蒙古馬兩個(gè)類群肌纖維發(fā)育表型及基因表達(dá)譜比較研究

摘 要：

為探究不同類群蒙古馬肌肉生長差異，本研究對(duì)生長環(huán)境差異最大、距離最遠(yuǎn)的蒙古馬類群（巴爾虎馬、烏審馬）的肌肉表型與肌肉分子層面的差異進(jìn)行了比較研究。本研究的試驗(yàn)動(dòng)物分別是3匹生長在陳巴爾虎旗的巴爾虎馬和3匹生長在烏審旗的烏審馬，均為在野外自由放養(yǎng)采食的健康種公馬。每個(gè)類群的平均年齡為5歲，同一類群馬匹體況相近。其中巴爾虎馬宰前活重為（303.10±14.10） kg、胴體重為（148.29±15.43） kg，烏審馬宰前活重為（287.90±37.5） kg、胴體重為（140.83±5.04） kg。將試驗(yàn)動(dòng)物按類群分為2個(gè)組，每組3個(gè)重復(fù)，對(duì)所有試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行屠宰并取其臀中肌，將采集的肌肉樣本石蠟包埋后進(jìn)行HE和免疫組化染色，對(duì)肌纖維面積以及慢肌纖維占比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；同時(shí)對(duì)所采集的肌肉樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，測序結(jié)果使用DESeq2軟件進(jìn)行差異基因的篩選，使用David在線軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，最后通過qRT-PCR對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。本試驗(yàn)通過HE染色和免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，巴爾虎馬臀中肌的肌纖維平均面積為（2 592±180.92）μｍ2，烏審馬臀中肌肌纖維面積為（1 997±73.39） μｍ2，二者差異顯著（Plt;0.05）；巴爾虎馬臀中肌慢肌纖維占比為（10.34±0.59）%，烏審馬臀中肌中慢肌纖維占比為（8.14±0.81）%，二者差異差異不顯著（Pgt;0.05）。本研究在巴爾虎馬和烏審馬的臀中肌中共鑒定出1 103個(gè)差異基因，其中有460個(gè)上調(diào)基因和643個(gè)下調(diào)基因在烏審馬的臀中肌中表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，MYH15、MYOZ2、多個(gè)谷氨酸受體基因和多個(gè)GABAA型受體基因在巴爾虎馬臀中肌中高表達(dá)；MYH6和FOXO1基因在烏審馬臀中肌中高表達(dá)。對(duì)差異基因進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)，GO分析富集到了208個(gè)條目，KEGG分析富集到了65個(gè)通路，所富集到的條目與通路主要和谷氨酸信號(hào)傳導(dǎo)、GABA信號(hào)傳導(dǎo)以及肌肉生長發(fā)育有關(guān)。本試驗(yàn)對(duì)巴爾虎馬和烏審馬的臀中肌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在二者臀中肌肌肉表型方面，巴爾虎馬肌纖維面積顯著大于烏審馬，但慢肌纖維占比差異不顯著；在分子層面二者有較為明顯的差異，這些差異集中在了肌纖維類型、肌纖維面積以及肌肉中肌梭神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)等方面。

關(guān)鍵詞：

巴爾虎馬；烏審馬；肌纖維面積；轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號(hào)：

S821.2"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A """"文章編號(hào)： 0366-6964（2025）02-0643-14

收稿日期：2024-05-20

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（U23A20224）；高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目-種業(yè)振興領(lǐng)軍人才（BR22-11-03）；農(nóng)牧業(yè)廳種業(yè)專項(xiàng)（RK2300003651）；內(nèi)蒙古自治區(qū)科學(xué)技術(shù)廳自治區(qū)科技重大專項(xiàng)（2021ZD0018;2020ZD0004; ZD20190039）

作者簡介：胡瀚文（2000-），男，山東棗莊人，碩士生，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail： havyn0502@qq.com

*通信作者：白東義，主要從事馬屬動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：baidongyi1983@163.com

Comparative Study on Muscle Fiber Development Phenotype and Gene Expression Profile of Two Mongolian Horse Populations

HU" Hanwen1， BAO" Tugeqin1， REN" Xiujuan1， DING" Wenqi1， GONG" Wendian1， JIA" Zijie1， SHI" Lin1， MA" Muren2， Baorigele3， DUGARJAVIIN" Manglai1， BAI" Dongyi1*

（1.Key Laboratory of Equus Germplasm Innovation of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Inner Mongolia Key Laboratory of Equine Science Research and Technology Innovation， Equus Research Center， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010018，" China;

2.Xilinhot Agricultural and Animal Husbandry Technology Extension Center， Xilinhot 026000，" China;

3.Horqin Left Back Banner Livestock and Fishery Technology Service Center， Horqin 028100，" China）

Abstract：

To investigate the differences in muscle growth among different populations of Mongolian horses， the muscle phenotype and molecular-level differences between the Mongolian horse populations with the most significant environmental differences and the greatest geographical distance（Baerhu horse and Wushen horse） was compared. The experimental animals in this study consisted of 3 Baerhu horses raised in the Chenbaerhu Banner and 3 Wushen horses raised in the Wushen Banner. All horses were healthy stallions， free-range grazing in the wild. The average age of the horses in each population was 5 years， with similar body conditions within each population. The pre-slaughter live weight of the Baerhu horses was （303.10±14.10） kg， and the carcass weight was （148.29±15.43） kg. The pre-slaughter live weight of the Wushen horses was （287.90±37.5） kg， and the carcass weight was （140.83±5.04） kg. The experimental animals were divided into two populations based on their breed， with 3 repetitions per group. All animals were slaughtered， and their gluteus medius muscles were collected. After the muscle samples were embedded in paraffin， HE and immunohistochemistry staining were performed. The muscle fiber area and the proportion of slow-twitch muscle fibers were statistically analyzed. Additionally， transcriptome sequencing was conducted on the collected muscle samples. The sequencing data were analyzed for differentially expressed genes using the DESeq2 software， and GO and KEGG enrichment analyses were performed using the David online tool. Finally，

qRT-PCR was used to validate the sequencing results. In this experiment， HE staining and immunohistochemical staining revealed that the average muscle fiber area of the gluteus medius in Baerhu horses was （2 592±180.92） μm2， while in Wushen horses it was （1 997±73.39） μm2， with a significant difference between the two populations （Plt;0.05）. The proportion of slow-twitch muscle fibers in the gluteus medius of Baerhu horses was （10.34±0.59）%， while in Wushen horses it was （8.14±0.81）%， with no significant difference between the two populations （Pgt;0.05）.This study identified a total of 1 103 differentially expressed genes in the gluteus medius of Baerhu and Wushen horses， with 460 upregulated genes and 643 downregulated genes expressed in the gluteus medius of Wushen horses. The study found that MYH15， MYOZ2， several glutamate receptor genes， and several GABAA receptor genes were highly expressed in the gluteus medius of Baerhu horses， while MYH6 and FOXO1 genes were highly expressed in the gluteus medius of Wushen horses. Enrichment analysis of the differentially expressed genes revealed 208 enriched items in the GO analysis and 65 pathways in the KEGG analysis. These enriched items and pathways were mainly associated with glutamate signaling， GABA signaling， and muscle growth and development. This study investigates the gluteus medius muscle of the Baerhu horse and the Wushen horse， finding that the fiber area of the gluteus medius in Baerhu horses is significantly larger than that in Wushen horses， while the proportion of slow muscle fibers shows no significant difference. At the molecular level， there are notable differences between the two populations， particularly in muscle fiber types， fiber area， and neuromuscular signaling in the muscle spindles.

Key words：

Baerhu horse; Wushen horse；muscle fiber area; transcriptome

*Corresponding author： BAI Dongyi， E-mail：baidongyi1983@163.com

蒙古馬是世界上起源最早的馬種之一［1］，目前蒙古馬分為四大類群（巴爾虎馬、百岔馬、烏審馬和烏珠穆沁馬）。在這四大類群中的巴爾虎馬與烏審馬所生長的地理環(huán)境差異最大、地理位置距離最遠(yuǎn)，其中巴爾虎馬主要位于內(nèi)蒙古北部的呼倫貝爾市陳巴爾虎旗、新巴爾虎左旗和新巴爾虎右旗，巴爾虎馬體格較大、體軀粗壯，是蒙古馬中古老而優(yōu)良的類群；烏審馬主要位于內(nèi)蒙古南部鄂爾多斯市的烏審旗一帶，烏審馬體小靈活、速度快、性情溫馴，適合沙漠地區(qū)騎乘和馱運(yùn)。由于內(nèi)蒙古地域遼闊，經(jīng)緯度的不同導(dǎo)致了這兩個(gè)類群蒙古馬生活的環(huán)境存在氣候差異，同時(shí)兩個(gè)地區(qū)的地形地貌也有所不同。巴爾虎馬生存環(huán)境的氣候寒冷，降水較多，地貌多以肥沃草場為主；烏審馬生存環(huán)境的氣候較為溫暖與干旱，地貌多以荒漠為主。環(huán)境的差異除了會(huì)對(duì)馬匹產(chǎn)生直接影響，還會(huì)影響當(dāng)?shù)氐哪敛莘N類與牧草中營養(yǎng)物質(zhì)的含量，從而間接影響馬匹日常的營養(yǎng)攝入。已有多項(xiàng)研究表明［2，3］，動(dòng)物通過攝入不同的營養(yǎng)物質(zhì)會(huì)對(duì)肌肉生長發(fā)育產(chǎn)生不同的影響，這些影響包括對(duì)肌纖維面積和肌纖維類型之間的轉(zhuǎn)化。巴爾虎馬與烏審馬在這4個(gè)類群中的生存環(huán)境差異最大，兩者之間可能存在較大的差異，因此選用巴爾虎馬和烏審馬這兩個(gè)蒙古馬類群作為本試驗(yàn)的研究對(duì)象。

馬匹的肌肉性狀不僅會(huì)影響食用口感，同時(shí)還是影響馬匹運(yùn)動(dòng)水平的一個(gè)決定性因素。肌肉中的肌纖維類型占比可對(duì)肌肉性狀產(chǎn)生重要影響，肌纖維分為慢速氧化型（I型）、快速氧化型（IIａ型）、中間型（IIｘ型）和快速酵解型（IIｂ型）。在慢肌纖維含量占比多的肌肉中有更好的食用口感［4］，同時(shí)慢肌纖維中線粒體多、氧化力強(qiáng)、耐疲勞性強(qiáng)，更適合做長距離耐力型運(yùn)動(dòng)。蒙古馬是一種耐力水平極強(qiáng)的馬種［1］，為蒙古馬所設(shè)立的賽馬比賽也幾乎都是幾十千米的長距離的耐力賽。已有研究表明，適合長途耐力運(yùn)動(dòng)的蒙古馬肌肉中比適合短距離爆發(fā)運(yùn)動(dòng)的純血馬含有更高比例的慢肌纖維［5］，因此蒙古馬肌肉中慢肌纖維占比越高越有利于對(duì)其優(yōu)勢的發(fā)揮。此外，肌纖維面積也會(huì)影響馬匹的運(yùn)動(dòng)性能，多個(gè)研究表明，肌纖維面積與肌肉最大力量呈正相關(guān)［6-8］。肌肉的最大力量可以使馬匹快速產(chǎn)生爆發(fā)力和加速度，同時(shí)可以延緩肌肉疲勞、提高身體穩(wěn)定性，使馬匹能夠在較長時(shí)間內(nèi)保持高質(zhì)量的運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)；肌肉力量還可以有效地支撐關(guān)節(jié)和骨骼，減少馬匹運(yùn)動(dòng)損傷的風(fēng)險(xiǎn)。臀中肌是為馬匹后肢提供動(dòng)力的主要肌肉，同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)臀中肌可能是影響馬匹運(yùn)動(dòng)性能的重要肌肉［5］。因此本研究選擇對(duì)馬匹運(yùn)動(dòng)性能影響較大的臀中肌作為試驗(yàn)研究對(duì)象，并對(duì)臀中肌肌纖維面積和慢肌纖維占比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

目前國內(nèi)外已經(jīng)大量使用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對(duì)肌肉進(jìn)行研究，在利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對(duì)馬匹肌肉的研究中發(fā)現(xiàn)，MYOM2和MYL1可能參與了蒙古馬肌肉快肌纖維向慢肌纖維的轉(zhuǎn)化，CACNB1、IDH3A、IDH3B和MYL6等基因可能與蒙古馬慢肌纖維發(fā)育有關(guān)［9，10］；GYS1、GYS2、GSK3A、AKT1和AKT2等基因與調(diào)控伊犁母馬糖原合成的糖原合酶的活性有關(guān)［11］。本試驗(yàn)將利用轉(zhuǎn)錄組測序?qū)∪夥肿訉用娴牟町愡M(jìn)行比較研究，以此來探究蒙古馬不同類群之間在肌肉這一重要經(jīng)濟(jì)性狀所存在的差異，有利于后續(xù)對(duì)蒙古馬遺傳多樣性的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物樣品采集

本試驗(yàn)的研究動(dòng)物分別是3匹生長在陳巴爾虎旗的巴爾虎馬和3匹生長在烏審旗的烏審馬，均為在野外自由放養(yǎng)采食的種公馬，每個(gè)類群的平均年齡為5歲。同一類群馬匹體況相近，其中巴爾虎馬宰前活重為（303.10±14.10） kg、胴體重為（148.29±15.43） kg，烏審馬宰前活重為（287.90±37.5） kg、胴體重為（140.83±5.04） kg。將試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行屠宰取其臀中?。?2］，將所采集的樣品切割為長約7 cm、直徑約2 cm的肌肉塊，將其裝入50 mL離心管并用4％的多聚甲醛固定24 h后經(jīng)過乙醇梯度脫水至100%無水乙醇溶液，并于4℃低溫儲(chǔ)存供后續(xù)石蠟切片使用；再將所采集的樣品分割為邊長約為0.5 cm的肌肉塊，將其裝入2 mL離心管存放于液氮中，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存供后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.2 石蠟切片

將無水乙醇中肌肉樣本修切成邊長0.5 cm左右的組織塊，二甲苯透明，浸蠟后包埋，再利用切片機(jī)（LeicaRM2245）制成厚度為 4 μｍ的組織切片，最后于烘箱中70℃ 烘片30 min，晾干備用。

1.3 HE染色

將肌肉組織切片進(jìn)行二甲苯脫蠟；梯度酒精水化；蘇木素染細(xì)胞核；自來水沖洗返藍(lán)；伊紅染細(xì)胞質(zhì)；95％酒精脫伊紅；無水乙醇清洗雜質(zhì)；最后中性樹膠封片固定。

1.4 免疫組化染色

將組織切片放入二甲苯脫蠟、梯度酒精回水、抗原修復(fù)、PBS沖洗，試驗(yàn)流程依據(jù) UltraSensitiveTMS-P超敏試劑盒說明書制定，加入試劑Ａ（過氧化物酶阻斷液）室溫孵育10 min；PBS沖洗加入試劑B（正常非動(dòng)物免疫血清）室溫孵育10 min；去掉試劑B，滴加抗肌球蛋白7抗體（兔，稀釋濃度1∶200，Bioss，中國北京），該抗體為第一抗體，與MyHCＩ特異性反應(yīng)。4℃孵育過夜；PBS沖洗加入試劑C（第二抗體）室溫孵育10 min；PBS沖洗加入試劑D（鏈霉菌抗生物素過氧化物酶）室溫孵育10 min；PBS沖洗加入DAB染色；蘇木素染細(xì)胞核；自來水沖洗返藍(lán)；無水乙醇清洗雜質(zhì)；中性樹膠封片固定。

1.5 肌纖維表型信息統(tǒng)計(jì)

將6匹馬的臀中肌染色切片用顯微鏡放大400倍（目鏡10×，物鏡40×）進(jìn)行觀察，并將每匹馬的染色切片截取5個(gè)視野進(jìn)行后續(xù)分析。利用image pro和imagej圖像處理軟件對(duì)肌纖維個(gè)數(shù)與肌纖維面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.6 RNA測序

將6匹蒙古馬臀中肌肌肉樣品使用Trizol試劑（Invitrogen，加利福尼亞州，美國）和動(dòng)物組織RNA純化試劑盒TRK1002（LCSience，得克薩斯州休斯敦市，美國）提取總RNA，使用Agilent 2100生物分析儀和Agilent RNA6000納米試劑盒（Agilent，加利福尼亞州，美國）對(duì)RNA的數(shù)量和質(zhì)量進(jìn)行分析，然后使用mRNA-Seq樣品制備試劑盒（Illumina，加利福尼亞州圣地亞哥市，美國）生成測序文庫。文庫在Illumina Hiseq 4000平臺(tái)上測序，生成2×150 bp的配對(duì)端reads。

1.7 測序數(shù)據(jù)分析

使用FastQC（https：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控；使用HISAT2（version 2.0.5）軟件將質(zhì)控后的reads比對(duì)到參考基因組（Equcab3.0，ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/002/863/925/GCF_002863925.1_EquCab3.0）；使用stringtie構(gòu)建蒙古馬肌肉樣本表達(dá)譜；將標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為P adjlt;0.05且|log2 （Fold Change）|≥1，并用DESeq2軟件進(jìn)行差異基因篩選；最后使用David（https：//david.ncifcrf.gov/）在線軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

本試驗(yàn)選擇GAPDH作為內(nèi)參基因［13-15］，隨機(jī)選取6個(gè)差異基因于上海生工生物工程公司合成引物（表1）。用Trizol提取本試驗(yàn)所采集的臀中肌肌肉樣本中總RNA，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測濃度較高且OD值在1.8～2.0之間的RNA用于后續(xù)試驗(yàn)。根據(jù)PrimeScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，中國）說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。再使用TB Green Premix Ex TaqTM II定量試劑盒（TaKaRa，中國）進(jìn)行后續(xù)qRT-PCR驗(yàn)證，反應(yīng)體體系總體積為20μL：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ?yàn)?0 μL，ROX Reference DyeⅡ?yàn)?.4 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.8 μL，cDNA為2.0 μL和6.0 μL的ddH2O 。每個(gè)樣品重復(fù)3次，95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，42個(gè)循環(huán)；熔解曲線60℃進(jìn)行1 min， 95℃進(jìn)行15s，每5s增加0.5℃熔解曲線。結(jié)果采用2-ΔΔCt定量分析方法進(jìn)行表達(dá)量分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)對(duì)肌纖維表型的統(tǒng)計(jì)分析主要涉及到了標(biāo)準(zhǔn)誤與P值的計(jì)算。通過計(jì)算每個(gè)樣本平均值的標(biāo)準(zhǔn)差得到標(biāo)準(zhǔn)誤，標(biāo)準(zhǔn)誤數(shù)值越小樣本數(shù)據(jù)越能代表總體數(shù)據(jù)；通過獨(dú)立雙樣本T檢驗(yàn)得到兩組數(shù)據(jù)之間的P值，Plt;0.05即可推斷兩組數(shù)據(jù)差異顯著。

本試驗(yàn)首先將得到的肌纖維表型數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行整理，通過計(jì)算每匹馬的平均肌纖維表型數(shù)據(jù)，得到同一類群馬匹的平均肌纖維表型數(shù)據(jù)，利用GraphPad Prism軟件計(jì)算同一類群肌纖維表型數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)誤，同時(shí)利用GraphPad Prism軟件對(duì)得到的肌纖維表型數(shù)據(jù)平均值進(jìn)行T檢驗(yàn)，得到P值。

2 結(jié) 果

2.1 肌肉表型差異

本試驗(yàn)通過HE染色對(duì)肌纖維面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖1），發(fā)現(xiàn)巴爾虎馬臀中肌的肌纖維平均面積為（2 592±180.92）μｍ2，烏審馬臀中肌肌纖維面積為（1 997±73.39） μｍ2（表2），二者差異顯著（Plt;0.05）。同時(shí)本試驗(yàn)通過免疫組化染色對(duì)慢肌纖維占比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖2），發(fā)現(xiàn)巴爾虎馬臀中肌慢肌纖維占比為（10.34±0.59）%，烏審馬臀中肌中慢肌纖維占比為（8.14±0.81）%，巴爾虎馬臀中肌中的慢肌纖維較多，但與烏審馬相比差異不顯著（Pgt;0.05，表2）。

2.2 差異基因的表達(dá)與鑒定

本研究在巴爾虎馬和烏審馬的臀中肌中共鑒定出1 103個(gè)差異基因，其中有460個(gè)上調(diào)基因和643個(gè)下調(diào)基因在烏審馬的臀中肌中表達(dá)（圖3）。在這些鑒定出來的差異基因中包括與肌纖維生長發(fā)育有關(guān)的MYH6、MYH15、MYOZ2和FOXO1等基因，和多個(gè)與神經(jīng)傳導(dǎo)有關(guān)的基因，其中包括多個(gè)可以編碼谷氨酸離子型受體和代謝型受體的基因，如GRIA、GRIK、GRIN、GRID和GRM相關(guān)基因，還包含多個(gè)GABAA型受體基因，包括GABRA、GABRB、GABRG和GABRR等基因。通過分層聚類圖（圖4）可以發(fā)現(xiàn)MYH15、MYOZ2、多個(gè)谷氨酸受體基因和多個(gè)GABAA型受體基因在巴爾虎馬臀中肌中高表達(dá)，MYH6和FOXO1基因在烏審馬臀中肌中高表達(dá)。

2.3 差異基因的GO富集分析

差異基因的GO分析共富集到了208個(gè)條目，包括110個(gè)生物過程（biological process，BP）條目，44個(gè)細(xì)胞組分（cellular component，CC）條目和54個(gè)分子功能（molecular function，MF）條目。其中BP主要富集到了突觸傳遞，谷氨酸能途徑（synaptic transmission， glutamatergic）、γ-氨基丁酸信號(hào)傳遞途徑（gamma-aminobutyric acid signaling pathway）和突觸組織（synapse organization）等。CC主要富集到了谷氨酸能突觸（glutamatergic synapse）、GABA-A 受體復(fù)合物（GABA-A receptor complex）和肌動(dòng)蛋白復(fù)合物（myosin complex）等。MF主要富集到了谷氨酸受體活性（glutamate receptor activity）、GABA-A受體活性（GABA-A receptor activity）、鈣離子結(jié)合（caicium ion binding）和肌動(dòng)蛋白結(jié)合（actin binding）等（圖5）。在GO富集到的這些條目中，少量的富集到了與肌肉發(fā)育相關(guān)的條目，大量富集到了與神經(jīng)傳導(dǎo)相關(guān)的條目，以上這些所富集到的條目與所鑒定到的部分差異基因結(jié)果趨勢相符。

2.4 差異基因的KEGG富集分析

差異基因的KEGG分析共富集到了65個(gè)通路，其中主要富集到了尼古丁成癮（nicotine addiction）、谷氨酸能突觸（glutamatergic synapse）、PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、馬達(dá)蛋白（motor proteins）、GABA能突觸（GABAergic synapse）和mTOR信號(hào)通路（mTOR signaling pathway）等與肌肉發(fā)育或神經(jīng)傳導(dǎo)相關(guān)的通路（圖6），其中差異最顯著的尼古丁成癮通路中包含了大量編碼谷氨酸受體以及GABAA型受體的基因。KEGG分析結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了巴爾虎馬與烏審馬臀中肌之間的主要差異包括由谷氨酸受體基因和GABAA型受體基因所造成的肌肉神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)方面的差異。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA-Seq的結(jié)果是否準(zhǔn)確，以GAPDH為內(nèi)參基因，隨機(jī)選取6個(gè)差異基因（IVD、PEAR1、MYH6、NYAP2、SYT4和CALML5）進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。qRT-PCR結(jié)果與RNA-Seq的表達(dá)趨勢一致，表明RNA-Seq數(shù)據(jù)可靠（圖7）。

3 討 論

3.1 巴爾虎馬與烏審馬臀中肌肌纖維表型差異

通過HE染色和慢肌纖維免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，巴爾虎馬與烏審馬的臀中肌肌纖維表型的主要差異體現(xiàn)在肌纖維面積方面，巴爾虎馬臀中肌肌纖維面積顯著大于烏審馬，同時(shí)二者臀中肌中的慢肌纖維占比差異不顯著。因此只從肌纖維對(duì)運(yùn)動(dòng)性能的影響考慮，推測二者耐力運(yùn)動(dòng)水平相當(dāng)，但由于肌纖維面積的差異，巴爾虎馬可能擁有更強(qiáng)的肌肉力量與爆發(fā)力，同時(shí)運(yùn)動(dòng)受傷風(fēng)險(xiǎn)也相對(duì)較小。肌纖維面積與動(dòng)物品種、營養(yǎng)狀況和生存環(huán)境有關(guān)，在本研究中的巴爾虎馬長期生長在有肥沃草場、牧草種類豐富、營養(yǎng)價(jià)值高的陳巴爾虎旗［16］，而烏審馬所在的烏審旗的地貌多為草原化荒漠，牧草資源相對(duì)匱乏［17］，烏審馬日常所能獲得的營養(yǎng)物質(zhì)種類和水平可能低于巴爾虎馬，同時(shí)動(dòng)物所攝取到的營養(yǎng)物質(zhì)水平越高越能促進(jìn)動(dòng)物骨骼肌肌纖維肥大［18，19］。因此推測，環(huán)境的差異導(dǎo)致二者所能攝取到的營養(yǎng)物質(zhì)的種類與水平不同是導(dǎo)致二者臀中肌中肌纖維面積存在顯著差異的可能原因之一。

3.2 影響巴爾虎馬與烏審馬臀中肌肌肉生長發(fā)育和肌纖維面積相關(guān)的差異基因

在鑒定出來的差異基因中，MYOZ2是巴爾虎馬臀中肌中顯著上調(diào)的基因，是骨骼肌Z線組成的結(jié)構(gòu)蛋白［20］。多個(gè)研究表明，MYOZ2的表達(dá)量與肌肉的生長發(fā)育密切相關(guān)［21，22］，相較于胎兒期，成年期蒙古馬肌肉中MYOZ2基因高表達(dá)［23］，還有研究發(fā)現(xiàn)成年動(dòng)物中MYOZ2基因在骨骼肌的慢肌纖維中特異性表達(dá)［24］。在本試驗(yàn)中，雖然二者在慢肌纖維占比方面差異不顯著，但MYOZ2基因的表達(dá)趨勢與表型結(jié)果相符。

差異基因分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO1基因在烏審馬臀中肌中高表達(dá)，F(xiàn)OXO1基因可以對(duì)肌纖維類型的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生直接的影響，會(huì)減少肌肉中的慢肌纖維數(shù)量［25］。在骨骼肌中特異性過表達(dá)FOXO1的轉(zhuǎn)基因小鼠中，小鼠體重變輕，骨骼肌質(zhì)量減少，慢肌纖維相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)［26］，以上研究結(jié)果與本試驗(yàn)表型結(jié)果的趨勢相符。除了對(duì)肌纖維類型的影響外，F(xiàn)OXO1基因主要參與了骨骼肌萎縮［27］，F(xiàn)OXO1基因的過度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致肌纖維面積減少［28］，抑制小鼠肌肉中FOXO1的表達(dá)可以有效阻止肌纖維面積的減少，并且可以起到延緩肌少癥發(fā)生的作用［29］。本研究中，在FOXO1上調(diào)的烏審馬臀中肌中的肌纖維面積顯著小于巴爾虎馬，本研究結(jié)果與以往研究相符。

肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MyHC）是構(gòu)成肌肉中肌球蛋白分子的一部分，在哺乳動(dòng)物中，已有11個(gè)基因可以編碼MyHC，并且這些基因在進(jìn)化過程中高度保守［30］。MyHC有4種亞型，即I、IIa、IIx和IIb，MyHC的4種亞型分別代表著4種不同類型的肌纖維，由不同的MyHC組成的肌肉具有不同的收縮能力和ATP酶活性，其中MyHCI型在慢肌纖維中高表達(dá)［31］。本研究鑒定到的差異基因MYH6在烏審馬臀中肌中顯著上調(diào)表達(dá)，MYH6是作為編碼MyHCI重鏈的一個(gè)亞基的基因，并且與MyHCI的表達(dá)之間成負(fù)相關(guān)［32］，因此理論上當(dāng)MYH6的表達(dá)水平升高時(shí)會(huì)抑制MyHCI的表達(dá)，而MyHCI表達(dá)被抑制則可以推斷肌肉中的慢肌纖維含量較少。同時(shí)在對(duì)兔骨骼肌的研究中發(fā)現(xiàn)，MYH6的表達(dá)量與肌纖維面積成負(fù)相關(guān)［33，34］，這些研究與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致。

差異基因分析還發(fā)現(xiàn)，多個(gè)γ-氨基丁酸A型受體（gamma-aminobutyric acid type A，GABAA）基因在巴爾虎馬臀中肌中顯著上調(diào)，GABAA型受體是一類通過配體門控的離子通道，參與了神經(jīng)突觸的快速信息傳遞，這也是本研究富集到了多個(gè)與神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)通路的主要原因之一。γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，GABA可與GABAA型受體結(jié)合，產(chǎn)生神經(jīng)抑制或興奮。GABA還是一種小分子量的非蛋白型氨基酸，具有食用安全性［35］，可添加于食品中通過外源攝入讓肌肉通過GABAA受體接收到更多GABA信號(hào)，而有研究表明通過外源攝入的GABA可以增加肌纖維面積［36］。同時(shí)有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GABA可以促進(jìn)生長激素（growth hormone，GH）的釋放［37］，當(dāng)GH作用到肝臟的時(shí)候，肝臟會(huì)分泌胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor-1，IGF1），進(jìn)而通過IGF-1/PI3K/AKT信號(hào)通路影響mTOR信號(hào)通路，而這兩個(gè)通路均在本研究中被富集。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）是一種保守的蛋白激酶， 在骨骼肌肥大中起至關(guān)重要的作用，mTOR可調(diào)控下游核糖體蛋白p70s6k和真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1 （4e-binding protein1，4E-BP1） ， 進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和骨骼肌肥大［38］。

有試驗(yàn)用不同濃度GABA飼喂小鼠，發(fā)現(xiàn)肌肉中GABAA型受體的基因表達(dá)量也有所增加［39］。由此推測，哺乳動(dòng)物通過外源攝入GABA可以增加肌肉中GABAA型受體基因的含量，進(jìn)而可以接收更多的外源性GABA信號(hào)，形成正向循環(huán)。巴爾虎馬的生長地屬于高緯度的寒冷地帶，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)低溫可以增加植物體內(nèi)GABA含量［40-43］，推測巴爾虎馬生長地的植物可能會(huì)含有較多的GABA。因此本研究初步猜測可能由于環(huán)境溫度差異導(dǎo)致巴爾虎馬進(jìn)食了富含較多GABA的植物導(dǎo)致肌肉中GABAA型受體基因含量增加，并進(jìn)一步增大了巴爾虎馬臀中肌的肌纖維面積。

3.3 影響巴爾虎馬與烏審馬臀中肌肌梭信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的差異基因

MYH15是MYH6的旁系同源物，參與肌動(dòng)蛋白結(jié)合和細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)活性，在本研究中MYH15在巴爾虎馬臀中肌中顯著上調(diào)表達(dá)。MYH15除了作為肌球蛋白重鏈會(huì)直接對(duì)肌肉產(chǎn)生影響外［44］，還有研究發(fā)現(xiàn)MYH15在肌梭中有所表達(dá)［45］。MYH15對(duì)肌梭有重要影響，肌梭的肌球蛋白表達(dá)譜在整個(gè)肌梭中區(qū)域性變化，并且亞型變化影響肌球蛋白-肌動(dòng)蛋白跨橋動(dòng)力學(xué)［46，47］。肌梭是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最重要的本體感受器，可以根據(jù)肌肉受到的拉伸與收縮激活相關(guān)機(jī)械力門控離子通道，將機(jī)械力信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，并傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，影響肌肉的后續(xù)活動(dòng)。一個(gè)典型的肌梭由梭內(nèi)纖維、梭囊、感覺神經(jīng)纖維末梢和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維末梢組成。在梭內(nèi)纖維方面，根據(jù)形態(tài)和表達(dá)的MyHC亞型的不同可分為核袋纖維1（nuclear bag 1 fiber）、核袋纖維2 （nuclear bag 2 fiber）和核鏈纖維（nuclear chain fiber）［48］。由于不同的梭內(nèi)纖維表達(dá)的MyHC亞型不同，因此初步推測二者肌梭中不同類型的梭內(nèi)纖維數(shù)量與比例存在差異，同時(shí)二者梭內(nèi)纖維的差異可能是影響本試驗(yàn)中MYH15與MYH6基因的表達(dá)量出現(xiàn)差異的因素之一。

在感覺神經(jīng)方面，肌梭中感覺神經(jīng)的信號(hào)傳導(dǎo)與谷氨酸有較大聯(lián)系。谷氨酸可通過激活兩類受體來發(fā)揮作用，兩類受體分別為代謝型谷氨酸受體（metatropic glutamate receptors，mGluRs）和離子型谷氨酸受體（iontropic glutamate receptors，iGluRs）［49］。在富集分析中發(fā)現(xiàn)，大量的差異基因富集到了一系列谷氨酸受體相關(guān)信號(hào)通路，在差異基因分析結(jié)果中，絕大多數(shù)的谷氨酸受體的相關(guān)基因在巴爾虎馬臀中肌中上調(diào)表達(dá)。

肌梭中感覺神經(jīng)末梢有大量突觸小泡，這些突觸小泡可以分泌代謝型谷氨酸［50］。代謝型谷氨酸受體可進(jìn)一步分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組。其中I組的代謝型谷氨酸受體（可被差異基因GRM1編碼）主要定位于突觸后膜，可通過與Gq蛋白偶聯(lián)增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放［51］，在本試驗(yàn)GO分析的結(jié)果中富集到差異基因數(shù)目最多的條目為鈣離子結(jié)合。同時(shí)I組代謝型谷氨酸受體可以激活其他效應(yīng)蛋白，其中包括mTOR信號(hào)通路［52］，mTOR信號(hào)通路在本試驗(yàn)KEGG分析中被顯著富集，已有多個(gè)研究表明mTOR可以通過激活下游因子促進(jìn)肌纖維肥大［38，53］，這些報(bào)道與本研究結(jié)果相符。離子型谷氨酸受體分為4個(gè)亞型：離子型谷氨酸受體包括N-甲基-D-天冬氨酸受體（n-methyl-d-aspartate receptor，NMDAR）、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑烯丙酸受體（alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor，AMPAR）、海人藻酸受體（kainate receptor， KAR）和δ受體［52］，這些受體可分為NMDA受體和非NMDA受體，在本研究的差異基因中均包含可以編碼這4個(gè)亞型的基因。谷氨酸NMDA受體（可被差異基因GRIN2A和GRIN2B編碼）活性主要與Ca2+內(nèi)流相關(guān)，同時(shí)可以抑制FOXO1基因的表達(dá)［54］。以上內(nèi)容與試驗(yàn)結(jié)果一致，并且也說明谷氨酸受體可能會(huì)間接通過影響mTOR信號(hào)通路與FOXO1基因?qū)±w維面積產(chǎn)生影響。

離子型谷氨酸KA受體家族的5種亞基GluK1～GluK5分別由GRIK1～GRIK5基因編碼［55］，本試驗(yàn)中這5個(gè)基因均為顯著差異基因。在對(duì)秀麗隱桿線蟲的研究中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)可以感應(yīng)寒冷溫度的受體蛋白GLR-3 ，GLR-3在哺乳動(dòng)物中對(duì)應(yīng)的是由GRIK2基因編碼的GluK2蛋白。此研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，GluK2可能為受體型冷傳感器，而非冷激活通道，同時(shí)發(fā)現(xiàn)GluK2可能會(huì)感覺到小鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中的低溫［56］，而背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元是感覺傳導(dǎo)初級(jí)神經(jīng)元，與肌梭中感覺神經(jīng)元有重要聯(lián)系。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，過表達(dá)南極獨(dú)角雪冰魚和尼羅羅非魚基因GRIK1均能通過抑制凋亡重要轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)而減少因低溫脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，同時(shí)由于兩種魚類的生存溫度差異較大，此試驗(yàn)猜測GRIK1在南極魚中有更多的拷貝數(shù)或者表達(dá)量更高［57］。因此本試驗(yàn)推測，由于巴爾虎馬長期生長在寒冷的高緯度地區(qū)，二者生長地環(huán)境溫度的不同導(dǎo)致谷氨酸KA受體基因出現(xiàn)了差異。

同時(shí)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，差異基因SLC17A6與SLC17A8在巴爾虎馬臀中肌中上調(diào)，這兩個(gè)基因分別編碼囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（vesicular glutamate transporter 2，VGLUT2）和囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3（vesicular glutamate transporter 3，VGLUT3），神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸可以通過這些蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到突觸小泡中，然后再釋放到突觸間隙進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)［58］。在脊椎動(dòng)物的肌肉中，位于神經(jīng)肌肉接頭處參與信號(hào)傳導(dǎo)的因子主要為乙酰膽堿（acetylcholine，ACh），因此在肌肉中谷氨酸受體的存在位置多為肌梭的感覺神經(jīng)末梢處。已有研究發(fā)現(xiàn)，肌梭所造成的牽張反射可以增強(qiáng)肌肉力量［59］，同時(shí)還有研究發(fā)現(xiàn)興奮后的肌梭主要通過肌梭內(nèi)的Iα傳入神經(jīng)纖維與α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元提高機(jī)體的神經(jīng)募集運(yùn)動(dòng)單位的能力［60，61］，而運(yùn)動(dòng)單位所能被募集的數(shù)量與肌肉力量成正相關(guān)［62］。本研究推測，巴爾虎馬臀中肌中可能有更多參與肌梭信號(hào)傳導(dǎo)的谷氨酸受體基因，也因此巴爾虎馬臀中肌中的肌梭可能更多或更活躍，進(jìn)而導(dǎo)致巴爾虎馬相較于烏審馬會(huì)有更大的肌肉力量，同時(shí)能表現(xiàn)出更好的運(yùn)動(dòng)控制與運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)生長環(huán)境差異最大、距離最遠(yuǎn)的兩個(gè)蒙古馬類群（巴爾虎馬、烏審馬）的臀中肌進(jìn)行肌肉表型與肌肉轉(zhuǎn)錄組的研究發(fā)現(xiàn)，巴爾虎馬臀中肌肌纖維面積顯著大于烏審馬，但二者慢肌纖維占比差異不顯著。差異基因分析的結(jié)果表明，MYH6、FOXO1、GABAA型受體基因和谷氨酸受體基因可能對(duì)蒙古馬的肌纖維面積產(chǎn)生影響，其中GABAA型受體基因和部分谷氨酸受體基因可以間接通過影響mTOR信號(hào)通路與FOXO1基因?qū)±w維面積產(chǎn)生影響。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，影響肌梭中梭內(nèi)纖維的MYH15與影響肌梭中感覺神經(jīng)纖維信號(hào)傳導(dǎo)的多個(gè)谷氨酸受體基因的表達(dá)量在本試驗(yàn)中差異顯著，推測巴爾虎馬和烏審馬臀中肌肌梭之間存在差異。本試驗(yàn)結(jié)果有助于加強(qiáng)蒙古馬在重要經(jīng)濟(jì)性狀方面的選育工作，同時(shí)推動(dòng)了對(duì)蒙古馬遺傳多樣性的進(jìn)一步研究。

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（編輯 郭云雁）