鴨瘟病毒TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

摘 要：

為建立一種鴨瘟病毒（duck plague virus， DPV）TaqMan熒光定量PCR快速檢測(cè)方法，基于DPV US6基因保守序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，構(gòu)建重組質(zhì)粒DPV-US6標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)方法敏感性、特異性和重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并應(yīng)用于DPV在雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）上增殖及人工感染鴨器官組織上分布規(guī)律研究。結(jié)果顯示，成功建立了DPV TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法最低檢測(cè)限可以達(dá)到10 copies·μL-1，與番鴨細(xì)小病毒、鴨圓環(huán)病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨呼腸孤病毒、H9N2亞型禽流感病毒、鴨甲型肝炎病毒（I型和III型）和鴨衣原體均無(wú)交叉反應(yīng)，批間和批內(nèi)變異系數(shù)均小于2.0%。DPV-AX株感染CEF細(xì)胞后，病毒核酸拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，4～8 h病毒增殖緩慢，12～60 h迅速上升，60 h達(dá)到最高峰，72～144 h逐漸下降，與TCID50法測(cè)定的病毒滴度相比，兩種檢測(cè)方法具有良好相關(guān)性，可實(shí)現(xiàn)拷貝數(shù)替代TCID50。DPV人工感染鴨組織臟器的病毒載量分布檢測(cè)表明，肝臟中的病毒載量最高。本試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法為研究DPV-AX株在CEF上的增殖規(guī)律提供工具。

關(guān)鍵詞：

鴨瘟病毒；US6基因；TaqMan探針；熒光定量PCR；增殖規(guī)律；人工感染

中圖分類號(hào)：

S852.659.1"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A """"文章編號(hào)： 0366-6964（2025）02-0765-09

收稿日期：2024-03-11

基金項(xiàng)目：北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng)（KJCX20220422）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（BAIC06-2024）

作者簡(jiǎn)介：于江瑋（1997-），男，內(nèi)蒙古烏海人，碩士生，主要從事畜禽疫病診斷與防治研究，E-mail：625744906@qq.com

*通信作者：胡 格，主要從事中藥抗病毒機(jī)理研究，E-mail：bnhuge@126.com；楊志遠(yuǎn)，主要從事畜禽疫病診斷與防治研究，E-mail：yangzy88@126.com

Establishment and Application of TaqMan Fluorescent Quantitative PCR Detection Method for Duck Plague Virus

YU" Jiangwei1， CHENG" Huimin2， LIN" Jian2， YANG" Baolin2， HUANG" Cheng2， YANG" Zhiyuan2*， HU" Ge1*

（1.College of Animal Science and Technology， Beijing University of Agriculture， Beijing 102206， China;

2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Beijing 100097，" China）

Abstract：

To establish a rapid TaqMan fluorescent quantitative PCR detection method for duck plague virus （DPV）， specific primers and probes were designed based on the conserved sequence of the DPV US6 gene， and a recombinant plasmid DPV-US6 standard was constructed. The sensitivity， specificity， and reproducibility of the method were evaluated， and it was applied to study the proliferation of DPV in chicken embryo fibroblast （CEF） cells and the distribution pattern of virus load in the organs and tissues of artificially infected ducks. The results showed that the DPV TaqMan fluorescent quantitative PCR detection method was successfully established， with a minimum detection limit of 10 copies·μL-1. There was no cross-reaction with Muscovy duck parvovirus， duck circovirus， duck Tembusu virus， duck reovirus， H9N2 subtype avian influenza virus， duck hepatitis A virus types I and III， or duck chlamydia. The inter-batch and intra-batch coefficient of variation were both less than 2.0%. After DPV-AX strain infected CEF cells， the viral nucleic acid copy number detection results indicated that the virus proliferated slowly from 4 to 8 hours， rapidly increased from 12 to 60 hours， peaked at 60 hours， and gradually declined from 72 to 144 hours. Compared with the virus titer determined by the TCID50 method， the two detection methods showed good correlation， allowing the copy number to replace TCID50. The virus load distribution detection in organs and tissues of ducks artificially infected with DPV showed the highest virus load in the liver. The detection method established in this experiment provides a tool for studying the proliferation pattern of the DPV-AX strain in CEF cells.

Key words：

duck plague virus; US6 gene; TaqMan probe; fluorescence quantitative PCR; proliferation characteristics; artificial infection

*Corresponding authors： HU Ge，E-mail：bnhuge@126.com；YANG Zhiyuan，E-mail：yangzy88@126.com

鴨瘟（duck plague，DP）又稱鴨病毒性腸炎（duck virual enteritis，DVE），是由鴨瘟病毒（duck plague virus，DPV）引起鴨、鵝等水禽的一種急性、熱性、敗血性傳染病，具有流行范圍廣，傳播迅速，發(fā)病率和死亡率高等特征［1］。1923年該病由Baudet首次在荷蘭報(bào)道［2］，黃引賢于1957年在我國(guó)廣東省首次發(fā)現(xiàn)該病［3］，Bos等［3］首次分離鑒定并保存了鴨瘟病毒。DPV屬于皰疹病毒科（Herpesvirales）、α-皰疹病毒亞科（Alphaherpesvirinae）、馬立克病毒屬（Mardi-virus）成員，只有一種血清型［4］。鴨自然感染DPV潛伏期達(dá)2～5 d，人工感染DPV潛伏期1～3 d［5］ 。目前為止我國(guó)已有許多地區(qū)分離出DPV，DPV可感染不同品種和日齡的鴨，嚴(yán)重威脅我國(guó)水禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。建立快速和特異的檢測(cè)方法，對(duì)于臨床該病的診斷和防控具有重要意義。

目前DPV的檢測(cè)方法有血清中和試驗(yàn)（SN）、熒光定量PCR和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等［6，7］，其中熒光定量PCR與常規(guī)PCR相比其敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好，具有實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)［8］。熒光定量PCR包括SYBR Green染料法和TaqMan探針?lè)?，相比染料法，探針?lè)ǜ舾?、?shù)據(jù)更精確、能夠與雙鏈DNA特異性的結(jié)合［9］，以TaqMan探針為基礎(chǔ)，出現(xiàn)了多種改良方法，包括TaqMan-MGB法［10］ 、Molecular beacon法［11］ 、Lightcycler法［12］ 、LUX-PCR法［13］、UT-PCR法［14］、復(fù)合探針?lè)ǎ?5］等。

US6基因是DPV增殖的必需基因［16］ ，編碼的gD蛋白參與病毒的吸附和穿膜作用，是DPV重要的囊膜蛋白［17］。US6基因在皰疹病毒中高度保守［18］ ，可作為熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)。目前關(guān)于DPV US6基因有SYBR Green染料法熒光定量PCR［5］ ，未見(jiàn)有探針?lè)晒舛縋CR的報(bào)道。因此，本研究基于DPV的US6基因高度保守序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立以DPV US6基因?yàn)榘悬c(diǎn)的TaqMan探針熒光定量PCR檢測(cè)方法，應(yīng)用于DPV-AX株在CEF細(xì)胞中的增殖規(guī)律和DPV人工感染鴨組織臟器的病毒載量分布情況研究，為DPV診斷、防控及致病特性的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

鴨瘟病毒（DPV-AX株104.5 TCID50·0.1 mL-1），由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離、鑒定并保存；鴨瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株（CVCCAV1221，108MLD），由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；鴨坦布蘇病毒（duck tembusu virus， DTMUV）、H9N2亞型禽流感病毒（avian influenza virus， AIV）、鴨呼腸孤病毒（duck reovirus， DRV）、番鴨細(xì)小病毒（muscovy duck parvovirus， MDPV）、鴨圓環(huán)病毒（duck circovirus， DuCV）核酸樣本，由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供；鴨衣原體（duck chlamydia）核酸樣本，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院提供；鴨甲型肝炎I型和III型病毒（duck hepatitis virus， DHV-I和DHV-III）核酸樣本，由瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司提供。

雞胚成纖維細(xì)胞（chicken embryo fibroblast， CEF），由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所制備。

10只30日齡雛鴨，購(gòu)自北京金星鴨業(yè)有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

RNA/DNA提取試劑盒、pMD19-T克隆載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒提取試劑盒，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；凝膠回收試劑盒、Medium 199培養(yǎng)基、胰蛋白酶，均購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；通用型探針?lè)ǘ縋CR檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；新生牛血清，購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司。

熒光定量PCR儀、VeritiTM PCR儀、NanoDrop微量UV-Vis分光光度計(jì)，賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱，日本三洋公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡，德國(guó)徠卡公司產(chǎn)品。

1.3 熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中DPV US6基因序列（JQ673560）設(shè)計(jì)1對(duì)常規(guī)PCR引物DPV-F/DPV-R，1對(duì)TaqMan熒光定量PCR引物DPV-q1-F/DPV-q1-R和TaqMan探針，1對(duì)SYBR Green熒光定量PCR引物DPV-q2-F/DPV-q2-R（表1），常規(guī)PCR引物擴(kuò)增序列包含熒光定量PCR引物擴(kuò)增序列，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.2 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

取300 μL鴨瘟病毒液（DPV-AX株），按照病毒DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取病毒基因組DNA。利用引物DPV-F/R進(jìn)行PCR反應(yīng)。50 μL反應(yīng)總體系：5×PrimeSTAR GXL Buffer 10 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1 each） 4 μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerse 1 μL，上、下游引物（DPV-F/R）各1 μL，模板2 μL，滅菌水21 μL。反應(yīng)程序：98℃ 10 s，55℃ 15 s，68℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)。

回收擴(kuò)增得到的目的片段連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒命名pMD19T-US6。測(cè)定陽(yáng)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度，根據(jù)濃度與拷貝數(shù)之間的換算關(guān)系：（6.02×1023）×（ng·μL-1×10-9）/（DNA length×660）=copies·μL-1，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)。

1.3.3 引物及探針濃度的優(yōu)化

在反應(yīng)體系中分別加入終濃度0.1、0.2、0.3、0.4 μmol·L-1的引物（DPV-q1-F/R）和TaqMan探針，采用矩陣法確定引物和探針的最佳工作濃度。設(shè)定退火溫度分別為58、59、60、62℃，通過(guò)擴(kuò)增效率確定最佳退火溫度。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋，以1.0×101～1.0×1010copies·μL-1濃度標(biāo)準(zhǔn)品為模板，根據(jù)優(yōu)化后的最佳反應(yīng)體系和程序進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)ddH2O作為陰性對(duì)照。初始模板重組質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（X軸），循環(huán)數(shù)Ct值為縱坐標(biāo)（Y軸）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)

以1.0×101～1.0×109 copies·μL-1濃度標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，同時(shí)與常規(guī)PCR和SYBR Green染料法熒光定量PCR進(jìn)行敏感性比較。

1.3.6 熒光定量PCR特異性試驗(yàn)

以DPV、MDPV、DuCV、Duck chlamydia、DHV-I和DHV-III的DNA樣本及DTMUV、AIV、DRV的cDNA樣本為模板，設(shè)ddH2O作為陰性對(duì)照，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

1.3.7 熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)

以1.0×102～1.0×107 copies·μL-1濃度標(biāo)準(zhǔn)品為模板，每個(gè)稀釋度做3次重復(fù)進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)；同一批質(zhì)粒選取3個(gè)不同時(shí)間段進(jìn)行3次批間重復(fù)性試驗(yàn)，設(shè)ddH2O作為陰性對(duì)照，計(jì)算批內(nèi)和批間的變異系數(shù)。

1.4 熒光定量PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用

1.4.1 DPV增殖規(guī)律的研究

DPV-AX株以0.1MOI接種至已長(zhǎng)滿致密單層的CEF中，37℃吸附1h，棄去病毒液更換維持液（含2% 新生牛血清的M199）。取吸附后不同時(shí)間點(diǎn)上清液離心，置-80℃保存；加入等體積無(wú)菌PBS反復(fù)凍融3次取細(xì)胞液離心，置-80℃保存。

提取不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清和細(xì)胞沉淀樣品核酸，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，每個(gè)樣品做3次重復(fù)，測(cè)得Ct值（Y值）后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算吸附后不同時(shí)間點(diǎn)病毒核酸的拷貝數(shù)。

測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清液和細(xì)胞沉淀樣品病毒滴度。根據(jù)Reed-Meunch法計(jì)算每個(gè)時(shí)間段細(xì)胞上清和細(xì)胞沉淀樣品的TCID50，繪制病毒一步生長(zhǎng)曲線。將本結(jié)果與熒光定量PCR方法檢測(cè)病毒核酸拷貝數(shù)結(jié)果進(jìn)行比較，分析DPV在CEF細(xì)胞中的增殖規(guī)律。

1.4.2 人工感染鴨器官組織DPV分布檢測(cè)

將10只30日齡的非免疫雛鴨，通過(guò)肌肉注射方式感染鴨瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株，每只注射劑量為104MLD，感染后第7天，對(duì)所有雛鴨進(jìn)行剖檢取材，采集腦、胸腺、肝臟、脾臟、十二指腸、泄殖腔組織臟器，分別提取DNA，利用建立的TaqMan熒光定量PCR方法，對(duì)鴨瘟強(qiáng)毒株在感染鴨組織中的分布情況進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

2.1.1 菌液PCR鑒定

使用DPV-F/R和M13-F/R引物對(duì)篩選的單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，擴(kuò)增目的片段大小分別為514和623 bp（見(jiàn)圖1），與預(yù)期片段大小一致。提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果正確，表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒DPV-US6標(biāo)準(zhǔn)品。

2.1.2 TaqMan探針熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

經(jīng)優(yōu)化，反應(yīng)總體系20 μL：2×AceQ Universal U+ Probe Master Mix V2 10 μL，上、下游引物各0.4 μL（0.2 μmol·L-1），TaqMan探針0.4 μL（0.2 μmol·L-1），模板2 μL，ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將濃度為3.97×1010 copies·μL-1重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍系列稀釋，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)進(jìn)行熒光定量PCR，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=-3.326x+41.196，R2=1，擴(kuò)增效率E=99.391%（見(jiàn)圖2）。表明所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較好的線性關(guān)系。

2.1.4 熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)

以10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品為模板分別進(jìn)行TaqMan探針?lè)?、SYBR Green染料法熒光定量PCR 和常規(guī)PCR檢測(cè)。TaqMan探針?lè)ǖ淖畹蜋z測(cè)濃度為1×101copies·μL-1。SYBR Green染料法的最低檢測(cè)濃度為1×102copies·μL-1，常規(guī)PCR的最低檢測(cè)濃度為1×105copies·μL-1。結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的TaqMan探針?lè)晒舛縋CR靈敏度比SYBR Green染料法高10倍，比常規(guī)PCR高10 000倍，方法具有較好的敏感性。

2.1.5 熒光定量PCR特異性試驗(yàn)

分別檢測(cè)鴨常見(jiàn)疾病病原核酸包括DPV、DTMUV、AIV、MDPV、DuCV、DRV、duck chlamydia、DHV-I和DHV-III，僅DPV有特異性的單一擴(kuò)增曲線，其它病原檢測(cè)結(jié)果均為陰性，方法具有較好的特異性。

2.1.6 熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)6個(gè)稀釋度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)（CV）在0.077%～1.000%之間，批間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)在0.221%～1.451%之間，變異系數(shù)均小于2.0%，方法具有較好的重復(fù)性。

2.2 DPV增殖規(guī)律的研究

對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)收集的細(xì)胞上清和細(xì)胞沉淀樣品進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行TCID50測(cè)定，根據(jù)結(jié)果繪制曲線（見(jiàn)圖3和圖4）。結(jié)果顯示，檢測(cè)感染細(xì)胞內(nèi)病毒時(shí)，病毒核酸拷貝數(shù)在4～60 h逐漸上升，60～84 h達(dá)到高峰，84～144 h逐漸下降。TCID50測(cè)定在4～3 6h逐漸上升，36 h達(dá)到高峰，36～144 h逐漸下降。檢測(cè)細(xì)胞上清樣本時(shí)，病毒核酸拷貝數(shù)與TCID50檢測(cè)繪制的病毒增殖曲線一致，均在4～60 h上升，60 h達(dá)到高峰，72～144 h下降，兩種檢測(cè)方法具有相關(guān)性，表明建立的熒光定量PCR方法能用于病毒增殖的檢測(cè)。

2.3 人工感染鴨器官組織DPV分布檢測(cè)

使用本試驗(yàn)建立的熒光定量PCR方法對(duì)10只DPV攻毒鴨組織樣本分別進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，肝臟中的病毒載量最高（見(jiàn)圖5），核酸拷貝數(shù)達(dá)108copies·μL-1，胸腺中的病毒載量次之，腦組織中的病毒載量最低。

3 討 論

我國(guó)是世界上最大的水禽養(yǎng)殖國(guó)家，鴨瘟的高發(fā)病率和死亡率給我國(guó)水禽養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，制約了養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展［2］。因此，建立快速、敏感、特異的鴨瘟病毒檢測(cè)方法對(duì)于預(yù)防和控制鴨瘟病毒大流行尤為重要?，F(xiàn)有的DPV檢測(cè)方法包括病毒分離鑒定、血清中和試驗(yàn)、常規(guī)PCR、熒光定量PCR等。病毒分離與血清中和試驗(yàn)操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，不適用于臨床檢測(cè)；常規(guī)PCR靈敏度和特異性差，不能對(duì)病毒進(jìn)行定量檢測(cè)；熒光定量PCR具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、準(zhǔn)確定量等特點(diǎn)，目前作為檢測(cè)鴨瘟病毒的常用方法［19］。已有學(xué)者根據(jù)DPV DNA聚合酶、UL6、UL7、UL48、UL30、UL31、TK、gE等基因建立了熒光定量PCR檢測(cè)方法［20-24］。

對(duì)24株DPV流行株TK基因的分析表明，TK基因存在3位點(diǎn)的變異［25］，病毒的變異需要建立新的檢測(cè)方法。本研究基于DPV US6基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)了探針，該探針的GC含量為54%，根據(jù)探針的序列設(shè)計(jì)了能與之特異性結(jié)合的引物，建立了基于DPV US6基因TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法。特異性檢測(cè)結(jié)果表明該方法僅對(duì)DPV模板有陽(yáng)性擴(kuò)增信號(hào)，對(duì)鴨源常見(jiàn)病原如番鴨細(xì)小病毒、鴨圓環(huán)病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨呼腸孤病毒、H9N2亞型禽流感病毒、鴨甲型肝炎I型和III型、鴨衣原體均無(wú)交叉反應(yīng)，特異性較好，最低可檢測(cè)到10 copies·μL-1核酸，與常規(guī)PCR相比，敏感性提高10 000倍。于新友［23］、馬騰飛［26］ 、張雨微［27］等多位研究人員報(bào)道建立的DPV SYBR Green熒光定量PCR檢測(cè)DPV的敏感度為18～50 copies·μL-1，比SYBR Green染料法熒光定量PCR檢測(cè)DPV具有更好的靈敏度，能更靈敏地檢測(cè)出低濃度病毒樣品。此外，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法批間及批內(nèi)重復(fù)的變化很小，變異系數(shù)均小于2.0%。綜上表明，所建立的鴨瘟病毒TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法特異、敏感，且具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

病毒增殖規(guī)律研究最常用的兩種手段通常是TCID50法測(cè)定病毒滴度和病毒蝕斑試驗(yàn)，兩種方法存在主觀性、操作繁瑣、誤差大，很難準(zhǔn)確得出病毒在細(xì)胞中的增殖規(guī)律［23］。熒光定量PCR方法可以對(duì)病毒在細(xì)胞中的增殖情況進(jìn)行定量分析。因此，本試驗(yàn)通過(guò)熒光定量PCR方法對(duì)DPV在CEF細(xì)胞中增殖規(guī)律進(jìn)行研究，并與TCID50法進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，兩種方法的測(cè)定結(jié)果呈正相關(guān)，病毒收獲的最佳時(shí)間為感染后60 h。對(duì)于細(xì)胞上清樣品，在8～60 h，病毒核酸拷貝數(shù)和TCID50均上升，到達(dá)60 h峰值后開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì)；對(duì)于細(xì)胞沉淀樣品，熒光定量PCR方法的增殖峰值在60～84 h，TCID50的峰值在36 h，DPV感染細(xì)胞后沉淀中的病毒核酸拷貝數(shù)增殖峰值要晚于TCID50 24 h，可能是由于病毒在細(xì)胞內(nèi)不斷復(fù)制，核酸片段持續(xù)積累，因此核酸拷貝數(shù)的增殖峰值要晚于TCID50。綜上所述，當(dāng)檢測(cè)活病毒時(shí)，TCID50法可反映出具有感染力的活病毒顆粒數(shù)目，證明病毒感染力；熒光定量PCR法測(cè)定的是病毒核酸片段，能夠在未出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變的細(xì)胞中精確檢測(cè)到DPV的病毒含量。本試驗(yàn)從TCID50和病毒核酸拷貝數(shù)對(duì)DPV在CEF細(xì)胞中的增殖規(guī)律進(jìn)行了初步研究，為DPV的致病機(jī)制、細(xì)胞與病毒之間的相互作用奠定基礎(chǔ)。

鴨瘟病毒廣泛分布于感染鴨體內(nèi)的各組織臟器，肝臟、脾臟等病毒含量最高［19］，本試驗(yàn)利用建立的熒光定量PCR方法檢測(cè)DPV人工感染鴨后腦、胸腺、肝臟、脾臟、十二指腸、泄殖腔組織臟器中病毒載量的分布情況，結(jié)果表明，肝臟中的病毒載量較高，說(shuō)明肝臟為鴨瘟強(qiáng)毒株的主要靶器官，與齊雪峰等［28］、張新富等［29］的報(bào)道一致；胸腺中的病毒載量次之，劉菲等［30］報(bào)道免疫器官是DPV侵入鴨體內(nèi)較早增殖分布的靶器官之一；脾臟、十二指腸和泄殖腔中也有不同程度的病毒分布。上述結(jié)果表明本方法可應(yīng)用于DPV感染鴨組織臟器的定量檢測(cè)，有望成為臨床快速診斷鴨瘟的有效手段。

4 結(jié) 論

本研究建立的基于DPV US6基因TaqMan熒光定量PCR方法，特異性強(qiáng)、敏感性高和重復(fù)性好，為DPV檢測(cè)和診斷提供一種準(zhǔn)確、快速的技術(shù)方法。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ 曲哲會(huì)， 張喜文， 魯紹芳， 等. 鴨瘟病毒、鴨坦布蘇病毒和鴨疫里默桿菌多重PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用［J］. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2023， 43（6）：1175-1180.

QU Z H， ZHANG X W， LU S F， et al. Development and preliminary application of multiplex PCR detection methods for duck plague virus， duck Tembusu virus and Riemerella anatipestifer［J］. Chinese Journal of Veterinary Science， 2023， 43（6）：1175-1180. （in Chinese）

［2］ 姚 蕾. 鴨病毒性腸炎的診斷和防治措施［J］. 中國(guó)動(dòng)物保健， 2022， 24（4）：75-77.

YAO L. Diagnosis and prevention of duck virus enteritis［J］. China Animal Health， 2022， 24（4）：75-77. （in Chinese）

［3］ 黃引賢， 歐守杼， 鄺榮祿， 等. 鴨瘟病毒的研究［J］. 華南農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)， 1980， 1（1）：21-36.

HUANG Y X， AU S C， KWONG F J， et al. Investigations on duck plague virus［J］. Journal of South China Agricultural College， 1980， 1（1）：21-36. （in Chinese）

［4］ 陳玉珍. 鴨病毒性腸炎的研究進(jìn)展［J］. 福建畜牧獸醫(yī)， 2022， 44（6）：47-50.

CHEN Y Z. Research progress of duck viral enteritis［J］. Fujian Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， 2022， 44（6）：47-50. （in Chinese）

［5］ 文晶亮. 鴨瘟強(qiáng)毒株和弱毒株在感染鴨體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分析研究［D］. 北京：中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所， 2014.

WEN J L. Dynamic analysis of duck enteritis virus virulent strain and its attenuated strain in experimentally infected ducklings［D］. Beijing： China Institute of Veterinary Drugs Control， 2014. （in Chinese）

［6］ 楊承槐. 鴨腸炎病毒及其致弱毒株基因組的分子特征和生物學(xué)特性［D］. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2014.

YANG C H. Genomic characteristics and biological properties of duck enteritis virus and its attenuated strain［D］. Beijing： China Agricultural University， 2014. （in Chinese）

［7］ 于新友， 李天芝， 苗立中. 鴨瘟病毒Cycleave熒光PCR檢測(cè)方法的建立［J/OL］. 中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)， 2023. ［2024-01-15］ https：//kns. cnki. net/kcms2/article/abstract？v=YRsOmSesWzYMQty-ckMOZ9DX8zDt3raIZUGUaj7IbCy4Gbog3lqVvS6T-LMOMEgU6BWAcojnW6gQyDbKk6uIdNsGv8ENt5-NdyRPjTmX5AX7EgMPBNFQ0frSjI_IqSjlz502lJyF-g2U6hHz2QM1GJ5BVmWQTF29MDvxamp;uniplatfo-rm=NZKPTamp;language=CHS. YU X Y， LI T Z， MIAO L Z. Establishment of a Cycleave real-time PCR assay for detection of Duck plague［J/OL］. Chinese Journal of Animal Infectious Diseases， 2023. ［2024-01-15］https：//kns.cnki.net/kcms2/article/abstract？v=YRsOmSesWzYMQtyckMOZ-9DX8zDt3raIZUGUaj7IbCy4Gbog3lqVvS6TLMOME-gU6BWAcojnW6gQyDbKk6uIdNsGv8ENt5NdyRPjTm-X5AX7EgMPBNFQ0frSjI_IqSjlz502lJyFg2U6hHz2-QM1GJ5BVmWQTF29MDvxamp;uniplatform=NZK PTamp;language=CHS. （in Chinese）

［8］ 楊 荔， 王 聰， 魏 瑞， 等. 鴨病毒性腸炎對(duì)OASL基因表達(dá)影響的研究［J］. 黑龍江畜牧獸醫(yī)， 2018（23）：112-114.

YANG L， WANG C， WEI R， et al. Effect of duck viral enteritis on OASL gene expression［J］. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine， 2018（23）：112-114. （in Chinese）

［9］ WATZINGER F， SUDA M， PREUNER S， et al. Real-time quantitative PCR assays for detection and monitoring of pathogenic human viruses in immunosuppressed pediatric patients［J］. J Clin Microbiol， 2004， 42（11）：5189-5198.

［10］ BELOUSOV Y S， WELCH R A， SANDERS S， et al. Single nucleotide polymorphism genotyping by two colour melting curve analysis using the MGB Eclipse Probe System in challenging sequence environment［J］. Hum Genomics， 2004， 1（3）：209-217.

［11］ LIU L F， TANG Z W， WANG K M， et al. Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase［J］. Analyst， 2005， 130（3）：350-357.

［12］ ALFARESI M S. Comparison of light cycler PCR and conventional susceptibility testing for detection of MRSA from cultures［J］. Saudi Med J， 2005， 26（3）：390-392.

［13］ AITICHOU M， JAVORSCHI S， IBRAHIM M S. Two-color multiplex assay for the identification of orthopox viruses with real-time LUX- PCR［J］. Mol Cell Probes， 2005， 19（5）：323-328.

［14］ 花群義， 金寧一. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究與應(yīng)用進(jìn)展［C］//人畜共患傳染病防治研究新成果匯編. 合肥：中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病分會(huì)， 解放軍軍需大學(xué)， 2004：187-192.

HUA Q Y， JIN N Y. Research and application of real-time fluorescence quantitative PCR［C］//Compilation of New Research Results on the Prevention and Control of Zoonotic Infectious Diseases. Hefei， 2004：187-192. （in Chinese）

［15］ 陳蘇紅， 王小紅， 張敏麗， 等. 復(fù)合探針熒光定量PCR方法的建立［J］. 生物技術(shù)通訊， 2003， 14（2）：127-130.

CHEN S H， WANG X H， ZHANG M L， et al. Fluorescent quantitative PCR with complex probe technique［J］. Letters in Biotechnology， 2003， 14（2）：127-130. （in Chinese）

［16］ 劉 琰. 鴨腸炎病毒gD蛋白亞細(xì)胞定位及其對(duì)病毒感染相關(guān)作用的研究［D］. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2012.

LIU Y. Cellular location and infection related effection of duck enteritis virus gD protein［D］. Harbin： Northeast Agricultural University， 2012. （in Chinese）

［17］ 范 薇. 鴨瘟病毒gD基因發(fā)現(xiàn)及重組蛋白應(yīng)用研究［D］. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2013.

FAN W. Studies on discovery of duck plague virus gD gene and applications of the recombinant gD protein［D］. Ya’an： Sichuan Agricultural University， 2013. （in Chinese）

［18］ AWASTHI S， LUBINSKI J M， EISENBERG R J， et al. An HSV-1 gD mutant virus as an entry-impaired live virus vaccine［J］. Vaccine， 2008， 26（9）：1195-1203.

［19］ 郭宇飛， 程安春， 汪銘書， 等. 鴨病毒性腸炎病毒熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用［J］. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)， 2006， 36（6）：444-448.

GUO Y F， CHENG A C， WANG M S， et al. Establishment and application of quantitative real time PCR assay for detecting duck viral enteritis virus［J］. Veterinary Science in China， 2006， 36（6）：444-448. （in Chinese）

［20］ 郭宇飛， 程安春， 汪銘書， 等. 鴨胚成纖維細(xì)胞中鴨瘟強(qiáng)毒的增殖特性研究［J］. 病毒學(xué)報(bào)， 2008， 24（5）：352-357.

GUO Y F， CHENG A C， WANG M S， et al. Studies on the proparagation characteristics of duck plague virulent virus in duck embryo fibroblasts［J］. Chinese Journal of Virology， 2008， 24（5）：352-357. （in Chinese）

［21］ 石建平， 孟日增， 劉 晶， 等. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)鴨病毒性腸炎標(biāo)準(zhǔn)方法的建立［J］. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2009， 29（7）：849-853.

SHI J P， MENG R Z， LIU J， et al. Establishment a standard real-time PCR for rapid detection of duck virus enteritis［J］. Chinese Journal of Veterinary Science， 2009， 29（7）：849-853. （in Chinese）

［22］ 萬(wàn)春和， 劉榮昌， 陳翠騰， 等. 鴨瘟病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立［J］. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2018， 47（6）：722-728.

WAN C H， LIU R C， CHEN C T， et al. Establishment of a TaqMan real time fluorescent quantitative PCR method for duck enteritis virus［J］. Journal of Fujian Agriculture and Forestry University （Natural Science Edition）， 2018， 47（6）：722-728. （in Chinese）

［23］ 于新友， 李天芝， 王金良， 等. 鴨瘟病毒SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立［J］. 水禽世界， 2014（6）：31-34.

YU X Y， LI T Z， WANG J L， et al. Development of SYBR green Ⅰ real-time PCR assay for detection of duck plague virus［J］. Shuiqin Shijie， 2014（6）：31-34. （in Chinese）

［24］ 湯 承， 索化夷， 岳 華， 等. SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)定量PCR快速檢測(cè)鴨瘟病毒的研究［J］. 中國(guó)動(dòng)物檢疫， 2006， 23（9）：25-27.

TANG C， SUO H Y， YUE H， et al. Establishment of SYBR green Ⅰ real-time fluorescent quantitative PCR for detection of duck plague virus［J］. China Animal Health Inspection， 2006， 23（9）：25-27. （in Chinese）

［25］ 傅光華， 陳翠騰， 劉榮昌， 等. 鴨瘟病毒新近分離毒株部分基因變異分析［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2018， 49（10）： 2215-2222.

FU G H， CHEN C T， LIU R C， et al. Genetic variability of partial genes of duck plaque viruses currently isolated in ducks［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2018， 49（10）： 2215-2222. （in Chinese）

［26］ 馬騰飛. 鴨瘟病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及其強(qiáng)弱毒株UL2基因差異分析［D］. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2015.

MA T F. Development of real-time pcr method for detection of duck enteritis virus and differential analysis of UL2 gene between virulent strain and attenuated strain［D］. Tai’an：Shandong Agricultural University， 2015. （in Chinese）

［27］ 張雨薇. 基于鴨瘟病毒ICP4和UL48基因的熒光定量PCR方法的建立和應(yīng)用［D］. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2016.

ZHANG Y W. Establishment and application of fluorescence quantitative PCR method based on ICP4 and UL48 genes of duck plague virus［D］. Ya’an：Sichuan Agricultural University， 2016. （in Chinese）

［28］ 齊雪峰， 程安春， 汪銘書， 等. 應(yīng)用TaqMan-MGB探針FQ-PCR探討鴨瘟弱毒苗在鴨體內(nèi)的分布及排泄規(guī)律［J］. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2008， 28（7）：766-770.

QI X F， CHENG A C， WANG M S， et al. Biodistribution and excretion of duck plague virus attenuated strain in ducks by real-time PCR using TaqMan-MGB probe technology［J］. Chinese Journal of Veterinary Science， 2008， 28（7）：766-770. （in Chinese）

［29］ 張新富， 胡永浩， 柳金雄， 等. 鴨瘟病毒疫苗株在免疫SPF鴨體內(nèi)的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)檢測(cè)［J］. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)， 2011， 41（5）：514-518.

ZHANG X F， HU Y H， LIU J X， et al. Detection of the growth kinetics of duck enteritis virus vaccine strain in vaccinated SPF duck［J］. Chinese Veterinary Science， 2011， 41（5）：514-518. （in Chinese）

［30］ 劉 菲， 程安春， 汪銘書， 等. 鴨瘟病毒強(qiáng)毒株在急性人工感染成年鴨病例體內(nèi)分布規(guī)律［J］. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2004， 24（3）：228-230.

LIU F， CHENG A C， WANG M S， et al. Study on the distribution regularity of duck plague virus virulent strain in acute experimental infected adult ducks［J］. Chinese Journal of Veterinary Science， 2004， 24（3）：228-230. （in Chinese）

（編輯 白永平）