIPV-DF-2和PBFIPV-DF-2-R3i僅能引起部分保護(hù)作用,均會(huì)導(dǎo)致ADE效應(yīng)的產(chǎn)生,這使得安全有效的FIPV疫苗的研發(fā)面臨著巨大的挑戰(zhàn)[8]。對(duì)ADE機(jī)制的研究表明,IgG的Fc段與白細(xì)胞表面的Fcγ受體相互作用,病毒與IgG形成免疫復(fù)合物,促進(jìn)了病毒附著于白細(xì)胞表面,加速病毒內(nèi)吞過(guò)程,導(dǎo)致病毒感染的增強(qiáng)[9]。后續(xù)感染中,機(jī)體所觸發(fā)的細(xì)胞免疫是病毒ADE效應(yīng)的重要平衡因素[2]。mRNA疫苗已經(jīng)被證明可誘發(fā)強(qiáng)大的細(xì)胞免疫,近期的研究表明,貓傳染性腹膜炎病毒的核衣殼蛋白能夠有效誘導(dǎo)貓的細(xì)胞免疫水平,且在貓中不會(huì)產(chǎn)生ADE[10-11]。

    因此本研究基于mRNA疫苗平臺(tái)技術(shù)[12-14],根據(jù)mRNA序列設(shè)計(jì)要求,選擇了FIPV N蛋白基因序列作為抗原,并構(gòu)建了mRNA體外轉(zhuǎn)錄的載體,驗(yàn)證了體外轉(zhuǎn)錄載體制備出mRNA,在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的蛋白的情況,并評(píng)估了FIPV N-mRNA疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫原性。這些數(shù)據(jù)為FIP疫苗的開發(fā)提供了基礎(chǔ)。同時(shí),mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建也為傳染性疾病mRNA疫苗的設(shè)計(jì)和制備提供了一定的思路和參考價(jià)值。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細(xì)胞、載體、主要試劑

    293T 細(xì)胞、pUC57-EGFP質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存以確保其正常和可用性,快速性限制性核酸內(nèi)切酶SacⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、XhoⅠ、FIPV N特異性單克隆抗體、T4 DNA Ligase、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑和LiCl等實(shí)驗(yàn)試劑產(chǎn)品均購(gòu)自上海賽默飛世爾科技有限公司,NEB公司的產(chǎn)品試劑盒有:HiScribeTM T7 高產(chǎn)量?jī)?yōu)化 RNA Synthesis Kit、Vaccinia Capping System和mRNA Cap 2′-O-甲基轉(zhuǎn)移酶試劑盒。DNA膠純化回收試劑盒,無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒大提試劑盒,普通DNA純化試劑盒選購(gòu)自北京天根生化科技有限公司,HRP-Goat Anti-Rabbit IgG抗體,F(xiàn)ITC-Goat Anti-Rabbit IgG抗體和大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海生工生物工程有限公司,2×Es Taq MasterMix (Dye)試劑購(gòu)自康寧生物技術(shù)康寧生物科技公司,BeyoECL Plus和5 × SDS-PAGE Sample Loading Buffe和DAPI染液采購(gòu)于Shanghai Biotechnology。GoldenTran-mV動(dòng)物活體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)買自長(zhǎng)春金傳科技有限公司,小鼠貓傳染性腹膜炎核衣殼蛋白抗體ELISA試劑盒、小鼠IL-4 ELISA試劑盒、小鼠TNF-α ELISA試劑盒均購(gòu)買自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司,小鼠IFN-γ Elispot試劑盒選購(gòu)于深圳市達(dá)科維生物技術(shù)股份有限公司。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    本試驗(yàn)所用的BALB/c小鼠購(gòu)買自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,并交由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心在最佳環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)方案和實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)過(guò)重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審批同意(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批準(zhǔn)編號(hào):IACUC-CQMU-2024-0106)

    1.1.3 引物序列的設(shè)計(jì)與合成

    參考pUC57-EGFP基因序列,使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)一對(duì)EGFP引物,并在EGFP-F的5′端EGFP-R的3′端分別添加EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn),引物的序列詳見(jiàn)表1,引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。合成后的引物配制為10 μmol·L-1的濃度。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體的設(shè)計(jì)及制備

    根據(jù)CureVac的mRNA技術(shù)平臺(tái)[15]設(shè)計(jì)mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體,F(xiàn)IPV N的基因序列來(lái)自于GenBank(登錄號(hào)為:NC_002306.3)選取FIPV N基因的CDS區(qū),進(jìn)行人源性密碼子的優(yōu)化,EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)被添加在基因序列兩端,并在EcoRⅠ序列端別添加HSD17B4的5′UTR序列和IgE信號(hào)肽序列,HindⅢ序列端添加PSMB3的3′UTR序列和120 bp長(zhǎng)度的ployA序列,將設(shè)計(jì)好的序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成后直接插入pBluescript II KS(+)載體的SacⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)之間,構(gòu)建pBluescript II KS(+)-FIPV N重組質(zhì)粒。

    1.2.2 報(bào)告基因EGFP的PCR擴(kuò)增、雙酶切、純化與鑒定

    參照2 × Es Taq MasterMix (Dye)試劑說(shuō)明書,以pUC57-EGFP質(zhì)粒為模板配制合適的PCR反應(yīng)體系,PCR反應(yīng)儀參數(shù)設(shè)置:94 ℃ 2 min,94 ℃ 30 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,熱循環(huán)次數(shù)為30次。使用內(nèi)切酶 EcoRⅠ 和 HindⅢ 雙酶切EGFP基因,酶切后的經(jīng)過(guò)DNA純化試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物的純化,純化的產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠120 V電泳50 min凝膠曝光檢測(cè)擴(kuò)增和純化結(jié)果。

    1.2.3 重組質(zhì)粒pBluescript II KS(+)-EGFP的構(gòu)建及鑒定

    使用 EcoRⅠ 和 HindⅢ內(nèi)切酶雙酶切 pBluescript II KS(+)-FIPV N重組質(zhì)粒,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果,膠回收mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體,T4 DNA連接酶將上述中的EGFP基因連接到mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體上,連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細(xì)胞內(nèi),涂板后挑取單克隆至含有氨芐青霉素的LB菌液內(nèi)培養(yǎng),并將菌液送去北京擎科生物科技有限公司測(cè)序,測(cè)序正確的菌液和培養(yǎng)基按照1∶1 000的比例擴(kuò)大培養(yǎng)。

    1.2.4 重組質(zhì)粒的抽提、線性化單酶切、純化

    重組質(zhì)粒pBluescript II KS(+)-FIPV N和pBluescript II KS(+)-EGFP的抽提,線性化單酶切,及后續(xù)的純化具體步驟參考相關(guān)試劑盒說(shuō)明書上的步驟。

    1.2.5 mRNA的體外轉(zhuǎn)錄、加帽、純化

    將上述線性化的DNA模板使用HiScribeTM T7高產(chǎn)量?jī)?yōu)化RNA Synthesis Kit進(jìn)行mRNA的體外轉(zhuǎn)錄,按照試劑盒的說(shuō)明書配制體外轉(zhuǎn)錄體系,轉(zhuǎn)錄出的mRNA采用LiCL沉淀法純化后,使用牛痘病毒加帽系統(tǒng)和mRNA Cap 2′-O-甲基轉(zhuǎn)移酶試劑盒進(jìn)行mRNA的體外加帽,詳細(xì)試驗(yàn)步驟和試劑使用量參照試劑盒說(shuō)明書。

    1.2.6 mRNA的體外轉(zhuǎn)染試驗(yàn)

    將293T細(xì)胞消化為細(xì)胞懸液,接種于6孔板內(nèi),5 × 105個(gè)·孔-1放置于孵箱內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng),待細(xì)胞密度匯合至85%時(shí),使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑,將2.5 μg EGFP-mRNA(1 μg·μL-1)和2.5 μg FIPV N-mRNA(1 μg·μL-1)轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞內(nèi),Lipofectamine 3000和RNA的體積比為3∶1,轉(zhuǎn)染試劑和mRNA分別稀釋在250 μL Opti-MEM減血清培養(yǎng)基內(nèi),混勻后室溫靜置10 min,500 μL混合液均勻滴入六孔板內(nèi),六孔板放置于孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

    1.2.7 細(xì)胞間接免疫熒光試驗(yàn)

    將上述轉(zhuǎn)染FIPV N-mRNA的細(xì)胞樣本放置于37 ℃ ,5% CO2孵箱內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng),在12 h和24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),取出細(xì)胞,甲醇固定細(xì)胞30 min,PBS洗滌3次,使用0.3% Triton X-100通透細(xì)胞10 min,PBS洗滌3次后,山羊血清封閉30 min,每孔加入500 μL 稀釋后的FIPV N特異性抗體(稀釋比為1∶200),4 ℃ 孵育過(guò)夜,PBS洗滌3次后,加入FITC標(biāo)記的HRP-Goat Anti-Rabbit IgG(稀釋比為1∶200),PBS洗滌細(xì)胞三次,使用DAPI染色5 min后,在倒置熒光顯微鏡下,觀察細(xì)胞的熒光結(jié)果并拍照記錄,分析熒光情況。轉(zhuǎn)染EGFP-mRNA的細(xì)胞樣本放置于37 ℃ 5%的CO2孵箱內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng),在12和24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),將細(xì)胞放置于倒置熒光顯微鏡下,樣品暴露在藍(lán)色激發(fā)光下,直接觀察EGFP蛋白的表達(dá)情況,并拍照記錄。

    1.2.8 Western blot試驗(yàn)

    將上述轉(zhuǎn)染FIPV N-mRNA的細(xì)胞樣本放置于37 ℃ ,5%的CO2孵箱內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng),在12和24 h,提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白,BCA法檢測(cè)蛋白濃度后,添加5 ×SDS-PAGE Sample Loading Buffe混勻。100 ℃金屬浴,3 min熱變性蛋白樣品,100 V電壓下進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳結(jié)束后在120 A的恒定電流下采取“三明治夾心”的模式將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,配制封閉液(5%的脫脂牛奶)室溫?fù)u床封閉2 h,TBST漂洗三次,每次10 min,加入兔源性FIPV N單克隆抗體,4 ℃搖床過(guò)夜孵育,TBST漂洗10 min,重復(fù)3次,加入HRP-Goat Anti-Rabbit IgG抗體,室溫?fù)u床孵育 1 h后,TBST漂洗10 min,重復(fù)3次。在蛋白成像曝光系統(tǒng)上進(jìn)行蛋白的顯色操作并拍照分析。

    1.2.9 動(dòng)物試驗(yàn)方案

    將6~8周齡,體重為15~18 g的BALB/C雌性小鼠隨機(jī)分為3組,每組3只小鼠。試驗(yàn)組使用商業(yè)化的活體轉(zhuǎn)染試劑GoldenTran-mV+FIPV N-mRNA(20 μg)分三次肌肉注射免疫小鼠,每次間隔10 d。兩組對(duì)照組分別為裸mRNA對(duì)照組(20 μg)和葡萄糖對(duì)照組。在初次免疫的第12、24、36天取小鼠下頜靜脈血,檢測(cè)血清中的FIPV N的抗體濃度,IL-4和TNF-α的含量,具體試驗(yàn)步驟參考相關(guān)ELISA試劑盒。免疫完成后處死小鼠,分離小鼠脾細(xì)胞檢測(cè)脾細(xì)胞中IFN-γ的含量,具體試驗(yàn)步驟參考小鼠IFN-γ Elispot試劑盒。

    1.2.10 數(shù)據(jù)分析

    使用GraphPad Prism Version 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,通過(guò)學(xué)生t檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析。當(dāng) P 值小于 0.05 時(shí),所有檢驗(yàn)均被接受為具有統(tǒng)計(jì)顯著性。

    2 結(jié) 果

    2.1 mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體的設(shè)計(jì)

    mRNA疫苗需要具備與生物體內(nèi)天然存在的mRNA結(jié)構(gòu)相似的特征,包括在抗原蛋白的兩端具有非編碼序列(untranslated regions,UTR區(qū)域)、信號(hào)肽序列、5′端帽子結(jié)構(gòu)和3′短Poly A尾部[16]。因此,在設(shè)計(jì)mRNA序列的設(shè)計(jì)時(shí),除了對(duì)抗原序列的優(yōu)化外,選擇合適的非編碼序列、信號(hào)肽序列和Poly A尾部,對(duì)于mRNA抗原蛋白的表達(dá)至關(guān)重要,設(shè)計(jì)并構(gòu)建了如下圖1A所示mRNA序列元件。隨后,將構(gòu)建好的序列克隆到含有T7啟動(dòng)子的pBluescript II KS(+)載體上,從而構(gòu)建出mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體。

    2.2 抗原序列的優(yōu)化

    為了提高抗原蛋白的表達(dá)效率,基于宿主內(nèi)密碼子的偏好性,GC的含量和mRNA序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)的自由能等因素,對(duì)FIPV N蛋白的基因序列進(jìn)行了人源性的優(yōu)化,優(yōu)化結(jié)果如圖2所示:通過(guò)對(duì)FIPV N基因序列進(jìn)行優(yōu)化,密碼子的適應(yīng)性明顯提高,從原先的0.46增加至0.83。同時(shí),GC的含量也顯著提高,從43.39%提高至52.96%。此外,在mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)中,可替換區(qū)減少,優(yōu)化前的鍵能為-199.25 kJ·mol-1,經(jīng)優(yōu)化后降低為-215.99 kJ·mol-1(圖2)。

    2.3 EGFP的體外擴(kuò)增、酶切、純化

    為了獲得EGFP基因,以本實(shí)驗(yàn)室保存的pUC57-EGFP質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后的EGFP基因在瓊脂糖凝膠電泳中顯示(圖3A泳道1),可見(jiàn)明顯的條帶,大小在700 bp。隨后,將EGFP基因雙酶切和純化,瓊脂糖凝膠試驗(yàn)的結(jié)果顯示(如圖3A泳道2所示),泳道上條帶單一,無(wú)雜帶產(chǎn)生,表明成功擴(kuò)增出EGFP基因序列。

    2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

    pBluescript II KS(+)-FIPV N重組質(zhì)粒雙酶切的結(jié)果如圖3B所示,其被切割成兩部分,一部分是FIPV N基因序列,位于約1 000 bp附近,另一部分是mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體,位于3 000 bp附近。圖3C展示了重組質(zhì)粒pBluescript II KS(+)-FIPV N和pBluescript II 在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中擴(kuò)大培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)化結(jié)果和重組質(zhì)粒的線性化單酶切的結(jié)果,圖3D是制備轉(zhuǎn)錄的EGFP-mRNA和FIPV N-mRNA。

    A. EGFP基因的體外擴(kuò)增,雙酶切后的純化的瓊脂糖凝膠圖(泳道1:EGFP基因的體外擴(kuò)增,泳道2:EGFP基因雙酶切后純化);B. 重組質(zhì)粒 pBluescript II KS(+)-FIPV N雙酶切的凝膠電泳圖(泳道1),膠回收的mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體的瓊脂糖凝膠電泳圖(泳道2);C. 重組質(zhì)粒的抽提及線性化單酶切的瓊脂糖凝膠圖[泳道1:pBluscript lI KS(+)-EGFP質(zhì)粒;泳道2:pBluscript I KS(+)-FIPV N質(zhì)粒;泳道3:?jiǎn)蚊盖械膒Bluscript II KS(+)-FIPV;泳道4:?jiǎn)蚊盖械膒Bluscript Il KS(+)-EGFP];D. 體外轉(zhuǎn)錄的EGFP-mRNA和FIPV N-mRNA瓊脂糖凝膠圖(泳道1:EGFP-mRNA;泳道2:FIPV N-mRNA)

    A. In vitro amplification of the EGFP gene, purified agarose gel after double digestion (lane 1: in vitro amplification of the EGFP gene, lane 2: purification after double digestion of the EGFP gene); B. Agarose gel electropherogram of double digestion of the pBluescript II KS(+)-FIPV N recombinant plasmid (lane 1), agarose gel electropherogram of gel-recovered mRNA transcription vector in vitro (lane 2); C. Extraction of recombinant plasmids and linearized agarose gel plots of single digestion (Lane 1: pBluscript lI KS(+)-EGFP plasmid; Lane 2: pBluscript I KS(+)-FIPV N plasmid; Lane 3: Single enzyme digested pBluscript II KS(+)-FIPV; Lane 4: Single enzyme cleaved pBluscript Il KS(+)-EGFP); D. In vitro transcribed EGFP-mRNA and FIPV N-mRNA agarose gel plots (lane 1:EGFP-mRNA; lane 2:FIPV N-mRNA)

    圖3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

    Fig.3 Construction and identification of recombinant plasmids

    2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)和Western blot試驗(yàn)

    將重組質(zhì)粒單酶切為線性后,以線性化的重組質(zhì)粒為模板,經(jīng)過(guò)模板純化、體外轉(zhuǎn)錄、LiCl純化mRNA、mRNA加帽純化成功制備出EGFP-mRNA和FIPV N-mRNA,結(jié)果如圖4所示,兩種mRNA轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞12~24 h,倒置熒光顯微鏡下看到試驗(yàn)組中大量綠色熒光蛋白的表達(dá),Control組未觀測(cè)到熒光信號(hào)。證明該體系制備的EGFP-mRNA能在細(xì)胞體內(nèi)產(chǎn)生大量抗原序列蛋白,且EGFP蛋白表達(dá)狀況良好。

    使用FIPV N特異性抗體進(jìn)行Western blot試驗(yàn),結(jié)果顯示293T細(xì)胞成功表達(dá)出FIPV N 蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為46 ku(圖5),與預(yù)期條帶相符合。

    2.6 細(xì)胞間接免疫熒光試驗(yàn)

    細(xì)胞間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示:將上述步驟中制備FIPV N-mRNA轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞12~24 h后,在倒置熒光顯微鏡下,試驗(yàn)組觀察到大量綠色熒光信號(hào)的表達(dá),而陰性對(duì)照組則未觀察到含有FIPV N蛋白的熒光信號(hào)。結(jié)果表明,成功實(shí)現(xiàn)了FIPV N蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)。進(jìn)一步觀察顯示,F(xiàn)IPV N蛋白定位在細(xì)胞的胞質(zhì)中

    2.7 小鼠血清中的特異性抗體的檢測(cè)細(xì)胞因子的變化

    ELISA試驗(yàn)檢測(cè)了三組小鼠中血清中FIPV N特異性抗體、IL-4和TNF-α的含量,并觀察了免疫過(guò)程中的變化,ELISA結(jié)果顯示(見(jiàn)圖7B、C),試驗(yàn)組FIPV N特異性抗體水平及IL-4、TNF-α的含量顯明顯高于裸mRNA對(duì)照組和葡萄糖對(duì)照組,此外,在試驗(yàn)組中隨著加強(qiáng)免疫的接種,F(xiàn)IPV N特異性抗體的水平及IL-4、TNF-α的含量也逐漸增加,這表明試驗(yàn)組小鼠在FIPV N-mRNA進(jìn)入細(xì)胞表達(dá)FIPV N蛋白后,有效激發(fā)了小鼠體液免疫反應(yīng)應(yīng)答,而裸mRNA對(duì)照組和葡萄糖對(duì)照組在抗體水平、細(xì)胞因子(IL-4和TNF-α)的含量方面,則無(wú)顯著性差異,隨著免疫接種的加強(qiáng),這些指標(biāo)也無(wú)顯著性變化。

    2.8 小鼠脾細(xì)胞中的IFN-γ含量的檢測(cè)

    Elispot試驗(yàn)結(jié)果顯示了在免疫接種完成后,三組小鼠脾細(xì)胞內(nèi)IFN-γ的含量的差異。如圖6D所示與對(duì)照組相比,接種量GoldenTran-mV+FIPV N-mRNA(10 μg)的試驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞內(nèi)IFN-γ的分泌水平顯著增加,而裸mRNA對(duì)照組脾細(xì)胞中IFN-γ的含量雖然高于葡萄糖對(duì)照組,但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明試驗(yàn)組使用商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑遞送的FIPV N-mRNA成功進(jìn)入小鼠的細(xì)胞內(nèi),并有效誘發(fā)了細(xì)胞免疫應(yīng)答。

    3 討 論

    貓傳染性腹膜炎病毒屬于有包膜的RNA冠狀病毒,貓的任何年齡段均可感染此病毒,可嚴(yán)重危害貓群的健康[17]。本文選擇以貓冠狀病毒(feline coronavirus,F(xiàn)CoV)作為mRNA疫苗的研究對(duì)象,一方面是因?yàn)槭袌?chǎng)急需一種有效預(yù)防貓傳染性腹膜炎病毒的疫苗,另一方面由于冠狀病毒基因的相似性也可以作為一種通用型病毒探索傳染性病毒的mRNA疫苗的設(shè)計(jì)和制備[18]。

    與傳統(tǒng)研發(fā)的FIPV減毒疫苗和腺病毒疫苗相比,mRNA疫苗不會(huì)存在病毒基因整合到機(jī)體基因組的風(fēng)險(xiǎn),mRNA疫苗制備在應(yīng)對(duì)暴發(fā)性動(dòng)物急性疫病中,更為迅速和安全,生產(chǎn)成本更加低廉[19]。與重組亞單位疫苗相比,mRNA序列直接傳遞病毒的遺傳信息,快速高效的激活免疫系統(tǒng),具有更高的保護(hù)性[20]。目前市場(chǎng)上還未有安全有效的貓傳染性腹膜炎疫苗,在過(guò)去的20年來(lái),基于傳統(tǒng)技術(shù)開發(fā)的改良鼻內(nèi)活疫苗,重組蛋白多肽疫苗和異源活冠狀病毒接種疫苗,其保護(hù)效果并不理想,甚至?xí)?dǎo)致疾病的抗體增強(qiáng)效應(yīng)[21-23]。先前的研究表明刺突蛋白上存在抗體中和表位,引起較低的特異性中和抗體水平,促進(jìn)了白細(xì)胞對(duì)FCoV的Fc受體介導(dǎo)入胞作用,導(dǎo)致了ADE的產(chǎn)生和早期死亡綜合征的發(fā)展。因此,刺突蛋白不適應(yīng)于FCoV疫苗的抗原[24-25]。

    N蛋白是冠狀病毒中結(jié)構(gòu)最為豐富的蛋白,在FIPV感染的不同階段均穩(wěn)定表達(dá),具有較高的序列相似性,使其成為疫苗研發(fā)的理想選擇[26]。目前核衣殼蛋白基因已經(jīng)被廣泛研究用于FIPV疫苗的研發(fā)和FIP的治療,有研究報(bào)道,用桿狀病毒表達(dá)N蛋白的細(xì)胞裂解物進(jìn)行動(dòng)物免疫,可有效預(yù)防FIPV的進(jìn)展,而不會(huì)誘導(dǎo)貓的ADE[10]。有些研究小組設(shè)計(jì)了針對(duì)FIPV N蛋白的小干擾RNA,即使在最低濃度下,也可以有效抑制FIPV的復(fù)制,減輕癥狀的產(chǎn)生,減緩病程的進(jìn)展[27]。

    因此,本部分研究中選取了貓傳染性腹膜炎的核衣殼蛋白作為誘發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)的抗原,構(gòu)建了pBluscript Ⅱ KS(+)-EGFP和pBluscript Ⅱ KS(+)-FIPV N重組質(zhì)粒,利用體外轉(zhuǎn)錄技術(shù),成功制備出了EGFP-mRNA和FIPV N-mRNA。通過(guò)體內(nèi)體外試驗(yàn)驗(yàn)證,mRNA能夠成功在293T細(xì)胞中表達(dá)相應(yīng)的蛋白,證明了體外轉(zhuǎn)錄載體框架的可行性。隨后進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)疫苗的免疫原性的驗(yàn)證,結(jié)果表明FIPV N-mRNA疫苗進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后能很好的引起細(xì)胞的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。在病毒感染的早期階段,由于機(jī)體對(duì)病毒反應(yīng)較弱,機(jī)體的體液反應(yīng)及早應(yīng)答,病毒與抗體形成的復(fù)合物被白細(xì)胞上的特異性受體識(shí)別,促進(jìn)了病毒的入胞過(guò)程,引起嚴(yán)重的臨床癥狀[27-29]。隨著免疫的提高和改善,細(xì)胞免疫應(yīng)答啟動(dòng),臨床癥狀將逐步減輕[3]。因此FIP進(jìn)展和嚴(yán)重情況,與機(jī)體在早期感染中是否及時(shí)啟動(dòng)細(xì)胞免疫有關(guān)。若是細(xì)胞免疫能夠在早期及時(shí)激活,并且足夠強(qiáng)大,則會(huì)延緩病情的進(jìn)展。mRNA疫苗的作用機(jī)制是快速表達(dá)抗原蛋白,以激發(fā)機(jī)體強(qiáng)大的細(xì)胞免疫和體液免疫[16,29-30]。已經(jīng)有部分研究證明選擇N蛋白作為免疫原能避免FIPV的ADE效應(yīng),但是在此次研究中,由于試驗(yàn)條件和時(shí)間的限制,后續(xù)動(dòng)物體內(nèi)的攻毒試驗(yàn)未能驗(yàn)證,在后續(xù)的試驗(yàn)計(jì)劃中將重點(diǎn)研究疫苗的保護(hù)性和是否引起機(jī)體的ADE效應(yīng)。

    4 結(jié) 論

    體外轉(zhuǎn)錄載體構(gòu)建的FIPV N-mRNA在體外轉(zhuǎn)染至細(xì)胞后,能成功在細(xì)胞體內(nèi)有效表達(dá)FIPV N蛋白,在遞送系統(tǒng)的輔助下成功遞送到動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)后能夠有效引起動(dòng)物體內(nèi)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng),具有較強(qiáng)的免疫原性,以核衣殼蛋白作抗原的mRNA疫苗有望成為貓傳染性腹膜炎的候選疫苗,mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體的設(shè)計(jì)與構(gòu)建為傳染性疾病mRNA疫苗序列的設(shè)計(jì)提供一定的參考價(jià)值。

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    (編輯 白永平)

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