miR-665靶向BCL2L11調(diào)控武安山羊成肌細(xì)胞增殖

摘 要：

旨在利用分子生物學(xué)方法探究miR-665靶向調(diào)控BCL2L11對(duì)山羊成肌細(xì)胞增殖的影響。本研究選取1月齡和9月齡的健康山公羊各3只，各年齡段體重均接近且飼養(yǎng)環(huán)境相同。本試驗(yàn)通過(guò)RT-qPCR分析BCL2L11在武安山羊不同組織中的表達(dá)情況；利用RT-qPCR檢測(cè)了不同月齡武安山羊背最長(zhǎng)肌組織中BCL2L11和miRNA-665的表達(dá)情況；構(gòu)建了BCL2L11 3′UTR野生型和突變型載體，以及miR-665 mimics和對(duì)照組，將其共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞，通過(guò)使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)鑒定了miR-665與BCL2L11存在靶向性關(guān)系。在山羊成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-665 mimic及陰性對(duì)照，采用RT-qPCR檢測(cè)了細(xì)胞凋亡標(biāo)志因子X(jué)IAP和Fas表達(dá)水平，同時(shí)利用EdU試驗(yàn)分析miR-665過(guò)表達(dá)對(duì)山羊成肌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，BCL2L11在背最長(zhǎng)肌組織中高表達(dá)；miR-665和 BCL2L11在9月齡和1月齡山羊背最長(zhǎng)肌組織中表達(dá)情況存在差異，miR-665在1月齡的表達(dá)量高于9月齡，而B(niǎo)CL2L11則相反，兩者存在負(fù)調(diào)控現(xiàn)象；通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告分析顯示，當(dāng)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)miR-665 mimic后，顯著抑制了BCL2L11熒光素酶的活性，同時(shí)靶基因BCL2L11 的mRNA表達(dá)水平也明顯降低。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-665的功能，轉(zhuǎn)染miR-665 mimic后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡標(biāo)志基因XIAP與Fas的表達(dá)量也顯著降低；EdU試驗(yàn)分析顯示，過(guò)表達(dá)miR-665后促進(jìn)了成肌細(xì)胞的增殖。綜上所述，在山羊背最長(zhǎng)肌組織中miR-665作為BCL2L11的調(diào)控元件，能夠顯著抑制山羊成肌細(xì)胞中BCL2L11的表達(dá)水平，當(dāng)miR-665過(guò)表達(dá)后，能夠促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖情況。

關(guān)鍵詞：

miR-665；BCL2L11；肌肉；武安山羊；成肌細(xì)胞

中圖分類(lèi)號(hào)：

S827.2 """"文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A """"文章編號(hào)： 0366-6964（2025）02-0582-09

收稿日期：2024-08-09

基金項(xiàng)目：天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（23YFZCSN00170；23ZYCGSN00090）；天津市自然科學(xué)基金（23JCYBJC00260）；天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院種業(yè)創(chuàng)新項(xiàng)目（2024ZYCX012）

作者簡(jiǎn)介：馮 婧（1986-），女，黑龍江哈爾濱人，助理研究員，主要從事?tīng)I(yíng)養(yǎng)與繁殖調(diào)控研究，E-mail：fengjing_2024@126.com

*通信作者：張金龍，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail： jlzhang1010@163.com

miR-665 Targeting BCL2L11 Regulates the Myoblasts Proliferation of Wu’an Goat

FENG" Jing1，2，3， SHENG" Hui1，2，3， ZHANG" Xiaosheng1，2，3， GUO" Xiaofei1，2，3 ， YAO" Dawei1，2，3， LI" Yupeng1，2，3， CHEN" Longbin 1，2，3， ZHANG" Jinlong1，2，3*

（1.Institute of Animal Science and Veterinary， Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300381，" China;

2.Tianjin Key Laboratory of Animal Molecular Breeding and Biotechnology， Tianjin 300381，" China;

3.Tianjin Engineering Research Center of Animal Healthy Farming， Tianjin 300381，" China）

Abstract：

This study aimed to use molecular biological methods to explore the effect of miR-665 targeting BCL2L11 on the myoblasts proliferation of goat. Three healthy male Wu’an goats aged 1 month and 9 months each， with similar body weights and feeding environments for each age group was selected.The expression of BCL2L11 and miRNA-665 in the longest dorsal muscle tissue of Wu′an goats at different ages was detected using RT-qPCR; The expression of BCL2L11 in different tissue of Wu′an goats was also detected by RT-qPCR; Wild-type and mutant vectors of BCL2L11 3′UTR， as well as miR-665 mimics and control groups， were constructed and cotransfected into HEK293T cells. The targeting relationship between miR-665 and BCL2L11 was identified using a dual luciferase reporter gene detection system. The goat myoblasts were transfected with miR-665 mimic and negative control， and the expression levels of apoptosis markers factors XIAP and Fas were detected by RT-qPCR， and the effect of miR-665 overexpression on the proliferation of goat myoblasts was analyzed by EdU test simultaneously. The results showed that BCL2L11 was highly expressed in the longissimus dorsi muscle tissue; There were differences in the expression of miR-665 and BCL2L11 in the longissimus dorsi muscle tissue of goats aged 9-months and 1-months， and the expression of miR-665 at 1-month was higher than that at 9-month，while the expression of BCL2L11 was opposite，and the two were negative regulated;The dual luciferase report analysis showed that， after transfecting overexpressed miR-665 mimic， the luciferase activity of BCL2L11 was significantly inhibited， and the mRNA expression level of the target gene BCL2L11 was also significantly reduced. In order to further verify the function of miR-665， the expression of apoptosis marker genes XIAP and Fas was also significantly reduced after transfection of miR-665 mimic; EdU test analysis showed that the proliferation of myoblasts increased significantly after overexpression of miR-665. To sum up，miR-665 as a regulatory element of BCL2L11 in goat longissimus dorsi muscle tissue， could significantly inhibit the expression level of BCL2L11 in goat myoblasts，when miR-665 was overexpressed， it could promote the proliferation of myoblasts.

Key words：

miR-665; BCL2L11; muscle; Wu’an goat; myoblast

*Corresponding author： ZHANG Jinlong， E-mail： jlzhang1010@163.com

山羊是人類(lèi)最早馴化的家畜之一，在10 000多年前的新石器時(shí)期已存在馴養(yǎng)山羊的歷史［1］。在漫長(zhǎng)的馴化和選育過(guò)程中，山羊表現(xiàn)出了較好的肉質(zhì)特性。因此，為了滿(mǎn)足消費(fèi)者對(duì)羊肉日益增長(zhǎng)的需求，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)久以來(lái)的人工選育和改良，培育出了多個(gè)山羊品種［2］。在中國(guó)北方地區(qū)已培育出幾個(gè)優(yōu)良品種，并表現(xiàn)出良好的遺傳穩(wěn)定性，如武安山羊［3］。

microRNA（miRNA）是一類(lèi)較小的非編碼RNA，在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要的作用，通過(guò)與靶基因mRNA的3′UTR區(qū)結(jié)合以促進(jìn)mRNA的降解或抑制翻譯，從而進(jìn)一步發(fā)揮生物學(xué)功能［4］。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA不僅通過(guò)經(jīng)典的RNA干擾機(jī)制調(diào)控基因表達(dá)，還可以通過(guò)與多種功能蛋白相結(jié)合來(lái)直接調(diào)控蛋白質(zhì)的功能［5，6］。miRNA的非經(jīng)典作用機(jī)制，包括miRNA前體可編碼多肽、miRNA與其他功能蛋白相結(jié)合、miRNA直接激活TLR受體蛋白、miRNA提高蛋白表達(dá)水平等，在發(fā)揮抑制劑作用的同時(shí)，也能夠在翻譯的過(guò)程中起到上調(diào)靶向mRNA表達(dá)的作用［7］。因此，miRNA作為分子調(diào)控元件參與調(diào)節(jié)各種生物學(xué)功能，如細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡及分化［8-10］。大量研究表明，miRNA對(duì)生物體重要組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育起到至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，比如參與肌肉發(fā)育調(diào)控［11］，治療肌肉損傷修復(fù)［12］。研究證明，miRNA在衰老和病理過(guò)程中多個(gè)水平上調(diào)控肌肉的穩(wěn)態(tài)，通過(guò)控制肌肉發(fā)生、肌肉生長(zhǎng)（肥大）和萎縮以及肌肉與其他組織的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)［13］。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-665在不同細(xì)胞中有著促增殖、抑制凋亡的作用［14］。這些研究強(qiáng)調(diào)了miRNA介導(dǎo)并調(diào)控肌肉發(fā)育過(guò)程的重要性，因此探究新的能夠影響肌肉發(fā)育的miRNA則成為值得關(guān)注的焦點(diǎn)。

BCL2L11是BCL2家族的成員，位于線(xiàn)粒體的外膜中，是介導(dǎo)興奮性細(xì)胞凋亡、凋亡誘導(dǎo)因子易位和線(xiàn)粒體去極化的重要調(diào)節(jié)因子［15］。研究表明，BCL2L11具有調(diào)控山羊顆粒細(xì)胞凋亡的作用［16］。細(xì)胞凋亡是由半胱天冬酶激活并介導(dǎo)的一種細(xì)胞程序性死亡過(guò)程。細(xì)胞凋亡可以通過(guò)線(xiàn)粒體依賴(lài)性途徑由BCL2家族蛋白調(diào)節(jié)，抗凋亡的BCL2成員具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，此外BCL2家族的促凋亡成員，包括BCL2L11，是僅含BH3結(jié)構(gòu)域的蛋白［17］。盡管BCL2L11在很多生物過(guò)程中的作用已報(bào)道，但BCL2L11在山羊肌肉組織中的表達(dá)情況尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究旨在探究過(guò)表達(dá)或干擾miR-665對(duì)武安山羊成肌細(xì)胞增殖的影響，利用軟件預(yù)測(cè)到miR-665與其靶基因BCL2L11的結(jié)合位點(diǎn)，為闡明miR-665在武安山羊成肌細(xì)胞中的遺傳調(diào)控機(jī)制，解釋miR-665對(duì)于BCL2L11基因的抑制作用，從而為探究其影響成肌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用武安山羊均飼養(yǎng)于天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所試驗(yàn)羊場(chǎng)，考慮1月齡的山羊處于快速生長(zhǎng)階段，9月齡的山羊已經(jīng)接近成熟，其肌肉組成和功能可能已經(jīng)穩(wěn)定，兩者的對(duì)比選擇對(duì)肌肉發(fā)展和生理變化研究較為典型或有意義，故隨機(jī)選擇1月齡和9月齡山羊各3只，共6只，所有試驗(yàn)羊飼養(yǎng)環(huán)境相同。屠宰后，取其心、肝、脾、肺、腎、背最長(zhǎng)肌組織，取樣后迅速裝入2 mL RNase-Free凍存管中，迅速放入液氮，移至實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱儲(chǔ)存。山羊成肌細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室中分離并保存于液氮中，HEK293T細(xì)胞購(gòu)自北京綠源博德公司，保存于液氮中。

1.2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA （0.25%）、FBS均購(gòu)自Gibco公司（美國(guó)）；青霉素-鏈霉素-新霉素 （PSN） 抗生素混合物購(gòu)自賽默飛公司（中國(guó)）；反轉(zhuǎn)錄及定量試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司（日本）；200目、400目細(xì)胞篩購(gòu)自索萊寶公司（中國(guó)）；EdU試劑盒購(gòu)自碧云天公司（中國(guó)）；雙熒光素酶活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自Promega（美國(guó)）；Trizol、Lipofectamine2000均購(gòu)自Invitrogen（美國(guó)）；miRNA定量引物、mimic及mimics NC由廣州銳博生物科技有限公司（中國(guó)）合成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 成肌細(xì)胞分離及培養(yǎng)

從屠宰場(chǎng)收集不同月齡山羊背最長(zhǎng)肌組織，將組織用75%酒精沖洗和消毒后，置于裝有PBS+2%三抗的凍存管中，送至細(xì)胞間。取出組織放到無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用PBS+2%三抗清洗3次，剪去多余結(jié)締組織，再次清洗后晾干。在含EDTA的胰蛋白酶中將組織剪碎，放到冰箱4 ℃過(guò)夜。次日放于37 ℃培養(yǎng)箱消化1 h，加FBS停止消化，用移液槍反復(fù)吹打直至組織塊消失。所得液體先過(guò)400目細(xì)胞篩，濾液再過(guò)200目細(xì)胞篩，得到含有肌細(xì)胞的濾液。1 500 r·min-1離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，加入配置好的細(xì)胞培養(yǎng)基以2×105個(gè)·孔-1的密度鋪到培養(yǎng)皿中，在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中，飽和濕度培養(yǎng)。

1.3.2 總RNA提取及cDNA合成

在組織或細(xì)胞中加入1 mL Trizol裂解液，冰上靜置5～10min。加入1/5體積的氯仿，振蕩混勻后靜置3 min，1 200 0 ×g 4 ℃離心15 min。將所得最上層水相轉(zhuǎn)移到新管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min。再次離心10 min，去上清。所得沉淀中加入75%冰乙醇洗滌，7 500 ×g 4 ℃離心5 min，洗滌兩次。待沉淀徹底干燥后，加入30 μL RNase-Free ddH2O溶解沉淀。用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度與純度。檢測(cè)合格的RNA用于反轉(zhuǎn)錄，總體系為20 μL：1.0 μL PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ+1.0 μL Oligo dT Primer+1.0 μL Random 6 mers+4.0 μL 5×PrimeScript Buffer+1.0 μg RNA原液，用RNase-Free ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反轉(zhuǎn)錄程序：37℃ 15 min，85℃ 5 s。所得cDNA保存在-20℃冰箱中。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)

查詢(xún)NCBI上山羊的BCL2L11、XIAP、FAS、RPL-19基因CDS區(qū)序列，利用Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物序列，序列提交至生工生物工程（上海）股份有限公司合成，miR-665及U6引物由廣州銳博生物科技有限公司（中國(guó)）合成。利用Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物序列（表1）。

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

收集細(xì)胞沉淀，將6孔板中加入適量的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)基補(bǔ)足至2 mL，待次日細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%～90%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。去除原培養(yǎng)基，用PBS清洗一遍，加入1.5 mL提前37 ℃預(yù)熱的OPTI-MEM。將4 μg的DNA用250 μL預(yù)熱的OPTI-MEM稀釋?zhuān)鳛檗D(zhuǎn)染試劑A。將Lipofecta mine 2000試劑用250 μL預(yù)熱的OPTI-MEM稀釋?zhuān)鳛檗D(zhuǎn)染試劑B。將配好的A液加入到等體積的B液中，輕輕攪動(dòng)混勻，室溫靜置25 min。將AB混合液加入到每個(gè)孔中，每孔各加500 μL。輕搖混勻后，將6孔板放入37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，去除轉(zhuǎn)染試劑，更換為原完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h后收集細(xì)胞待后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.3.5 RT-qPCR檢測(cè)

將cDNA通過(guò)TB GreenPremix Ex TaqTMII試劑盒進(jìn)行定量試驗(yàn)?？傮w系為20 μL：10 μL 2×Tap PCR Mix+上游引物和下游引物各0.8 μL+2 μL cDNA模板+6.4 μL ddH2O。RT-qPCR程序如下：預(yù)變性為95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。分別以U6和RPL19作為內(nèi)參，通過(guò)2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3.6 雙熒光素酶報(bào)告測(cè)定

通過(guò)Targetscan發(fā)現(xiàn)BCL2L11的3′UTR 存在miR-665結(jié)合位點(diǎn)。將BCL2L11 3′UTR的野生型（WT）和突變型（MT）片段分別重組到pcDNA3.1載體（Promega，WI，USA）中。miR-665序列插入psi-CHECK2載體中分別合成miR-665 mimics和mimics NC質(zhì)粒。隨后將wt和mt質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到具有陰性對(duì)照和miR-665模擬物的HEK293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，裂解細(xì)胞，用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)（Promega，麥迪遜，威斯康星州，美國(guó)）定量檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果見(jiàn)圖1。

1.3.7 EdU檢測(cè)

將成肌細(xì)胞接種在12孔板中，密度為5×104個(gè)·孔-1，培養(yǎng)24 h，用模擬物轉(zhuǎn)染48 h后向每個(gè)孔中加入10 μmol·L-1的EdU，將細(xì)胞再孵育2 h，用3.7%甲醛固定，然后孵育15 min，并在室溫下用0.5%Triton X-100在PBS中滲透20 min。用PBS洗滌3次，將Click-iT反應(yīng)混合物加入每個(gè)孔中，然后將細(xì)胞孵育30 min，用DAPI室溫避光染色30 min。使用熒光顯微鏡拍照觀(guān)察。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

使用 SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用單因素方差分析評(píng)估兩組之間的差異。數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”來(lái)表示。Plt;0.05表示差異顯著，Plt;0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 武安山羊BCL2L11組織表達(dá)譜分析

使用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)BCL2L11基因在武安山羊9月齡不同組織中的表達(dá)情況，由圖2可知，BCL2L11在武安山羊心、肝、脾、肺、腎、背最長(zhǎng)肌組織中均表達(dá)，其中在背最長(zhǎng)肌組織中表達(dá)量最高。

2.2 miR-665和BCL2L11在武安山羊背最長(zhǎng)肌組織中表達(dá)

通過(guò)對(duì)9月齡和1月齡武安山羊背最長(zhǎng)肌組織中miR-665和BCL2L11基因定量后，如圖3所示，BCL2L11在9月齡武安山羊背最長(zhǎng)肌組織中表達(dá)量顯著高于1月齡（P＜0.05），而miR-665表達(dá)量則是在1月齡中最高（P＜0.01）。結(jié)果顯示，BCL2L11與miR-665表達(dá)負(fù)相關(guān)，預(yù)測(cè)兩者之間存在潛在的靶向關(guān)系，初步推測(cè)BCL2L11是miR-665的靶基因之一，并且與不同月齡山羊肌肉發(fā)育相關(guān)。

2.3 miR-665與BCL2L11靶向關(guān)系驗(yàn)證

為了進(jìn)一步研究miR-665與BCL2L11靶向性關(guān)系，通過(guò)Targetscan網(wǎng)站預(yù)測(cè)了miR-665在BCL2L11的結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)BCL2L11的3′UTR區(qū)存在一個(gè)miR-665的結(jié)合位點(diǎn)，隨后將覆蓋BCL2L11基因3′UTR區(qū)域作為模板設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后構(gòu)建了野生型重組質(zhì)粒pcDNA3.1-BCL2L11-WT和突變型重組質(zhì)粒pcDNA3.1-BCL2L11-MT。試驗(yàn)分為4組，分別是I組（pcDNA3.1-BCL2L11-WT、miR-665 mimic）；II組（pcDNA3.1-BCL2L11-WT、mimic NC）；III組（pcDNA3.1-BCL2L11-MT、miR-665 mimic）；IV組（pcDNA3.1-BCL2L11-MT、mimic NC），共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞。由圖4可知，當(dāng)過(guò)表達(dá)miR-665后，野生型質(zhì)粒的熒光活性顯著降低（P＜0.01），而突變型質(zhì)粒沒(méi)有顯著作用（P＞0.05）。結(jié)果表明miR-665可與BCL2L11 3′UTR區(qū)結(jié)合。

2.4 過(guò)表達(dá)miR-665對(duì)BCL2L11表達(dá)的影響

為了確定miR-665能否作為調(diào)控BCL2L11表達(dá)的調(diào)控元件，通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-665 mimic和mimic NC，培養(yǎng)48h，提取細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后定量檢測(cè)BCL2L11的表達(dá)情況。如圖5所示，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-665后，BCL2L11 mRNA的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），表明miR-665與BCL2L11之間存在靶向性關(guān)系，能夠降低BCL2L11的表達(dá)。

2.5 過(guò)表達(dá)miR-665對(duì)細(xì)胞凋亡因子X(jué)IAP和Fas表達(dá)的影響

為了確定綿羊miR-665是否通過(guò)調(diào)控BCL2L11表達(dá)影響成肌細(xì)胞增殖，使用miR-665 mimic和mimic NC轉(zhuǎn)染到山羊成肌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48h后，提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡標(biāo)志因子X(jué)IAP和Fas的mRNA表達(dá)情況。如圖6所示，轉(zhuǎn)染miR-665 mimics后，XIAP和Fas的mRNA表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。圖7的EdU分析顯示，過(guò)表達(dá)miR-665后顯著促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖。

3 討 論

細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡的一種形式，首先接受來(lái)自?xún)?nèi)部和外部的死亡信號(hào)并作出反應(yīng)，再進(jìn)入死亡程序，如核固縮、細(xì)胞皺縮、細(xì)胞膜起泡和DNA片段化等［17，18］。肌肉作為主要的耗能組織之一，是代謝系統(tǒng)的重要組成部分。在哺乳動(dòng)物中，miRNA已被證明可以調(diào)節(jié)肌肉生物學(xué)的各個(gè)方面，從發(fā)育到損傷修復(fù)，再到肌肉病理等方面［19-21］。有研究者發(fā)現(xiàn)，在人原代成肌細(xì)胞的體外分化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)60個(gè)miRNA差異表達(dá)，其中43個(gè)上調(diào)，17個(gè)下調(diào)［22］。小鼠中發(fā)現(xiàn)，在股四頭肌的miRNA表達(dá)譜中鑒定出353個(gè)miRNA的表達(dá)［23］。這些研究結(jié)果表明miRNA在肌肉發(fā)育過(guò)程中有著重要的作用。最早檢測(cè)肌肉表達(dá)的miRNA的研究之一，確定了3種肌肉特異性miRNA，分別是miR-1、miR-133和miR-206，它們?cè)谌撕褪蠹∧讣?xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮作用［24］。在探究miR-1對(duì)肌管細(xì)胞衰老影響的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-1上調(diào)可以促進(jìn)細(xì)胞衰老，而miR-1下調(diào)則抑制細(xì)胞衰老［25］。另有研究發(fā)現(xiàn)，綿羊過(guò)度肌肉生長(zhǎng)是由于肌肉生長(zhǎng)抑制素的3′UTR結(jié)合了miR-1和miR-206所引起的［26］。有人提出，這些miRNA通過(guò)誘導(dǎo)與慢肌纖維形成相關(guān)的基因表達(dá)和抑制與快速肌纖維形成有關(guān)的基因表達(dá)來(lái)參與肌纖維編程［27］，并與肌肉發(fā)育和肌內(nèi)脂肪沉積有密切相關(guān)［28］。

BCL2L11作為重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑，通過(guò)激活凋亡蛋白（BAX）和抗凋亡蛋白（BCL-2）的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，本研究利用分子生物學(xué)方法探究miR-665靶向調(diào)控BCL2L11對(duì)山羊成肌細(xì)胞增殖的影響。在正常生理下條件，BCL2L11被動(dòng)力蛋白輕鏈1隔離形成微管上的復(fù)合物，BCL2L11釋放磷酸化后刺激凋亡發(fā)生。BCL2L11促進(jìn)許多腫瘤細(xì)胞類(lèi)型的凋亡，通過(guò)miRNA-30c-5p/Bcl2樣蛋白11信號(hào)軸抑制細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［29］。另有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)增加BCL2L11蛋白表達(dá)可以導(dǎo)致肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡［30］。因此本試驗(yàn)旨在研究BCL2L11是否為miR-665靶標(biāo)，對(duì)山羊背最長(zhǎng)肌組織表達(dá)情況產(chǎn)生影響?；谡n題組前期的全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析數(shù)據(jù)，分析篩選到武安山羊背最長(zhǎng)肌組織中的差異表達(dá)基因BCL2L11以及其調(diào)控元件miR-665，通過(guò)RT-qPCR分析BCL2L11在武安山羊不同組織中的表達(dá)情況；又利用RT-qPCR檢測(cè)了不同月齡武安山羊背最長(zhǎng)肌組織中BCL2L11和miRNA-665的表達(dá)；構(gòu)建了BCL2L11 3′UTR野生型和突變型載體，以及miR-665 mimics和對(duì)照組，將其共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞，通過(guò)使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)鑒定了miR-665與BCL2L11存在靶向性關(guān)系。試驗(yàn)收集了山羊成肌細(xì)胞，在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-665 mimic及陰性對(duì)照，利用RT-qPCR檢測(cè)了細(xì)胞凋亡標(biāo)志因子X(jué)IAP和Fas表達(dá)水平，同時(shí)利用EdU試驗(yàn)分析miR-665過(guò)表達(dá)對(duì)山羊成肌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，miR-665和 BCL2L11在9月齡和1月齡山羊背最長(zhǎng)肌組織中相對(duì)表達(dá)量存在差異，BCL2L11在9月齡背最長(zhǎng)肌組織中表達(dá)量顯著高于1月齡，而miR-665在1月齡的表達(dá)量極顯著高于9月齡，兩者存在負(fù)調(diào)控現(xiàn)象。楊麗麗等［31］的研究結(jié)果表明，隆林山羊背最長(zhǎng)肌在1月齡和10月齡時(shí)存在差異表達(dá)的環(huán)狀RNA，這些環(huán)狀RNA可能參與肌肉發(fā)育的調(diào)節(jié)，這與本試驗(yàn)結(jié)果miR-665在9月齡極顯著增高較一致。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告分析顯示，當(dāng)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)miR-665 mimic后，顯著抑制了BCL2L11熒光素酶的活性，同時(shí)靶基因BCL2L11 的mRNA表達(dá)水平也明顯降低。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-665的功能，轉(zhuǎn)染miR-665 mimic后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡標(biāo)志基因XIAP與Fas的表達(dá)量也顯著降低；EdU試驗(yàn)分析顯示，過(guò)表達(dá)miR-665后成肌細(xì)胞的增殖明顯增多。

總之，本研究確定了miR-665作為BCL2L11的調(diào)控元件，可以抑制靶基因BCL2L11所引起的成肌細(xì)胞凋亡。在山羊背最長(zhǎng)肌組織中miR-665作為BCL2L11的調(diào)控元件，能夠顯著抑制山羊成肌細(xì)胞中BCL2L11的表達(dá)水平，當(dāng)miR-665過(guò)表達(dá)后，能夠促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖。

4 結(jié) 論

研究發(fā)現(xiàn)，miR-665靶向調(diào)控BCL2L11表達(dá)對(duì)山羊成肌細(xì)胞增殖有顯著促進(jìn)作用。當(dāng)過(guò)表達(dá)miR-665能夠顯著抑制BCL2L11表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的凋亡，為探究BCL2L11在山羊成肌細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

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（編輯 郭云雁）