B亞型禽偏肺病毒B1分離株感染性克隆的構(gòu)建與鑒定

摘 要：

B亞型禽偏肺病毒（avian metapneumovrus， aMPV）可引起雞腫頭綜合征，造成免疫抑制，引發(fā)嚴(yán)重的繼發(fā)感染并導(dǎo)致雞生產(chǎn)性能下降。建立國(guó)內(nèi)aMPV分離株的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)對(duì)病毒研究及開(kāi)發(fā)針對(duì)性疫苗具有重要意義。將病毒基因組擴(kuò)增片段分別測(cè)序，通過(guò)序列拼接獲得了完整的aMPV B1分離株基因組序列。根據(jù)病毒基因組序列中的酶切位點(diǎn)，將基因組分4段依次連入pTH載體，獲得病毒基因組質(zhì)粒pTH-B1。在病毒基因組的第7 474位引入同義突變，沉默原有Sal Ⅰ酶切位點(diǎn)以作為遺傳標(biāo)記，在pTH-B1質(zhì)粒M與F基因之間引入PmeⅠ酶切位點(diǎn)，并利用該位點(diǎn)插入EGFP基因，獲得質(zhì)粒pTH-B1EGFP。將病毒N、P、M2.1基因的表達(dá)盒共同克隆到pCI-Neo表達(dá)載體中，獲得輔助質(zhì)粒pCI-NPM2.1。將L基因單獨(dú)克隆到pCI-Neo表達(dá)載體中，獲得輔助質(zhì)粒pCI-L。將pTH-B1質(zhì)粒和pTH-B1EGFP質(zhì)粒分別與兩種輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR/T7細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞與Vero細(xì)胞共培養(yǎng)并連續(xù)傳代。結(jié)果顯示：通過(guò)細(xì)胞病變（CPE）和綠色熒光觀察，以及N基因和遺傳標(biāo)記檢測(cè)、間接免疫光試驗(yàn)（IFA）和Western blot共同驗(yàn)證，表明構(gòu)建的rB1株和rB1-EGFP株拯救成功。rB1株和rB1-EGFP株與親本毒株的增殖水平和趨勢(shì)相似。本研究通過(guò)三質(zhì)粒拯救系統(tǒng)獲得了B亞型aMPV B1株的感染性克隆，M和F基因間的非編碼區(qū)可插入基因表達(dá)序列，為進(jìn)一步探究B亞型aMPV的致病機(jī)理和疫苗研發(fā)奠定了必要基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：

B亞型禽偏肺病毒；感染性克??；三質(zhì)粒；病毒拯救

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.659.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A """"文章編號(hào)： 0366-6964（2025）02-0788-15

收稿日期：2024-04-07

基金項(xiàng)目：青島市科技惠民示范專項(xiàng)項(xiàng)目（23-2-8-xdny-14-nsh）

作者簡(jiǎn)介：于澤坤（1988-），男，山東青島人，博士生，主要從事家禽疫苗研究，E-mail： zekun_yu@qq.com

*通信作者：宋勤葉，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail： songqinye@126.com；李 彥，主要從事動(dòng)物疫病防控研究，E-mail： liyanqd2008@163.com

Construction and Identification of Infectious Clone of the Avian Metapneumovirus of Subtype B Strain B1

YU" Zekun1，2， JIANG" Chengyuan2， YUAN" Hongxing3， ZHOU" Sheng2， DUAN Xiaoxiao4， LI Yan4*， SONG" Qinye1*

（1.College of Veterinary Medicine， Hebei Agricultural University， Baoding 071000，China;

2.Shandong Sinder Technology Co.， LTD， Weifang 262200，China;

3.Agriculture and Rural Bureau of Guantao County， Handan City， Hebei province， Guantao 057750，China；

4. Qingdao Animal Disease Prevention and Control Center， Qingdao 266100， China）

Abstract：

Avian metapneumovirus （aMPV） subtype B is associated with the development of swollen head syndrome in chickens， which can lead to immunosuppression， severe secondary infections， and a subsequent decline in the productive performance of the poultry. The establishment of a reverse genetics system for domestic aMPV isolates is of considerable significance for advancing virological research and facilitating the development of targeted vaccines. The amplicons of the viral genome were sequenced individually， and the complete genome sequence of the aMPV B1 strain was deduced through sequence assembly. The genome was divided into four segments based on enzyme cleavage sites and sequentially inserted into the pTH vector to construct the viral genome plasmid pTH-B1. A synonymous mutation introduced at position 7 474 of the viral genome to silence the Sal I cleavage site as a genetic marker. A Pme I cleavage site was introduced between the M and F genes of the pTH-B1 plasmid， and the EGFP expression cassette was inserted using this site to obtain the plasmid pTH-B1EGFP. The expression cassettes of the viral N， P， and M2.1 genes were co-cloned into the pCI-Neo expression vector， yielding the auxiliary plasmid pCI-NPM2.1. The L gene was individually cloned into the pCI-Neo expression vector， yielding the auxiliary plasmid pCI-L. The pTH-B1 and pTH-B1EGFP plasmids were co-transfected with the two auxiliary plasmids into BSR/T7 cells， respectively. Subsequently， the transfected cells were co-cultured with Vero cells and continuously passaged for further analysis. The successful rescue of the rB1 and rB1-EGFP strains was confirmed through the observation of cytopathic effects （CPE） and green fluorescence， along with the detection of vrial N gene and genetic marker， indirect immunofluorescence assay （IFA） and Western blot. The proliferation levels and trends of the rB1 and rB1-EGFP strains were found to be similar to those of the parental virus strain. This study successfully obtained the infectious clone of the subtype B avian metapneumovirus B1 strain using a three-plasmid rescue system. The intergenic non-coding region between the M and F genes is capable of accommodating gene expression sequences， which lays a necessary foundation for further investigation into the pathogenesis of subtype B aMPV and the development of vaccines.

Key words： avian metapneumovirus subtype B; infectious clone; a three-plasmid rescue system; viral rescue

*Corresponding author：" SONG Qinye， E-mail： songqinye@126.com；LI" Yan， E-mail：liyanqd2008@163.com

禽偏肺病毒（avian metapneumovrus， aMPV）可感染多種禽類(lèi)，雞與火雞是其主要的易感宿主［1］。aMPV引起雞腫頭綜合征（swollen head syndrome， SHS），易引發(fā)繼發(fā)感染導(dǎo)致產(chǎn)蛋及增重等生產(chǎn)性能下降，造成養(yǎng)禽業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［2］。1978年南非首先分離到aMPV，隨后歐洲、美洲及亞洲相繼有aMPV流行的報(bào)道［3-8］。我國(guó)針對(duì)aMPV的研究起步較晚，于1999年首次完成aMPV的鑒定。aMPV分為A、B、C、D四個(gè)亞型。B亞型aMPV是歐洲的流行毒株，隨后流行范圍擴(kuò)大至亞洲及美洲。近年我國(guó)陸續(xù)有分離到B和C亞型aMPV毒株的報(bào)道［9-15］。針對(duì)膠東、東北、華北以及部分南方地區(qū)的血清學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)雞群aMPV血清陽(yáng)性率高，部分場(chǎng)區(qū)的陽(yáng)性率達(dá)到100%［16-19］。相對(duì)于血清學(xué)調(diào)查的高陽(yáng)性率，aMPV病原檢出率較低。2020年我國(guó)南方多個(gè)省份總體檢出率僅為2.67%，其中B亞型毒株的占比高于其它亞型［20］。病毒的低檢出率導(dǎo)致病料采集難度增加，使得病毒分離成功率始終維持在較低水平。

B亞型aMPV分布廣泛，但病毒基因的整體突變水平較低，未發(fā)現(xiàn)因疫苗的使用而發(fā)生明顯的毒株免疫逃逸現(xiàn)象［21］。我國(guó)B亞型分離毒株與歐洲毒株屬于同一分支［22-23］。國(guó)內(nèi)分離毒株對(duì)SPF雞、商品肉雞和蛋雞均有致病性，表現(xiàn)為精神萎靡、甩頭撓鼻和流涕癥狀。通過(guò)呼吸道排毒的周期約為一周，鼻甲骨、氣管和肺部均表現(xiàn)出不同程度的炎癥反應(yīng)［11，24-26］。血液及免疫器官的監(jiān)測(cè)結(jié)果說(shuō)明病毒感染造成一定程度的免疫抑制現(xiàn)象［27］。

aMPV為不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA囊膜病毒，屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）肺炎病毒亞科（Pneumoviridae）偏肺病毒屬（Metapneumovirus）成員。B亞型aMPV基因組全長(zhǎng)約13.5 kb，自基因組3′端起依次編碼核衣殼蛋白（nucleocapsid， N）、磷蛋白（phosphoprotein， P）、基質(zhì)蛋白（matrix， M）、融合蛋白（fusion protein， F）、基質(zhì)蛋白2（matrix2， M2）、小疏水蛋白（small hydrophobic protein， SH）、吸附蛋白（attachment glycoprotein， G）和聚合酶蛋白（large polymerase， L），其中M2通過(guò)RNA編譯機(jī)制同時(shí)編碼M2.1和M2.2兩個(gè)蛋白［28］。病毒囊膜上含有M、F、SH和G四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，N、P、M2.1和L包裹病毒負(fù)鏈RNA基因組，形成核糖核蛋白復(fù)合體（ribonucleoprotein， RNP）。裸露的病毒RNA不具有感染性，RNP是病毒進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的基本單元。B亞型毒株F蛋白可在跨膜絲氨酸蛋白酶作用下完成蛋白剪切，與細(xì)胞整合素αvβ1結(jié)合，介導(dǎo)完成膜融合，將RNP釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)起始病毒復(fù)制進(jìn)程［29-30］。

目前，我國(guó)aMPV感染呈現(xiàn)擴(kuò)大化和復(fù)雜化趨勢(shì)。但由于缺乏可參考的病毒樣本，無(wú)法通過(guò)宏觀比對(duì)分析推測(cè)病毒特性，直接限制了病毒的研究進(jìn)程。反向遺傳學(xué)技術(shù)可從病毒基因?qū)用鎸?duì)病毒進(jìn)行改造，探究這些改變對(duì)病毒結(jié)構(gòu)功能、與宿主互作及感染免疫等的影響，是重要的病毒研究工具。目前國(guó)內(nèi)缺少與流行毒株對(duì)應(yīng)的反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)，因此本研究旨在構(gòu)建針對(duì)國(guó)內(nèi)B亞型aMPV毒株的感染性克隆，為進(jìn)一步探究aMPV的致病機(jī)理和開(kāi)發(fā)疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒與細(xì)胞

2022年，內(nèi)蒙古赤峰市某雞場(chǎng)80日齡蛋雞出現(xiàn)疑似aMPV感染癥狀，鼻咽拭子經(jīng)RT-PCR檢測(cè)確定aMPV陽(yáng)性。取陽(yáng)性拭子經(jīng)處理后，接種到Vero細(xì)胞并連續(xù)盲傳5代，獲得了分離毒株。經(jīng)對(duì)分離毒株的N（GenBank ID： PP999757）、F（GenBank ID： PP999759）和G（GenBank ID： PP999758）蛋白基因序列及遺傳進(jìn)化樹(shù)分析，確定分離毒株為B亞型aMPV，將其命名為B1株。毒株的TCID50為105.2·0.1 mL-1。BSR/T7細(xì)胞由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心蔣文明博士饋贈(zèng)，Vero細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 載體與菌株

pCI-Neo和pTH質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.3 主要試劑和試劑盒

雞源禽偏肺病毒B1株抗血清和鼠源禽偏肺病毒B1株N蛋白抗血清，由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；高保真PCR酶、反轉(zhuǎn)錄試劑和無(wú)縫克隆連接試劑，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；GenJetTM plus細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，購(gòu)自SignaGen Laboratories公司。一步法RT-PCR試劑盒、一步法RT-qPCR熒光定量試劑盒以及5′/3′RACE試劑盒，購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒、膠回收試劑盒、病毒RNA提取試劑盒，購(gòu)自O(shè)MEGA廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司。引物及基因合成由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.4 禽偏肺病毒B1株全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒的構(gòu)建

應(yīng)用Snapgene7軟件比對(duì)aMPV B亞型毒株LN16株（GenBank ID： MH745147）、Hungary/657/4株（GenBank ID： MN729604）和VCO3/60616株（GenBank ID： AB548428）的全基因組序列，在基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，使用RACE方法獲得病毒基因組3′和5′端的末端序列，分5段PCR擴(kuò)增獲得病毒剩余基因組片段，拼接所有擴(kuò)增片段獲得基因組序列。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)質(zhì)粒構(gòu)建引物（表1）。如圖1所示，將病毒cDNA分為A～D四個(gè)片段，以FAF/R和FDF/R為引物擴(kuò)增獲得A和D片段，通過(guò)無(wú)縫連接將A和D片段引入到線性化的pTH低拷貝質(zhì)粒中。利用XhoⅠ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶線性化已克隆A和D片段的重組質(zhì)粒，使用FBF/R和FCF/R引物經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得B和C片段，并引入到重組質(zhì)粒中。克隆B和C片段的過(guò)程中，利用B和C引物的同源臂序列完成病毒基因組第7 474 nt U→C的同義突變，消除基因組中原有的SalⅠ酶切位點(diǎn)以作為拯救毒株遺傳標(biāo)記，經(jīng)測(cè)序分析，將序列正確的質(zhì)粒命名為pTH-B1。

如圖2所示，以pTH-B1質(zhì)粒為模板，用引物B1-PmeⅠ 1F/1R和B1-PmeⅠ 2F/2R分兩段擴(kuò)增pTH-B1質(zhì)粒片段，利用無(wú)縫連接試劑完成片段環(huán)化連接，在病毒M和F基因之間的間隔區(qū)域引入特異性的Pme Ⅰ酶切位點(diǎn)，所得質(zhì)粒命名為pTH-B1Pme Ⅰ。使用B1-EGFPF/R引物擴(kuò)增EGFP基因序列，并將其引入到經(jīng)Pme Ⅰ酶切線性化的pTH-B1Pme Ⅰ質(zhì)粒中，使用EGFP基因檢測(cè)F/R引物經(jīng)PCR驗(yàn)證基因片段連接的正確性，同時(shí)進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pTH-B1EGFP。

1.5 輔助質(zhì)粒及微基因組質(zhì)粒的構(gòu)建

如圖3A所示，以pTH-B1質(zhì)粒為模板，分別將病毒N、P及M2.1基因開(kāi)放閱讀框（open reading frame， ORF）序列引入到pCI-Neo質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建pCI-N、pCI-P和pCI-M2.1表達(dá)質(zhì)粒。用BamH Ⅰ消化pCI-M2.1質(zhì)粒使其線性化，分別以NPM2.1-NF/R和NPM2.1-PF/R為引物，將pCI-N、pCI-P質(zhì)粒中的基因表達(dá)盒序列引入到pCI-M2.1質(zhì)粒中，構(gòu)成輔助質(zhì)粒pCI-NPM2.1。如圖3B所示，用LF/R引物擴(kuò)增病毒L基因ORF序列引入到經(jīng)EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切線性化的pCI-Neo質(zhì)粒中，構(gòu)成輔助質(zhì)粒pCI-L。如圖3C所示，通過(guò)基因合成方法，在EGFP基因兩側(cè)分別引入與B1株相同非翻譯區(qū)序列，將此EGFP修飾序列引入pTH質(zhì)粒中，構(gòu)成微基因組質(zhì)粒pTH-miniG。上述構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)酶切驗(yàn)證后送生工公司測(cè)序。

1.6 輔助質(zhì)粒的表達(dá)鑒定

將BSR/T7細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%以上時(shí)參照GenJetTM plus質(zhì)粒轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染pTH-miniG質(zhì)粒1 μg；pCI-NPM2.1質(zhì)粒1.5 μg；pCI-L質(zhì)粒1 μg。設(shè)置僅轉(zhuǎn)染pTH-miniG質(zhì)?；騪CI-NPM2.1和pCI-L輔助質(zhì)粒的對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后48 h，熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光。

1.7 病毒拯救

將BSR/T7細(xì)胞接種到6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%以上時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。將pTH-B1/pTH-B1EGFP質(zhì)粒4 μg、pCI-NPM2.1質(zhì)粒2.5 μg、pCI-L質(zhì)粒1.25 μg同時(shí)轉(zhuǎn)染BSR/T7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用胰酶消化轉(zhuǎn)染細(xì)胞與Vero細(xì)胞，并將細(xì)胞混合接種于細(xì)胞瓶?jī)?nèi)；待細(xì)胞匯合度超過(guò)90%后，更換為含有1%胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）的高糖DMEM維持液，培養(yǎng)5～7 d后，收獲培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，1 000 r·min-1離心10 min；收集上清液接種于匯合度超過(guò)90%的Vero細(xì)胞，加入維持液，繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d。按相同方法在Vero細(xì)胞上連續(xù)盲傳直至出現(xiàn)細(xì)胞病變（cytopathic effect， CPE），收獲拯救毒株，分別命名為rB1和rB1-EGFP。對(duì)于rB1-EGFP（EGFP標(biāo)記）毒株，直接在熒光倒置顯微下觀察細(xì)胞熒光，并連續(xù)傳代至F15代，以驗(yàn)證EGFP標(biāo)記的穩(wěn)定性。

1.8 拯救毒株的鑒定

1.8.1 RT-PCR

取B1、rB1及rB1-EGFP毒株分別感染Vero細(xì)胞，待出現(xiàn)CPE后收取細(xì)胞上清液，提取病毒RNA。以pCI-NPM2.1質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，使用N基因檢測(cè)F/R引物（表2），通過(guò)一步法RT-PCR方法擴(kuò)增N基因片段。用SalⅠ檢測(cè)F/R引物經(jīng)PCR擴(kuò)增含有遺傳標(biāo)記的核酸片段，然后用SalⅠ限制性內(nèi)切酶消化擴(kuò)增的片段，通過(guò)片段數(shù)量區(qū)分拯救毒株及其親本毒株。進(jìn)一步對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)遺傳標(biāo)記的正確性。

1.8.2 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）

將B1株及rB1株分別接種到Vero細(xì)胞上，培養(yǎng)4 d后用4%甲醛溶液固定細(xì)胞；用4%脫脂奶封閉1 h；加入雞抗aMPV B1株抗血清（一抗，1∶500）孵育1 h后沖洗細(xì)胞；加入Alexa Flour 488標(biāo)記的驢抗雞IgY熒光抗體（二抗，1∶200），避光孵育1 h后沖洗細(xì)胞并封片，于熒光倒置顯微鏡下觀察熒光。

1.8.3 Western blot

將B1株、rB1株和rB1-EGFP株分別感染Vero細(xì)胞，培養(yǎng)4 d；同時(shí)設(shè)立正常細(xì)胞對(duì)照。收取接毒細(xì)胞和正常細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞；取裂解上清液加入等體積的2×蛋白上樣緩沖液并在沸水中加熱15 min；取上清液加入到12%聚丙烯酰胺變性電泳預(yù)制膠各孔內(nèi)進(jìn)行SDS-PAGE，每孔上樣20 μL，140 V電泳45 min。通過(guò)半干轉(zhuǎn)膜儀將膠中的蛋白條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜上；將PVDF膜浸沒(méi)于4%脫脂奶封閉1 h；加入鼠抗aMPV B1株N蛋白抗血清（一抗，1∶500）孵育1 h，洗膜；加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（二抗，1∶5 000），室溫孵育1 h；洗膜，加入DAB顯色液顯色，觀察特異性反應(yīng)條帶。

1.9 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

取B1株、rB1株以及rB1-EGFP株（0.1 MOI）分別感染Vero細(xì)胞，設(shè)立空細(xì)胞對(duì)照。于孵育24、48、72、96、120和144 h時(shí)收取400 μL上清液，提取病毒RNA。用qB1-probe探針和qB1F/R引物（表2）通過(guò)一步法RT-qPCR方法測(cè)定不同時(shí)間的病毒拷貝數(shù)，繪制病毒生長(zhǎng)曲線，比較不同毒株的增殖水平。

2 結(jié) 果

2.1 B1株基因組全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒的鑒定

通過(guò)RACE方法獲得了B1株基因組3′端約1 900 bp和5′端約1 700 bp的末端片段（圖4A）。通過(guò)RT-PCR方法分5段擴(kuò)增，得到病毒剩余的基因組序列（圖4B）。將擴(kuò)增的7個(gè)片段經(jīng)測(cè)序和拼接后獲得了全長(zhǎng)13 516 nt的B1株基因組序列。該序列與B亞型參考毒株的基因組結(jié)構(gòu)一致，各蛋白的編碼區(qū)（coding sequence region， CDS）序列堿基數(shù)相同。但G蛋白含413個(gè)氨基酸殘基（amino acid residue， aa），比參考毒株少1個(gè)aa。這是由于G蛋白基因的1 240位存在的C→U突變使蛋白翻譯提前一位終止，導(dǎo)致在羧基端缺失一谷氨酰胺殘基（圖5）。雖然B1株與參考毒株各個(gè)基因CDS序列堿基數(shù)一致，但基因組堿基總數(shù)不同。各個(gè)毒株之間的差異存在于基因間隔區(qū)域。在基因間隔區(qū)存在不同程度的堿基突變、插入和缺失（圖6）。

用XhoⅠ和NotⅠ雙酶切pTH-B1質(zhì)粒，得到11 646 bp和5 279 bp的片段；經(jīng)KpnⅠ和MluⅠ雙酶切，得到10 594 bp和6 331 bp的片段；經(jīng)MluⅠ和NotⅠ雙酶切，得到13 679 bp和3 246 bp的片段，質(zhì)粒酶切結(jié)果均與預(yù)期相符（圖7A），測(cè)序結(jié)果顯示構(gòu)建的B1株基因組全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒序列完全正確。

質(zhì)粒pTH-B1PmeⅠ經(jīng)NotⅠ和PmeⅠ雙酶切可得到10 741 bp和6 218 bp的片段，經(jīng)MluⅠ和PmeⅠ雙酶切得到13 987 bp和2 972 bp的片段（圖7B）。進(jìn)一步測(cè)序證明插入的基因序列完全正確。pTH-B1EGFP質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定獲得約730 bp的片段，片段長(zhǎng)度符合預(yù)期（圖7C）。序列測(cè)定結(jié)果顯示，質(zhì)粒中插入的EGFP基因序列正確。

2.2 輔助質(zhì)粒及微基因組質(zhì)粒的鑒定

輔助質(zhì)粒pCI-NPM2.1經(jīng)PspOMⅠ、EcoR Ⅴ和KpnⅠ三酶切后得到長(zhǎng)度為5 824 bp、2 412 bp和2 073 bp的酶切片段（圖8A）。輔助質(zhì)粒pCI-L經(jīng)KpnⅠ酶切后得到7 731 bp和3 744 bp的片段（圖8B）。進(jìn)一步序列測(cè)定顯示，兩輔助質(zhì)粒中插入的基因序列均正確。微基因組質(zhì)粒pTH-miniG經(jīng)Hind Ⅲ和SalⅠ雙酶切后，得到3 739 bp和1 005 bp的酶切片段，測(cè)序結(jié)果顯示插入的序列正確（圖8C）。

2.3 輔助質(zhì)粒的表達(dá)鑒定

將pTH-miniG、pCI-NPM2.1和pCI-L 3種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR/T7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h在熒光顯微鏡下觀察到明亮的綠色熒光（圖9A）。單獨(dú)轉(zhuǎn)染微基因組質(zhì)粒（圖9B）和只轉(zhuǎn)染輔助質(zhì)粒的細(xì)胞（圖9C）與空細(xì)胞對(duì)照相同（圖9D），均未見(jiàn)綠色熒光。結(jié)果表明兩種輔助質(zhì)粒能夠正確表達(dá)N、P、M2.1和L四種蛋白，表達(dá)蛋白具有生物活性。

2.4 拯救的aMPV rB1株及rB1-EGFP株

感染拯救的aMPV rB1株及rB1-EGFP株的Vero細(xì)胞出現(xiàn)與感染親本毒株相同的CPE，即細(xì)胞拉絲、間隙增大、合胞體及細(xì)胞崩解和脫落，而對(duì)照細(xì)胞無(wú)明顯CPE（圖10）。在熒光倒置顯微鏡下，在rB1-EGFP感染的細(xì)胞內(nèi)觀察到綠色熒光，連續(xù)傳代至F15代次后仍能正常表達(dá)綠色熒光蛋白（圖11）。結(jié)果說(shuō)明M和F基因間隔能夠正常且穩(wěn)定表達(dá)插入的EGFP。

2.5 拯救毒株的鑒定

在感染B1株、rB1株和rB1-EGFP株的Vero細(xì)胞的上清液中均能擴(kuò)增得到病毒N基因475 bp的鑒定條帶（圖12A）。但僅在感染B1親本毒株的細(xì)胞上清液中能夠擴(kuò)增出含有SalⅠ酶切位點(diǎn)的核酸片段，經(jīng)SalⅠ單酶切后可見(jiàn)大小為910和400 bp的條帶，而去除了SalⅠ酶切位點(diǎn)的rB1株和rB1-EGFP株的PCR擴(kuò)增片段無(wú)法被SalⅠ酶切，僅有單一的1 310 bp擴(kuò)增條帶（圖12B）。同時(shí)測(cè)序結(jié)果證明，拯救的毒株7 474位處均為C堿基，SalⅠ酶切位點(diǎn)被消除（圖12C）。感染rB1株及B1株的Vero細(xì)胞經(jīng)IFA檢測(cè)，可觀察到綠色熒光，感染B1株、rB1株和rB1-EGFP株的細(xì)胞經(jīng)Western blot分析，均能檢測(cè)到大小約為46 ku的病毒N蛋白條帶，而空細(xì)胞對(duì)照無(wú)明顯熒光和預(yù)期的特異性反應(yīng)條帶出現(xiàn)（圖13、14）。上述結(jié)果表明，構(gòu)建的rB1和rB1-EGFP毒株均拯救成功，且無(wú)親本毒株污染。

2.6 拯救毒株的生長(zhǎng)曲線

RT-qPCR檢測(cè)顯示，rB1和rB1-EGFP株與其親本毒株B1在Vero細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)趨勢(shì)無(wú)顯著性差異，均在120 h達(dá)到生長(zhǎng)峰值（圖15）。該結(jié)果表明rB1株和rB1-EGFP株與親本毒株具有相似的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特征。

3 討 論

反向遺傳學(xué)系統(tǒng)是最有效的病毒研究工具，目前已有A亞型及C亞型aMPV毒株的感染性克隆操作平臺(tái) ［31-35］，而針對(duì)國(guó)內(nèi)B亞型流行毒株的反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)還未有報(bào)道，本研究填補(bǔ)了該領(lǐng)域的空缺。已發(fā)表的aMPV拯救系統(tǒng)均采用了五質(zhì)粒的構(gòu)建方式，即包含基因組質(zhì)粒和分別表達(dá)N、P、M2.1、L蛋白的四個(gè)輔助質(zhì)粒［31，36-37］。本文在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，合并了N、P、M2.1三個(gè)較小基因的輔助質(zhì)粒，將總質(zhì)粒數(shù)量降到了3個(gè)。微基因組試驗(yàn)證明了具有多順?lè)醋拥妮o助質(zhì)粒pCI-NPM2.1能夠同時(shí)表達(dá)3個(gè)具有活性的病毒蛋白。降低拯救系統(tǒng)中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的數(shù)量有助于提高病毒拯救效率。這是因?yàn)榕c5個(gè)質(zhì)粒相比，同一細(xì)胞包含3個(gè)質(zhì)粒的概率更高，故具備病毒包裝能力的細(xì)胞增多，從而提高了初始病毒粒子的數(shù)量。轉(zhuǎn)染試劑的使用量因質(zhì)粒數(shù)量減少而按比例縮減，對(duì)細(xì)胞的損傷作用減弱，有助于保持被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活力，從而延長(zhǎng)病毒包裝周期。該試驗(yàn)策略與流感病毒和新城疫病毒等通過(guò)減少轉(zhuǎn)染質(zhì)粒數(shù)量以提高拯救效率的報(bào)道相似［38-39］。

由于副黏病毒科成員的基因組每個(gè)病毒蛋白均具有獨(dú)立的CDS序列，這使該科病毒擁有成為病毒載體的潛力。研究發(fā)現(xiàn)，A亞型aMPV各個(gè)基因間隔均可插入外源蛋白，但僅在M-F之間插入外源蛋白不影響病毒的增殖水平［40］。本文結(jié)果證明B亞型aMPV同樣具有容納外源基因的能力。將EGFP的CDS序列插入到病毒基因組M-F之間，EGFP能夠穩(wěn)定正確地表達(dá)，并且毒株的增殖效率與親本毒株相似。熒光標(biāo)記毒株可簡(jiǎn)化后續(xù)試驗(yàn)的病毒鑒定工作，能直觀觀察改造病毒的復(fù)制動(dòng)態(tài)。將EGFP替換為其他抗原蛋白，可進(jìn)一步開(kāi)展病毒載體亞單位疫苗的研究。由于副黏病毒病毒各蛋白的表達(dá)水平由基因組3′端向5′端依次降低，因此當(dāng)外源基因插入之后，接近5′端的病毒蛋白表達(dá)水平下降，不同程度地削弱病毒正常的增殖能力。本試驗(yàn)不足之處在于僅借鑒了A亞型aMPV的總結(jié)結(jié)果，選擇M-F的間隔區(qū)域作為插入位點(diǎn)而未進(jìn)行詳細(xì)的位點(diǎn)比較。B亞型毒株外源基因的插入規(guī)律與A亞型毒株是否完全一致，需要進(jìn)一步通過(guò)在各個(gè)間隔插入EGFP標(biāo)記基因進(jìn)行評(píng)估。插入位點(diǎn)的選擇應(yīng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)需求，如僅作為病毒示蹤可將熒光基因置于相對(duì)接近病毒基因組5′端的位置，優(yōu)先保證病毒的增殖水平。而如果是作為病毒載體使用，則需要將外源基因插入到接近基因組3′端的基因間隔，在病毒增殖水平和蛋白表達(dá)水平之間尋求平衡。本文中EGFP基因兩側(cè)使用了N基因的GS和GE序列，但各個(gè)病毒基因的GS和GE序列并不相同，aMPV的L蛋白對(duì)各個(gè)GS和GE序列是否具有不同的識(shí)別效率，目前還未有報(bào)道。外源基因的表達(dá)以及其對(duì)病毒的影響是多種因素綜合作用的結(jié)果，需要后續(xù)試驗(yàn)優(yōu)化驗(yàn)證。

為完善aMPV血清學(xué)鑒定方法，作者實(shí)驗(yàn)室制備了雞抗aMPV B1株抗血清。aMPV B1陽(yáng)性試子接種SPF雛雞完成毒株復(fù)壯，使用復(fù)壯毒株攻毒后2～3周采集獲得特異性抗血清。該抗血清可用于文中拯救毒株的鑒定。在目前沒(méi)有成熟B亞型單克隆抗體產(chǎn)品的情況下，該抗血清是有效鑒定B亞型aMPV且成本低廉的材料。

反向遺傳是重要的技術(shù)平臺(tái)，在病毒疫苗的設(shè)計(jì)與研究過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。以疫苗研發(fā)為導(dǎo)向，后續(xù)可開(kāi)展毒力致弱方面的研究。C亞型aMPV甲基化缺陷毒株具有良好的致弱特性和免疫原性［37］。將火雞源C亞型aMPV的G蛋白替換為鵝源G蛋白后，毒株毒力顯著下降的同時(shí)能夠保護(hù)火雞抵抗強(qiáng)毒株的攻擊［41］。SH及G蛋白缺失毒株攻毒火雞后未表現(xiàn)出明顯的癥狀且不影響毒株免疫原性［34，42］。相較于連續(xù)傳代致弱，通過(guò)病毒基因突變或蛋白替換以降低毒力的方法具有更高效率，同時(shí)也降低了病毒返強(qiáng)的概率。以弱毒疫苗為骨架可進(jìn)一步替換病毒的抗原蛋白，使同一毒株獲得多個(gè)亞型毒株的免疫原性。在aMPV分離難度較大的情況下，反向遺傳操作平臺(tái)可提升不同亞型疫苗候選株的制備效率。本研究構(gòu)建的B亞型aMPV感染性克隆，將有力推動(dòng)病毒致病機(jī)制和疫苗的研究進(jìn)程。

4 結(jié) 論

本文以三質(zhì)粒拯救系統(tǒng)為基礎(chǔ)，成功獲得了B亞型aMPV rB1株和rB1-EGFP株的感染性克隆。兩個(gè)拯救毒株具有與親本毒株相似的增殖特性。該反向遺傳操作系統(tǒng)為后續(xù)病毒致病機(jī)制研究與疫苗研發(fā)提供了必要技術(shù)支撐。

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（編輯 白永平）