誘導(dǎo)型表達(dá)H5N1亞型禽流感病毒HA蛋白的乳酸乳球菌的構(gòu)建及其對鴨的免疫原性分析

摘 要：

禽流感是由禽流感病毒引起的高度傳染性疾病，受到感染的雛禽死亡率高，給家禽健康和經(jīng)濟(jì)帶來嚴(yán)重影響。盡管傳統(tǒng)疫苗可以有效預(yù)防禽流感，但由于鴨類養(yǎng)殖方式多為散戶散養(yǎng)，環(huán)境多變，在接種傳統(tǒng)疫苗時存在操作繁瑣和免疫應(yīng)激強(qiáng)等問題。為了解決此難題，本研究旨在開發(fā)一種便捷且安全的雛鴨血凝素（hemagglutinin， HA）口服生物制劑。我們通過構(gòu)建系列錨定序列（pgsA、BmpA、cA和M6）-GFP報告表達(dá)系統(tǒng)，可視化地評估了不同類型錨定序列對乳酸菌乳球表面展示系統(tǒng)的效果，成功篩選出BmpA和cA作為乳酸菌乳球中的高效錨定序列。比較優(yōu)化密碼子前后的HA在乳酸乳球菌的表達(dá)效果后，選取優(yōu)化密碼子的HA基因序列與BmpA、cA連接，構(gòu)建乳酸菌表達(dá)質(zhì)粒。然后把構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入基因組整合HA1基因的乳酸乳球菌中，從而得到誘導(dǎo)型分泌聯(lián)合表面展示HA蛋白的重組乳酸乳球菌（NZB-HA1-pNZ8148-BmpA-HA1和NZB-HA1-pNZ8148-HA1-cA）。ELISA檢測結(jié)果表明，與口服單一表達(dá)型的重組乳酸乳球菌相比，口服誘導(dǎo)型分泌-表面展示乳酸乳球菌能誘生雛鴨血清中更佳的HA特異性IgG水平。本研究成功構(gòu)建了錨定序列-GFP乳酸菌篩選系統(tǒng)，利用其篩選出了適合乳酸乳球菌的高效錨定序列。并將HA蛋白通過分泌聯(lián)合表面展示的方式在乳酸乳球菌進(jìn)行復(fù)合表達(dá)，成功獲得了對雛鴨具有良好HA免疫原性的口服生物制劑，為后續(xù)開發(fā)操作簡便、安全的鴨禽流感口服疫苗提供可行的實(shí)踐路徑。

關(guān)鍵詞：

錨定序列；乳酸乳球菌；禽流感；雛鴨；HA

中圖分類號：

S834；Q939.94 """"文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0774-14

收稿日期：2024-03-22

基金項目：校企合作產(chǎn)學(xué)研項目（h2019364；h20220334）

作者簡介：吳佳輝（1999-），男，廣東普寧人，博士生，主要從事微生物與免疫研究，E-mail：1142620951@stu.scau.edu.cn；沈世彥（2001-），男，湖南婁底人，碩士生，主要從事微生物學(xué)和合成生物學(xué)研究，E-mail：EnshWinter@163.com。吳佳輝和沈世彥為同等貢獻(xiàn)作者

*通信作者：張玲華，主要從事微生物與免疫研究，E-mail：lhzhang@scau.edu.cn

Construction of Recombinant Lactococcus lactis Inducible Expressing HA Protein of H5N1

Subtype Avian Influenza Virus and Analysis of Its Immunogenicity in Ducks

WU" Jiahui， SHEN" Shiyan， DENG" Jinbo， WU" Haiyang， REN" Zhixin， WU" Yangbo， HUANG" Juan， HUANG" Haobin， PAN" Weixiong， ZHAO" Zengjue， HE" Rongxiao， SUN" Chongjun， ZHANG Linghua*

（Guangdong Provincial Key Laboratory for the Development Biology and Environmental Adaptation of Agricultural Organisms， College of Life Sciences， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642，" China）

Abstract：

Avian influenza， caused by avian influenza viruses， is a highly contagious disease characterized by high mortality rates among infected poultry， posing significant health risks to poultry and economic burdens. However， the majority of duck farming comprises small-scale and free-range practices， where environmental conditions vary and ducks are prone to diseases. In such scenarios， traditional vaccination practices present challenges such as inconvenient injection and immunological stress. To tackle this issue， this study devised a method to produce a convenient and safe oral biological agent of hemagglutinin （HA） tailored specifically for ducklings. We constructed the anchoring sequence （pgsA， BmpA， cA， and M6）- GFP reporter expression system， enabling the visualization of different anchoring sequences′ effects on surface-displayed proteins in Lactococcus lactis （L. lactis）. With this system， we successfully identified BmpA and cA as efficient anchoring sequences in L. lactis. After comparing the expression efficiency of HA in L. lactis and optimizing the codons， we selected the optimized HA gene sequence and connected it with BmpA and cA. Then， we co-integrated them into the expression plasmids of L. lactis. Subsequently， we introduced the constructed expression plasmids into L. lactis containing the integrated HA1 gene in the genome， thereby generating recombinant L. lactis capable of both inducible secretory expression and surface display of HA（NZB-HA1-pNZ8148-BmpA-HA1 and NZB-HA1-pNZ8148-HA1-cA）. The ELISA results indicated that orally administered inducible secretory-surface display recombinant L. lactis eliciteds superior levels of HA-specific IgG in duckling serum compared to single-expression recombinant L. lactis treatment. This study successfully established the Anchoring sequence-GFP screening system for Lactobacillus， identifying efficient anchoring sequences suitable for L. lactis， thereby achieving efficient expression of HA on the surface of L. lactis. Subsequently， in conjunction with the genomic secretion expression， we successfully obtained an oral biological agent with satisfactory HA immunogenicity for ducklings. This achievement offers a practical and feasible strategy for the subsequent development of convenient and safe avian influenza oral vaccines.

Key words：

anchoring sequence; Lactococcus lactis; avian influenza; duckling; HA

*Corresponding author： ZHANG Linhua， E-mail： lhzhang@scau.edu.cn

禽流感是一種具有極高傳染性和致病性的疾病，其由禽流感病毒通過禽類呼吸道、消化道、糞便以及淚液進(jìn)行傳播。各個年齡段的禽類均可感染發(fā)病，尤其是雛雞、雛鴨和雛鵝易感染且死亡率較高，已經(jīng)嚴(yán)重阻礙養(yǎng)禽業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展 ［1］。且不同于雞類的集約化養(yǎng)殖，鴨類養(yǎng)殖多為散戶散養(yǎng)，環(huán)境多變，從而導(dǎo)致雛鴨更易患病。目前，禽流感的最有效的控制方法是接種疫苗，但由于禽類疫苗注射操作繁瑣，且易引起免疫應(yīng)激，從而致使禽類免疫力下降，難以達(dá)到理想效果。因此，本研究旨在利用益生菌遞送抗原蛋白的基礎(chǔ)上，開發(fā)一種便捷、安全的可預(yù)防禽流感的口服生物制劑。

表面展示系統(tǒng)是一種將外源蛋白錨定在細(xì)胞表面的技術(shù)，根據(jù)外源蛋白在細(xì)菌表面的展示方式和錨定序列的類型，可將錨定方式分為跨膜錨定、脂蛋白錨定、LPXTG序列基序錨定以及非共價結(jié)合域介導(dǎo)的錨定［3］?？缒ゅ^定利用細(xì)菌的Sec通路，將外源蛋白以未折疊狀態(tài)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜上，并通過跨膜錨定序列將其錨定在細(xì)胞表面［4］。脂蛋白錨定則通過脂蛋白的lipobox基序使外源蛋白與細(xì)胞膜的磷脂共價結(jié)合［5］。LPXTG序列基序錨定通過利用LPXTG基序?qū)⑼庠吹鞍坠矁r連接到細(xì)胞壁肽聚糖上［6］。非共價結(jié)合域介導(dǎo)的錨定通過與細(xì)菌表層蛋白質(zhì)或其他結(jié)構(gòu)域的相互作用將外源蛋白非共價地錨定在細(xì)菌細(xì)胞壁上［7］。不同類型的錨定序列會對蛋白的表面展示效果產(chǎn)生不同的影響，需要根據(jù)表達(dá)宿主類型和展示效果等因素進(jìn)行靈活選擇。篩選適合的錨定序列，將蛋白高效錨定于細(xì)菌表面，不僅可以增強(qiáng)其對惡劣環(huán)境條件的抵抗力，還可以避免被胞外環(huán)境所稀釋，從而顯著提高錨定蛋白的濃度和活性。特別是在疫苗研發(fā)中，通過表面展示技術(shù)將免疫抗原直接錨定在菌體表面，可更好地激活宿主免疫系統(tǒng)，從而提高免疫應(yīng)答效果。然而，篩選出高效的錨定序列并非易事，需要研究者進(jìn)行大量的試驗探索和分析工作。

乳酸菌（lactic acid bacteria， LAB）是一類能利用碳水化合物進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)生乳酸作為主要代謝產(chǎn)物的細(xì)菌的統(tǒng)稱［8］，屬于革蘭陽性菌，菌體多呈球狀或桿狀，無孢子形成，在低pH環(huán)境中具有較高的耐受性［9-10］。乳酸乳球菌（Lactococcus lactis， L. lactis）是乳酸菌的模式菌種，在食品工業(yè)中常用于奶制品的發(fā)酵，被公認(rèn)為安全的 （generally regards as safe， GRAS） 食品級微生物［2］，同時也被證實(shí)對腸道健康和免疫功能有益?，F(xiàn)如今，乳球菌的遺傳背景已經(jīng)得到深入解析，因其無致病性、抗原性弱及自身分泌蛋白少等特點(diǎn)，已經(jīng)成為表達(dá)外源蛋白的理想宿主，并在口服免疫制劑的開發(fā)中展示出巨大潛力［11-12］?？诜蟮娜榍蚓谀c道內(nèi)會受到嚴(yán)峻的酸性環(huán)境和各種消化液等因素的影響，盡管乳球菌具有一定的抗酸性，但能長時間存活的可能性較低［13-14］。因此，我們考慮采用分泌聯(lián)合表面展示的方式來表達(dá)抗原蛋白。這種策略可確保當(dāng)乳球菌處于活躍狀態(tài)時，抗原蛋白可通過分泌和表面展示兩種方式進(jìn)入腸道，刺激腸道黏膜免疫，并進(jìn)一步引起系統(tǒng)性免疫。而當(dāng)乳球菌因腸道環(huán)境失去活性，導(dǎo)致其無法分泌抗原蛋白后，仍然可以通過菌體表面的抗原蛋白與腸道中的抗原提呈細(xì)胞接觸并發(fā)揮免疫刺激作用。通過這種聯(lián)合表達(dá)策略，可在最大程度確保機(jī)體獲得足夠的抗原劑量，從而達(dá)到理想的免疫激活效果。

在本研究中，我們構(gòu)建了一系列的錨定序列-GFP系統(tǒng)，借助該系統(tǒng)篩選出能夠在乳酸乳球菌中高效表面展示蛋白的錨定序列。隨后，我們采取分泌聯(lián)合表面展示的表達(dá)策略，在乳酸乳球菌中成功表達(dá)禽流感血凝素（hemagglutinin，HA）蛋白。最終，我們開發(fā)了一種操作簡便、安全的可預(yù)防禽流感的口服生物制劑，并在雛鴨上驗證了其免疫功能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究使用的菌株和質(zhì)粒如表1所示。

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、Nco Ⅰ、Xba Ⅰ和Xho Ⅰ購自TaKaRa公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗雞IgG、雞源HA的多克隆抗體、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鴨IgG購自Abmart公司。

1.1.3 試驗鴨

1日齡未接種禽流感疫苗櫻桃谷鴨，購自佛山三水某集約化養(yǎng)殖場，于廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗動物中心養(yǎng)至10日齡。所有的動物實(shí)驗程序都得到了華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物保護(hù)與使用委員會（the Institutional Animal Care and Use Committees （IACUC））的批準(zhǔn)。

1.1.4 HA 基因

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的H5N1亞型的HA基因序列（GenBank： AF144305.1），進(jìn)行乳酸菌偏好性的密碼子優(yōu)化，委托蘇州金唯智生物科技有限公司分別合成優(yōu)化前和優(yōu)化后的基因序列，成熟肽的原始序列命名為HA0，優(yōu)化后的成熟肽序列命名為HA1，HA0序列前面額外帶有USP45的信號肽序列SPUsp45， 分別置于pUC57-HA0和pUC57-HA1質(zhì)粒。

1.1.5 引物

本試驗使用的引物如表2所示。

1.2 試驗方法

1.2.1 錨定序列-GFP重組乳酸乳球菌的構(gòu)建

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫的基因序列信息，分別設(shè)計pgsA（GenBank： AB016245.1）、BmpA（GenBank： AM406671.1）、cA（GenBank： U17696.1）、M6（GenBank： M11338.1）和GFP（GenBank： JF951864.1）的特異性引物pgsA F/R、BmpA F/R、cA F/R、M6 F/R、PB-GFP F/R和GFP-CM F/R（表2），以pUC-pgsA、pUC-BmpA、pUC-GW-cA-M6和pUC19-GFP（表1）質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證結(jié)果，通過試劑盒進(jìn)行純化回收正確PCR產(chǎn)物。

對質(zhì)粒pNZ8148（表1）進(jìn)行HindⅢ和NcoⅠ雙酶切，并通過無縫克隆的方法，利用上述PCR產(chǎn)物構(gòu)建4個GFP表達(dá)載體pNZ8148-pgsA-GFP、pNZ8148-BmpA-GFP、pNZ8148-GFP-cA和pNZ8148-GFP-M6。連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌MC1061，并進(jìn)行菌落PCR和測序驗證。將構(gòu)建成功的4個GFP表達(dá)載體和空載pNZ8148分別電轉(zhuǎn)至乳酸乳球菌NZB，利用含氯霉素的GM17固體培養(yǎng)基篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并再次進(jìn)行菌落PCR和測序驗證。構(gòu)建成功的重組乳酸乳球菌命名為NZB-BmpA-GFP、NZB-GFP-cA、NZB-GFP-M6、NZB-pgsA-GFP和NZB-pNZ8148。

1.2.2 錨定序列-GFP的蛋白表達(dá)和檢測

將重組乳酸乳球菌接種到含有氯霉素的GM17液體培養(yǎng)基，于30℃條件下靜置培養(yǎng)過夜。過夜培養(yǎng)的菌液以1∶50的比例接種到含有氯霉素的GM17液體培養(yǎng)基，在30℃條件靜置培養(yǎng)至OD600 mm到0.4左右。然后加入50 ng·mL-1濃度的誘導(dǎo)劑乳鏈菌肽（nisin）誘導(dǎo)3 h，使用SDS-PAGE電泳檢測誘導(dǎo)后的樣品。以空白質(zhì)粒pNZ8148電激轉(zhuǎn)化NZB獲得的NZB-pNZ8148，作為空白對照組。用GM17液體培養(yǎng)基將誘導(dǎo)后的5組菌液的OD600 nm統(tǒng)一調(diào)整為1，通過多功能酶標(biāo)儀SpectraMax i3x測定相對熒光強(qiáng)度［16］。

相對熒光強(qiáng)度=試驗組熒光強(qiáng)度/空白對照組熒光強(qiáng)度。

1.2.3 誘導(dǎo)分泌型HA基因在乳酸乳球菌基因組的整合

根據(jù)信號肽SPUsp45、SP-HA0和HA1的序列信息，設(shè)計特異性引物SP F/R、HA0 F/R和HA1 F/R（表2），以pUC57-HA0和pUC57-HA1（表1）為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到三者PCR產(chǎn)物，使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗證。通過Overlap PCR把信號肽SP加在HA1序列前端，得到的序列命名為SP-HA1。使用Xba Ⅰ和Xho Ⅰ酶切pJW4.1n載體和片段，使用T4連接法分別將SP-HA0和SP-HA1連接到pJW4.1n上，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061，37℃抗性平板培養(yǎng)過夜，挑單菌落，以引物Pz F/Ter R（表2）進(jìn)行菌落PCR驗證，瓊脂糖凝膠電泳檢測菌落PCR產(chǎn)物，對檢測結(jié)果為陽性的樣品提取質(zhì)粒，送擎科生物公司測序。構(gòu)建成功的質(zhì)粒pJW4.1n-HA0和pJW4.1n-HA1分別電激轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌NZB［17］，質(zhì)粒pJW4.1n含有LacZ基因整合位點(diǎn)的上下游同源臂His a和His b，可將外源片段定向整合到乳酸乳球菌NZB基因組上，替換LacZ基因。成功后分別命名為NZB-HA1和NZB-HA0。

1.2.4 Western blot檢測

將待檢測蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜［生工生物工程（上海）股份有限公司］上，以小鼠抗His-tag單克隆抗體作為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，利用化學(xué)發(fā)光成像儀（ChemiScope 3300Mini）檢測結(jié)果。

1.2.5 誘導(dǎo)分泌型 HA 重組乳酸乳球菌的誘導(dǎo)表達(dá)和檢測

挑取單菌落，接種到含有Amp抗生素的GM17液體培養(yǎng)基，于30℃條件靜置培養(yǎng)過夜，過夜培養(yǎng)的菌液以1∶50的比例接種到新鮮的含有Amp抗生素的GM17液體培養(yǎng)基，于30℃條件靜置培養(yǎng)至OD600 nm到0.4左右，加入誘導(dǎo)劑nisin，終濃度為50 ng·mL-1，誘導(dǎo)3 h。誘導(dǎo)完成后破碎細(xì)胞，使用雞源HA的多克隆抗體作為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗雞IgG作為二抗，進(jìn)行Western blot檢測。

1.2.6 誘導(dǎo)型分泌-表面展示乳酸乳球菌的構(gòu)建

根據(jù)BmpA、cA和SP-HA1的序列信息，設(shè)計特異性引物BmpA-HA1（1）F/R、BmpA-HA1（2）F/R、HA1-cA（1）F/R、HA1-cA（2）F/R（表2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證。得到的BmpA、cA和SP-HA1產(chǎn)物通過試劑盒純化回收。以無縫克隆的方法與經(jīng)過雙酶切的pNZ8148連接，熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌MC1061，對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR和測序驗證。構(gòu)建成功后的質(zhì)粒分別命名為pNZ8148-HA1、pNZ8148-BmpA-HA1和pNZ8148-HA1-cA。將pNZ8148-HA1電激轉(zhuǎn)化入乳球菌NZB，pNZ8148-BmpA-HA1和pNZ8148-HA1-cA同時電轉(zhuǎn)入乳球菌NZB和NZB-HA1。構(gòu)建成功的乳酸菌分別命名為NZB-pNZ8148-HA1（對照）、NZB-pNZ8148-BmpA-HA1（表面展示）、NZB-pNZ8148-HA1-cA（表面展示）、NZB-HA1-pNZ8148-BmpA-HA1和NZB-HA1-pNZ8148-HA1-cA（基因組整合分泌+表面展示）。

1.2.7 乳酸乳球菌細(xì)胞膜組分的提取

取1 mL誘導(dǎo)后的菌液，在4℃條件下以4 000×g的離心力離心5 min，棄去上清。菌體以500 μL TES溶液重懸，在4℃條件下以4 000×g的離心力離心5 min，棄去上清，重復(fù)兩次。用500 μL TES-裂解緩沖液重懸菌體，37℃孵育1 h。在4℃條件下以4 000×g的離心力離心10 min棄去上清。以500 μL TES溶液重懸，在4℃條件下，4 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，重復(fù)兩次。加入500 μL ddH2O，反復(fù)凍融5次，在4℃條件下以21 000×g的離心力離心50 min，棄去上清。用100 μL 1×TE緩沖液重懸［18］，-20℃保存或直接制成蛋白樣品，使用雞源HA的多克隆抗體作為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗雞IgG作為二抗，進(jìn)行Western blot檢測。

1.2.8 雛鴨免疫評價

將10日齡雛鴨分為6組，每組5只，分別為PBS組、NZB-pNZ8148-HA1免疫組、NZB-pNZ8148-BmpA-HA1免疫組、NZB-pNZ8148-HA1-cA免疫組、NZB-HA1-pNZ8148-BmpA-HA1免疫組和NZB-HA1-pNZ8148-HA1-cA免疫組（表3）。將構(gòu)建好的各組重組乳酸乳球菌在OD600 nm為0.4時加入終濃度為50 ng·mL-1 nisin誘導(dǎo)3 h，在4℃條件下，4 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，收集菌體，用PBS洗滌，混懸定容，通過GM17固體培養(yǎng)基菌落計數(shù)，計算各組需要喂飼雛鴨的活菌數(shù)，劑量為1×1011 CFU·只-1，每只雛鴨100 μL，PBS對照組為100 μL PBS，通過灌胃的方式喂飼，連續(xù)免疫7 d［19］。每組重復(fù)3次。

1.2.9 ELISA檢測雛鴨HA特異性IgG表達(dá)水平

免疫結(jié)束3、7 d后，采集6個試驗組雛鴨血液，37℃恒溫箱中靜置1 h，轉(zhuǎn)移至4℃條件靜置2 h，3 000 r·min-1離心30 min，分離上清，-80℃保存。

將待測血清稀釋后，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鴨IgG作為抗體，進(jìn)行ELISA檢測HA特異性IgG表達(dá)水平，使用自動酶標(biāo)儀（SpectraMax i3x）測定各孔的光吸收值（OD450 nm），并計算待測血清OD450 nm值與陰性血清OD450 nm值的比值（P/N值）。當(dāng)P/N值大于2.0時，認(rèn)為是陽性；反之，則認(rèn)為是陰性［20］。結(jié)果以P/N值為陽性的血清最大稀釋度為該血清的滴度，用2的指數(shù)表示。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析

所有試驗均設(shè)置了至少三個重復(fù)組，使用GraphPad Prism 9軟件數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和圖表繪制，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，并進(jìn)行差異顯著性分析。采用單向或雙向方差分析（ANOVA）和t檢驗確定了試驗組與對照組以及試驗組之間的差異。當(dāng)P＜0.05時，表示具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異；當(dāng)P＜0.01時，表示具有高度顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 乳酸乳球菌錨定序列-GFP篩選系統(tǒng)的構(gòu)建

2.1.1 錨定序列-GFP篩選系統(tǒng)的載體構(gòu)建

利用特異性引物擴(kuò)增得到的4個錨定序列pgsA、BmpA、cA、M6和報告基因GFP產(chǎn)物，將上述產(chǎn)物（圖1A）與pNZ8148（表1）雙酶切產(chǎn)物（圖1B）經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果與預(yù)期大小相一致。

將得到的4種錨定序列跟GFP分別組合，連接到雙酶切后pNZ8148質(zhì)粒上，熱激轉(zhuǎn)化至DH5α中，測序證明，成功構(gòu)建pNZ8148-pgsA-GFP、pNZ8148-BmpA-GFP、pNZ8148-GFP-cA和pNZ8148-GFP-M6四個表達(dá)載體。隨后將四個表達(dá)載體電擊至乳酸乳球菌NZB，成功獲得四株表達(dá)菌株，分別命名為NZB-BmpA-GFP、NZB-GFP-cA、NZB-GFP-M6和NZB-pgsA-GFP。隨后將四株表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)完成后用SDS-PAGE電泳檢測。結(jié)果表明，在誘導(dǎo)后的重組乳酸乳球菌中，均有融合蛋白的表達(dá)（圖2），并且與預(yù)期相對分子質(zhì)量大小相符，證明GFP與錨定序列實(shí)現(xiàn)了融合表達(dá)。以上結(jié)果說明我們成功構(gòu)建了乳酸乳球菌錨定序列-GFP 篩選系統(tǒng)。

2.1.2 乳酸乳球菌高效錨定序列的篩選

用GM17液體培養(yǎng)基將誘導(dǎo)后的四組重組乳酸乳球菌的OD600 nm值調(diào)整至1后，用熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)情況，并通過酶標(biāo)儀檢測相對熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖3。通過圖3E的相對熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)圖可知BmpA-GFP（圖3A）和cA-GFP（圖3B）均表現(xiàn)出高水平的GFP相對熒光強(qiáng)度，且顯著高于融合了 M6-GFP（圖3C）和pgsA-GFP（圖3D）。上述結(jié)果表明，我們成功利用該報告系統(tǒng)篩選出BmpA和cA兩個高效錨定序列。這一研究結(jié)果也為乳酸乳球菌表面展示系統(tǒng)的開發(fā)提供了有價值的參考。

2.2 乳酸乳球菌基因組中HA基因定向整合及HA的誘導(dǎo)表達(dá)

2.2.1 乳酸乳球菌基因組中的誘導(dǎo)分泌型HA基因整合

考慮到HA蛋白具有的高度保守性和免疫原性以及H5亞型禽流感在人畜和禽類之間相比其他亞型傳播率較高［21］，我們選擇H5亞型禽流感病毒的HA蛋白作為疫苗抗原。為了在乳球菌中高效表達(dá)HA，我們對其基因序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。然而，需要注意的是，經(jīng)過密碼子優(yōu)化的蛋白在構(gòu)象、折疊和穩(wěn)定性可能會受到不同程度的影響［22］，也有可能會影響翻譯速率，蛋白合成效率等過程，從而影響蛋白質(zhì)的最終表達(dá)效果［23］。因此，我們需要比較HA0和HA1的表達(dá)情況。

我們首先以pUC57-HA0（表1）和pUC57-HA1（表1）為模板，PCR擴(kuò)增得到信號肽SP、SP-HA0和HA1基因序列，使用Overlap PCR對SP和HA1進(jìn)行拼接得到SP-HA1，并對pJW4.1n（表1）進(jìn)行酶切，產(chǎn)物均使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗證。結(jié)果如圖4所示，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果的條帶基本與各目的條帶大小相符。

將SP-HA1和SP-HA0與PJW4.1n（表1）進(jìn)行連接后，轉(zhuǎn)入乳球菌NZB（表1）中。在含有nisin和X-Gal的GM17固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，挑選白色菌落（圖5A），用引物Pz F/Ter R（表2）進(jìn)行菌落PCR驗證（圖5B），結(jié)果表明成功獲得了陽性克隆。

2.2.2 密碼子優(yōu)化后的HA1與HA0的誘導(dǎo)表達(dá)比較

對NZB-HA0和NZB-HA1誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行Western blot驗證和表達(dá)量分析（圖6）。如圖6所示，相較于未優(yōu)化的HA，優(yōu)化后的HA1在蛋白表達(dá)水平上并無顯著差異。但考慮到密碼子優(yōu)化可有效促進(jìn)mRNA與宿主細(xì)胞tRNA的相互作用，減少由稀缺密碼子導(dǎo)致的翻譯延遲和錯配［24］，我們選擇了HA1進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.3 誘導(dǎo)型分泌-表面展示乳酸乳球菌的構(gòu)建及其分泌和展示功能

我們將前面試驗（2.1.1）篩選獲得的較理想BmpA和cA錨定序列分別與SP-HA1相連后，連接到pNZ8148質(zhì)粒上，并分別電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)乳酸乳球菌NZB-HA1和NZB。對重組乳酸乳球菌誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行Western blot檢測。結(jié)果顯示NZB-pNZ8148-HA1（圖7A泳道3）只表達(dá)了分泌型HA蛋白，無表面展示型HA蛋白表達(dá)。而NZB-pNZ8148-BmpA-HA1（圖7A泳道7）和NZB-pNZ8148-HA1-cA（圖7A泳道8）無分泌型HA蛋白表達(dá)。在NZB-HA1-pNZ8148-BmpA-HA1和NZB-HA1-pNZ8148-HA1-cA中，存在分泌型和表面展示型兩種類型的HA（圖7A泳道1和2）。

為進(jìn)一步驗證融合蛋白的HA是否錨定在細(xì)胞壁上，對NZB-pNZ8148-BmpA-HA1（圖7B泳道10）和NZB-pNZ8148-HA1-cA（圖7B泳道11）提取細(xì)胞膜組分后進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果顯示兩者都有相應(yīng)的條帶，且分子量均大于NZB-pNZ8148-HA1表達(dá)的分泌型HA蛋白（圖7B泳道9），證明了HA成功錨定在細(xì)胞表面。

2.4 對雛鴨的免疫原性分析

我們采用ELISA的方法檢測各組雛鴨的血清中HA特異性IgG（圖8）。以PBS組作為空白對照，5組均呈現(xiàn)陽性結(jié)果。這些結(jié)果表明，5種重組乳酸乳球菌都對雛鴨提供了有效的免疫保護(hù)，與單獨(dú)分泌表達(dá)HA的乳酸乳球菌（NZB-pNZ8148-HA1）相比，通過表面展示表達(dá)HA的乳酸乳球菌（NZB-pNZ8148-BmpA-HA1、NZB-pNZ8148-HA1-cA、NZB-HA1-pNZ8148-BmpA-HA1和NZB-HA1-pNZ8148-HA1-cA）能誘導(dǎo)雛鴨血清更高的HA特異性IgG。特別值得注意的是，相比于分泌或表面展示單獨(dú)表達(dá)的重組乳酸乳球菌（NZB-pNZ8148-HA1、NZB-pNZ8148-BmpA-HA1和NZB-pNZ8148-HA1-cA），口服誘導(dǎo)型分泌-表面展示乳酸乳球菌（NZB-HA1-pNZ8148-BmpA-HA1和NZB-HA1-pNZ8148-HA1-cA）能夠誘生更高水平的雛鴨HA特異性IgG，表明誘導(dǎo)型分泌-表面展示乳酸乳球菌具備良好的免疫原性，可以提供更佳的免疫保護(hù)效果。

3 討 論

禽流感作為一種嚴(yán)重的動物傳染病，對禽類養(yǎng)殖業(yè)和人類健康造成了巨大的威脅。目前，接種疫苗是控制禽流感傳播的主要方法之一。然而，現(xiàn)有的禽流感疫苗多為注射型，該類型疫苗廣泛應(yīng)用于雞類的集約化養(yǎng)殖，但在鴨類養(yǎng)殖中，由于多為散戶放養(yǎng)，注射疫苗不僅操作繁瑣且易引起應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致免疫力下降。尤其對于雛鴨而言，其免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不完善，更易受到疾病侵襲［25］。此外，現(xiàn)階段禽流感疫苗的研究主要集中于雞和小鼠［26-27］，缺乏針對鴨類的有效疫苗。因此，我們制備了一種對雛鴨具有良好HA免疫原性的口服益生菌生物制劑，為后續(xù)開發(fā)新型禽流感口服疫苗提供了可行性策略。

目前，禽流感疫苗抗原蛋白主要包括血凝素、神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase， NA）和核蛋白（nucleoprotein， NP）等。其中，HA因其在同種禽流感亞型中的具有高度保守性和免疫原性，已經(jīng)成為禽流感疫苗開發(fā)中最常用的抗原之一。同時，大量研究結(jié)果證實(shí)，HA作為禽流感抗原疫苗具有廣譜性和有效性［28-30］。在先前報道的研究中，研究者曾采用植物乳桿菌作為表達(dá)載體表達(dá)HA，結(jié)果顯示，在以雛雞作為免疫評價對象時，其效價可達(dá)到7log2［31］，與本研究中分泌聯(lián)合表面展示型的乳酸乳球菌達(dá)到的效價相似。

常用的口服益生菌遞送系統(tǒng)的菌株包括植物乳桿菌［32］、沙克乳酸桿菌［33］和雙歧桿菌［34］等，其中最常用的是乳酸菌屬。乳酸乳球菌作為乳酸菌的模式菌種，是一種公認(rèn)安全的益生菌，其生物遺傳背景清晰，使用乳酸乳球菌作為提送載體是保證疫苗安全性的理想選擇。且有研究報道，一種表達(dá)ompA蛋白的重組乳酸乳球菌，口服后在小鼠腸道有良好的定植率［35］，表明乳球菌可以克服胃腸道的特殊環(huán)境（胃部酸性、胃腸道富含酶類和膽汁酸），在腸道中保持一定時間的活性。本研究中的重組乳酸乳球菌采用表面展示與分泌雙重表達(dá)方式表達(dá)HA蛋白，使其在腸道處于活躍狀態(tài)時，可以通過雙重表達(dá)為機(jī)體提供足夠的抗原量，而當(dāng)其失去活性后，仍可以通過表面展示的HA蛋白繼續(xù)發(fā)揮抗原遞送作用。

蛋白的錨定效果受不同錨定序列的性質(zhì)而有所不同，需要根據(jù)不同研究或應(yīng)用的需求選取合適的錨定序列。本文選取的這4個錨定序列（pgsA、BmpA、cA、M6）在先前的研究中都被證明具有高效錨定蛋白的潛力［36-38］，但如何快速篩選出最適合在乳酸乳球菌中發(fā)揮作用的錨定序列仍是一個挑戰(zhàn)。我們通過在乳酸乳球菌構(gòu)建錨定序列-GFP篩選系統(tǒng)，通過比較4種錨定序列對GFP的錨定效果，成功篩選出BmpA和cA作為乳酸乳球菌表面展示系統(tǒng)中的高效錨定序列，這一研究結(jié)果也為乳酸乳球菌表面展示系統(tǒng)的開發(fā)提供了有價值的參考。我們通過BmpA和cA錨定序列成功實(shí)現(xiàn)在乳酸乳球菌表面展示HA之后，再聯(lián)合分泌表達(dá)HA，進(jìn)一步增強(qiáng)了重組乳酸乳球菌的抗原遞送效果?，F(xiàn)如今，研究者常采用表面展示技術(shù)或胞外分泌的方式表達(dá)抗原蛋白［37-39］，但鮮有采用表面展示聯(lián)合胞外分泌的方式表達(dá)抗原蛋白的報道。此舉將為疫苗研發(fā)領(lǐng)域提供新的思路和方法，有望進(jìn)一步增強(qiáng)疫苗的免疫原性和保護(hù)效果。

最后，我們利用雛鴨對構(gòu)建出的重組乳酸乳球菌進(jìn)行了免疫原性分析，相比于分泌或表面展示單獨(dú)表達(dá)的重組乳球菌，口服誘導(dǎo)型分泌-表面展示乳酸乳球菌能夠誘導(dǎo)雛鴨血清中更強(qiáng)的HA特異性IgG應(yīng)答。但需要指出的是，本研究只是初步確認(rèn)其免疫功能，后續(xù)的口服劑量、免疫時間和免疫次數(shù)等免疫程序的選擇，以及是否對其他禽類有同樣的免疫保護(hù)作用等有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究建立了錨定序列-GFP篩選系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)對不同錨定序列在乳酸乳球菌內(nèi)蛋白表面展示效果進(jìn)行了評估，篩選出能夠在乳酸乳球菌中高效發(fā)揮作用的錨定序列。同時，成功實(shí)現(xiàn)了HA蛋白在重組乳酸乳球菌中的誘導(dǎo)型分泌和表面展示的復(fù)合表達(dá)。最后通過對雛鴨的免疫原性分析，表明口服誘導(dǎo)型分泌-表面展示乳酸乳球菌具有良好的HA免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。本研究結(jié)果為進(jìn)一步優(yōu)化雛鴨口服疫苗設(shè)計提供了重要參考，為禽類養(yǎng)殖的禽流感疫苗研發(fā)和免疫防控提供了新的思路和實(shí)踐路徑。

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（編輯 白永平）