CRISPR/Cas9系統(tǒng)在家畜生殖細(xì)胞中的研究進(jìn)展

摘 要：

生殖細(xì)胞是生命體遺傳物質(zhì)傳遞的主要載體，在家畜育種過程中發(fā)揮重要作用。人們對畜產(chǎn)品需求的不斷增加促進(jìn)了精確育種技術(shù)的發(fā)展。基因編輯技術(shù)顯著提升基因強(qiáng)化和疾病治療成效，這一進(jìn)展凸顯了將該技術(shù)應(yīng)用于家畜生殖細(xì)胞研究的重要性。與其他基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)和CRISPR/Cas12 系統(tǒng)的研究較為深入。CRISPR/Cas技術(shù)已在多項研究中取得突破性進(jìn)展，被視為一種極有潛力的育種改良手段。本文主要針對兩種CRISPR/Cas系統(tǒng)及CRISPR/Cas9系統(tǒng)在家畜生殖細(xì)胞中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，對家畜生殖細(xì)胞形成過程進(jìn)行簡要概括，闡述CRISPR/Cas9 系統(tǒng)和CRISPR/Cas12 系統(tǒng)的原理、構(gòu)成和衍生技術(shù)，介紹CRISPR/Cas9系統(tǒng)在家畜生殖細(xì)胞中的應(yīng)用，對基因編輯技術(shù)廣泛應(yīng)用于家畜生殖細(xì)胞進(jìn)行展望，旨在為未來畜牧基因編輯領(lǐng)域的研究提供參考。

關(guān)鍵詞：

基因編輯技術(shù)；CRISPR/Cas9系統(tǒng)；CRISPR/Cas12系統(tǒng)；家畜生殖細(xì)胞

中圖分類號：

S814 """"文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0479-13

收稿日期：2024-08-16

基金項目：寧夏大學(xué)博士科研啟動經(jīng)費（030700002306）；寧夏回族自治區(qū)重點研發(fā)計劃（2023BCF01006）

作者簡介：解雅茹（2001-），女，山西運城人，碩士生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：xieyaru0724@163.com

*通信作者：張令鍇，主要從事精子發(fā)生表觀調(diào)控研究，E-mail：zhanglklab2023@163.com

Research Progress of CRISPR/Cas9 System in Livestock Germ Cells

XIE" Yaru， JIN" Haoyan， KONG" Chen， CAI" Bei， ZHANG" Lingkai*

（Key Laboratory of Ruminant Molecular and Cellular Breeding of Ningxia Hui Automous Region， College of Animal Science and Technology， Ningxia University， Yinchuan 750021，" China）

Abstract：

Germ cells are crucial for transmitting genetic material in living organisms and are vital for livestock breeding. The increasing demand for livestock products promoted the development of precision breeding techniques. Recent advancements in gene-editing have significantly improved the effect of genetic enhancement and disease treatment， highlighting the importance of integrating this technology into livestock germ cell research. The research on CRISPR/Cas9 and CRISPR/Cas12 has gained significant prominence compared to other gene-editing technologies. CRISPR/Cas has led to breakthroughs in various applications， and these systems are increasingly recognized as potential methods for species improvement. In this review， two types of CRISPR/Cas systems and CRISPR/Cas9 applications in livestock germ cells were analyzed. A concise overview of the developmental processes of germ cells in livestock was provided， elucidating the principles， composition， and derivative techniques associated with CRISPR/Cas9 and CRISPR/Cas12， and the implementation of CRISPR/Cas9 systems in livestock germ cells was discussed. Furthermore， the current review anticipate the extensive application of gene-editing techniques in this domain， aiming to offer a valuable reference for future research in the field of gene editing in livestock.

Key words：

gene-editing technology; CRISPR/Cas9 system; CRISPR/Cas12 system; livestock germ cells

*Corresponding author： ZHANG Lingkai， E-mail：zhanglklab2023@163.com

近年來社會經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展，人們對于畜產(chǎn)品的需求也持續(xù)增長，為滿足社會需要，提高畜牧行業(yè)產(chǎn)量是關(guān)鍵所在。而提高行業(yè)產(chǎn)量歸根結(jié)底是要確保育種精確度，高精度育種既可以有效生產(chǎn)出符合市場需求的家畜品種，又可以降低生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)且足量的畜產(chǎn)品成本，從而帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益。但是開發(fā)新型育種技術(shù)提高育種精確度是畜牧業(yè)中亟待解決的難題。為解決這一難題，研究人員將目光投向了基因編輯技術(shù)，并將其引入育種領(lǐng)域研究。多項研究表明，這一技術(shù)的引入無疑是正確的選擇?；蚓庉嫾夹g(shù)不僅提高了家畜生長速度和生產(chǎn)效率，還優(yōu)化了肉類的瘦肉比例［1-2］，進(jìn)一步滿足市場需求；還可以提高家畜抗病能力［3］，成功將該技術(shù)引入豬流感、偽狂犬病等疾病防控應(yīng)用中［4］。基因編輯技術(shù)甚至可以通過編輯特定生長基因，有效縮短育種周期，使畜牧業(yè)更靈活地適應(yīng)市場和環(huán)境的變化［5］。更值得注意的是，通過該技術(shù)還能減少家畜溫室氣體的排放，改善生態(tài)環(huán)境［6］，維持生態(tài)可持續(xù)發(fā)展。

家畜生殖細(xì)胞作為育種過程中重要的細(xì)胞類型一直是研究熱點?；蚓庉嫾夹g(shù)的引入為生殖細(xì)胞研究提供了新的視角和思路，具有重要意義。通過基因編輯技術(shù)研究生殖細(xì)胞中特定基因的功能、表達(dá)機(jī)制及其在性器官發(fā)育、性激素分泌中的作用［7］，方便研究人員更快捷地了解家畜生殖細(xì)胞的特性，從而加快提高育種精確度的速度。除此之外，基因編輯技術(shù)還可以控制家畜的性別［8］、提高后代抗病力［9］、生成家畜模型［10］等。除了家畜育種領(lǐng)域外，該技術(shù)還廣泛應(yīng)用于農(nóng)學(xué)、醫(yī)學(xué)等其他領(lǐng)域。由于該技術(shù)使家畜朝著對社會有利的方向發(fā)展，且極具應(yīng)用潛力，研究人員投入了大量財力和精力進(jìn)行深入研究。

近年來，基因編輯技術(shù)迅速發(fā)展。目前，已開發(fā)出三代基因編輯技術(shù)：鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）技術(shù)和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列-相關(guān)核酸酶（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR/Cas）技術(shù)。三代編輯技術(shù)在基因編輯效率上逐步提升，而CRISPR/Cas系統(tǒng)因其操作簡單、毒性小、周期短等優(yōu)點，成為目前應(yīng)用最廣泛的基因編輯技術(shù)。

雖然CRISPR/Cas系統(tǒng)在不斷地發(fā)展完善，但是該技術(shù)中用于切割DNA的核心成分——核酸酶專利卻一直被美國等國家壟斷，這意味著未來我國基因編輯技術(shù)發(fā)展必定具有局限性。為打破這一局面，賴錦盛教授及其團(tuán)隊［11］開發(fā)出擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因編輯底盤核酸酶Cas12i和Cas12j。兩種核酸酶分別屬于ClassⅡ類中的Ⅴ型和Ⅵ型。Cas12i具有較小的蛋白結(jié)構(gòu)，在編輯方面表現(xiàn)出較高的雙鏈切割效率和特異性，適用于多基因編輯和定點修改，尤其在基因組精確編輯和優(yōu)化方面表現(xiàn)出應(yīng)用價值［12］；Cas12j具有小型化的特點，對特定DNA序列的識別能力和切割能力較強(qiáng)，適用于基因編輯和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，尤其是復(fù)雜基因組中的靶向編輯［13］。研究人員在豬等農(nóng)業(yè)生物中驗證了Cas12i和Cas12j兩種核酸酶的編輯活性，雖然相比Cas9和Cas12a略低，但是完全滿足了基因編輯技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的基本需求。這一成果不僅打破了少數(shù)國家的專利壟斷，更為我國基因編輯技術(shù)發(fā)展提供了有力保障。此外，還開發(fā)出TnpB蛋白［14］等國內(nèi)自主產(chǎn)權(quán)“剪刀”。這不僅標(biāo)志著中國在基因編輯技術(shù)領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展，還意味著國內(nèi)CRISPR/Cas系統(tǒng)將應(yīng)用于更多領(lǐng)域。目前，對基因編輯技術(shù)及其衍生技術(shù)作用原理和應(yīng)用前景的深入探究，將為家畜育種領(lǐng)域帶來巨大的技術(shù)便利。

1 家畜生殖細(xì)胞簡介

生殖細(xì)胞（germ cell）是多細(xì)胞生物體內(nèi)攜帶遺傳物質(zhì)且用于繁殖后代的細(xì)胞的總稱，主要包括精子和卵子。

1.1 精子形成過程

精子由雄性家畜睪丸中的精細(xì)管產(chǎn)生，精子成熟是精子形成過程中的關(guān)鍵步驟。人們將成熟精子形成過程稱為精子發(fā)生。精子發(fā)生主要分為3個階段：精原細(xì)胞（spermatogonia stem cell，SSCs）增殖階段、精母細(xì)胞減數(shù)分裂階段和精細(xì)胞變形。第一階段產(chǎn)生分化和未分化的SSCs，其中分化的SSCs進(jìn)入下一階段，而未分化的SSCs用于更新未分化SSCs庫和產(chǎn)生分化的SSCs。第二階段，分化SSCs經(jīng)過兩次減數(shù)分裂，最終形成染色體數(shù)目減半的精細(xì)胞［15］。根據(jù)減數(shù)分裂Ⅰ期的染色體動態(tài)變化，可將減數(shù)分裂分為：細(xì)線期、偶線期、粗線期、雙線期和終變期［16］。由于在終變期形成的精細(xì)胞屬于未成熟的圓形精細(xì)胞，因此在第三階段需要經(jīng)過一系列形態(tài)變化成為成熟精子。在山羊育種領(lǐng)域，最新研究發(fā)現(xiàn)，BLOC1S1過表達(dá)顯著促進(jìn)山羊SSCs增殖，且通過同源重組等步驟成功構(gòu)建山羊精原干細(xì)胞BLOC1S1過表達(dá)細(xì)胞系，過表達(dá)效率提高了18倍。這一發(fā)現(xiàn)為提高山羊精原干細(xì)胞增殖能力提供了寶貴的實踐指導(dǎo)和理論依據(jù)［17］。此外研究人員還發(fā)現(xiàn)，UCHL1在SSCs自我更新、增殖和精子發(fā)生過程中同樣發(fā)揮重要作用，并指出了在SSCs炎癥反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用［18］，該研究成果拓寬了人們對山羊精子發(fā)生機(jī)制的認(rèn)知邊界，還為后續(xù)深入研究提供了重要線索。

1.2 卵子形成過程

卵子由雌性家畜卵巢產(chǎn)生，在生殖過程中同樣起著重要作用。卵子形成過程與精子形成過程前期較為相似，但是后期根據(jù)卵泡的形態(tài)、大小、增長速度和組織學(xué)特征，可將生長過程分為：始基卵泡、竇前卵泡、竇卵泡和排卵前卵泡。未成熟的卵原細(xì)胞經(jīng)過數(shù)次有絲分裂后迅速增殖，一段時間后生長為卵母細(xì)胞，之后經(jīng)過一次減數(shù)分裂獲得初級卵母細(xì)胞。初級卵母細(xì)胞被單層前顆粒細(xì)胞圍繞形成始基卵泡，經(jīng)過生長成為排卵前卵泡。最終排出，成為卵子。整個過程由多種基因進(jìn)行調(diào)控完成，Dkk2便在其中發(fā)揮重要作用。通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得Dkk2敲除小鼠，結(jié)果表明，基因敲除小鼠原始卵泡明顯減少，卵泡閉鎖明顯升高；同時抑制該基因表達(dá)，會促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖［19］。Dkk2的保守性也保證了該基因用于探究母豬等雌性哺乳動物繁殖機(jī)理的有效性和適用性。近些年，促進(jìn)卵母細(xì)胞體外成熟是該領(lǐng)域的研究熱點。有試驗發(fā)現(xiàn)，在成熟培養(yǎng)液中添加5 μmol·L-1脂質(zhì)代謝關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子PPARγ激活劑羅格列酮可以提高卵母細(xì)胞成熟速率，并可以減少氧化應(yīng)激［20］。此外，還發(fā)現(xiàn)100 ng·μL-1 CSTB蛋白、50 nmol·L-1 NPY均可有效提高綿羊小卵泡卵母細(xì)胞的體外成熟率、卵裂率和囊胚率［21］。

2 CRISPR/Cas系統(tǒng)概述

1987年研究人員從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)一段特殊的序列［22］，雖是第一次發(fā)現(xiàn)該段序列，但當(dāng)時并未引起廣泛關(guān)注。直至2002年首次將這段特殊重復(fù)序列命名為成簇規(guī)律性間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）［23］，在此之后，大量學(xué)者對CRISPR序列進(jìn)行探索，并從多角度全方位研究。隨著研究逐漸深入，研究人員發(fā)現(xiàn)CRISPR序列附近存在的CRISPR相關(guān)基因（CRISPR-associated genes，Cas），可以與CRISPR序列構(gòu)成為噬菌體提供適應(yīng)性免疫的CRISPR/Cas系統(tǒng)［24］。這次發(fā)現(xiàn)為CRISPR/Cas系統(tǒng)未來廣泛應(yīng)用于基因編輯領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。直至今日，已發(fā)現(xiàn)多種Cas蛋白。研究人員根據(jù)其結(jié)構(gòu)分為Class Ⅰ和Class Ⅱ兩大類，見表1［25］。與Class Ⅰ類相比，Class Ⅱ類構(gòu)成更加簡單，所以對Class Ⅱ類的研究更完善。目前研究較多的CRISPR/Cas9系統(tǒng)和CRISPR/Cas12系統(tǒng)均屬于Class Ⅱ類。

2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)

2.1.1 基本構(gòu)成和原理

CRISPR/Cas9系統(tǒng)屬于Class Ⅱ類中的Ⅱ-B型，是由單一向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA）和Cas9蛋白構(gòu)成。其中sgRNA是由CRISPR RNA（crRNA）和反式激活CRISPR RNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）組成［26］，在系統(tǒng)中起引導(dǎo)Cas9蛋白作用；Cas9蛋白是一種利用HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域和Ruv-C核酸酶結(jié)構(gòu)域在系統(tǒng)中實現(xiàn)靶基因切割。CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)揮編輯作用時，通常包含3個階段：識別、剪切和修復(fù)。當(dāng)噬菌體第一次入侵機(jī)體時，噬菌體DNA上的導(dǎo)向識別臨近基序（protospacer adjacent motif，PAM）被CRISPR/Cas9系統(tǒng)識別，并在Cas9蛋白的作用下，截取一段DNA序列作為新的序列插入CRISPR序列中［27］。當(dāng)噬菌體再次入侵時，含有噬菌體DNA片段的CRISPR位點就會轉(zhuǎn)錄成crRNA，與tracrRNA結(jié)合形成sgRNA，并在RNaseⅢ的作用下和Cas9蛋白形成核糖核蛋白復(fù)合物（ribonucleoprotein，RNP）［28］。該復(fù)合體結(jié)合到含有PAM序列的外源DNA上，對該DNA雙鏈進(jìn)行切割，進(jìn)一步阻止噬菌體在生物體中復(fù)制，從而發(fā)揮免疫防御作用。Cas9蛋白切割出現(xiàn)雙鏈斷裂（double strand break，DSB）后，啟動非同源末端連接機(jī)制和同源介導(dǎo)修復(fù)（homology-directed repair，HDR）機(jī)制進(jìn)行DNA鏈修復(fù)。此外，研究發(fā)現(xiàn)，crRNA的成熟是激活CRISPR的關(guān)鍵［28-29］，而tracrRNA對crRNA的成熟具有指導(dǎo)作用。

2.1.2 基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的衍生技術(shù)

雖然CRISPR/Cas9系統(tǒng)比ZFNs和TALENs的操作更簡便，但是Cas蛋白存在的細(xì)胞毒性、突變以及修復(fù)能力等問題影響基因的精確編輯。因此，研究人員在傳統(tǒng)的CRISPR/Cas系統(tǒng)上進(jìn)行改造，構(gòu)建了基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的堿基編輯技術(shù)和先導(dǎo)編輯技術(shù)。

單堿基編輯技術(shù)是通過精確改變單個堿基實現(xiàn)關(guān)鍵氨基酸結(jié)構(gòu)和功能改變的技術(shù)。目前，開發(fā)的單堿基編輯技術(shù)有胞嘧啶堿基編輯系統(tǒng)（cytosine base editor，CBE）、腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)（adenine base editor，ABE）和糖基化酶堿基編輯系統(tǒng)（glycosylase base editor，GBE）。CBE系統(tǒng)是由Cas9的核酸酶死亡突變體（dead Cas9，dCas9）蛋白開發(fā)，經(jīng)過胞嘧啶脫氨酶轉(zhuǎn)換、DNA復(fù)制等過程，成功將胞嘧啶（cytosine，C）轉(zhuǎn)換為胸腺嘧啶（thymine，T），該過程發(fā)生堿基替換時，無需產(chǎn)生DSB［30］?；诖耍芯咳藛T借助人APOBEC3A（A3A）脫氨酶開發(fā)出高度準(zhǔn)確的A3A-CBE變體，有效產(chǎn)生C-to-T轉(zhuǎn)換，該變體在人類基因組疾病治療方面表現(xiàn)出巨大潛力［31］。研究人員通過CBE系統(tǒng)，將慢性乙型肝炎病毒的復(fù)制消除并對病毒蛋白表達(dá)進(jìn)行沉默［32］，成功提高了乙型肝炎的治愈率。ABE系統(tǒng)與CBE系統(tǒng)編輯過程類似。在腺嘌呤脫氨酶的作用下將腺嘌呤（adenine，A）轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤（inosine，I），I被聚合酶識別為鳥嘌呤（guanin，G），最終成功實現(xiàn)A-to-G的轉(zhuǎn)換［33］。研究人員在灘羊上進(jìn)行多版本ABE試驗，其中，從大腸桿菌中篩選出的脫氧腺苷脫氨酶TADA經(jīng)過改造后，與Cas9蛋白、T7啟動子和Bbs Ⅰ酶切位點結(jié)合構(gòu)成的ABEmax表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢，對目標(biāo)位點的編輯效率高達(dá)48.5%，而且打靶精度較高且未出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象［34］，該研究也首次證明ABE系統(tǒng)在綿羊育種中的安全性和可行性。GBE系統(tǒng)則是一種誘導(dǎo)嘧啶與堿基之間顛換的技術(shù)［35］。該技術(shù)改善了依賴多次DNA復(fù)制的缺點，將目標(biāo)堿基直接特異性修改為目的基因，進(jìn)一步完善了堿基編輯系統(tǒng)。在此基礎(chǔ)上，北京大學(xué)伊成器團(tuán)隊的Chen等［36］通過在TadA-8e腺嘌呤脫氨酶中引入N46L突變，得到一種專一且高效的胞嘧啶脫氨酶，并借助此酶開發(fā)出新型堿基編輯系統(tǒng)Td-CBEs和Td-CGBE。由于單堿基編輯技術(shù)的編輯頻率較低，無法將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于多領(lǐng)域研究，為擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，開發(fā)出一種可以同時產(chǎn)生兩種不同堿基突變的新型編輯技術(shù)——雙堿基編輯技術(shù)，例如，Aamp;C-BEmax［37］、Target-ACE/Target-ACEmax/ACBEmax［38］等編輯系統(tǒng)。

為進(jìn)一步擴(kuò)大編輯范圍，開發(fā)出無需依賴DSB和供體DNA便可以精確執(zhí)行十二個堿基置換的先導(dǎo)編輯技術(shù)（prime editing，PE）［39］，這種技術(shù)可以有效產(chǎn)生堿基置換、插入和缺失。使用PE技術(shù)成功突變綿羊BMPR1B FecBB p.Q249R位點和TBXT c.G334T位點，并獲得KCNJ5 p.G151R點突變基因編輯豬。其中，TBXT c.G334T位點的突變頻率高達(dá)14.7%，KCNJ5 p.G151R位點的編輯效率高達(dá)5.2%［40］。與CRISPR/Cas9系統(tǒng)相比，PE技術(shù)雖然具有更低的脫靶效應(yīng)、更高的安全性和更強(qiáng)的靈活性［41］，但是編輯效率仍處于較低水平。為提高編輯效率，研究人員利用HOXB13-5′ UTR RNA基因和整合的twinPE質(zhì)粒分別對PE系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，通過將attB序列插入山羊基因組特定位點中分析其效率。結(jié)果表明，兩種經(jīng)過優(yōu)化的PE系統(tǒng)的編輯效率分別提高了3.58倍和2.19倍［42］，同時也證明了在山羊育種領(lǐng)域PE技術(shù)的可行性。

2.2 CRISPR/Cas12系統(tǒng)

2.2.1 基本原理和構(gòu)成

CRISPR/Cas12系統(tǒng)屬于Class Ⅱ類的Ⅴ型。目前，對Cas12a（Cpf1）、Cas12b（C2c1）和Cas12f（Cas14a1）3種亞型的研究較多。

Cas12a系統(tǒng)是一種由單個crRNA介導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)。首先，CRISPR序列轉(zhuǎn)錄生成pre-crRNA，Cas12a蛋白在核糖核酸酶催化位點加工pre-crRNA，獲得成熟crRNA之后，與Cas12a相互作用形成單核酸酶效應(yīng)復(fù)合物［43］。在該復(fù)合物中，crRNA引導(dǎo)Cas12a精準(zhǔn)定位切割位點，并與目標(biāo)DNA序列形成互補(bǔ)配對。Cas12a中包含的Ruv-C核酸酶結(jié)構(gòu)域、PI核酸酶結(jié)構(gòu)域和WED核酸酶結(jié)構(gòu)域?qū)NA進(jìn)行切割。其中，Ruv-C核酸酶結(jié)構(gòu)域用于準(zhǔn)確識別目標(biāo)序列。由編輯條件可以看出，CRISPR/Cas12a系統(tǒng)與CRISPR/Cas9系統(tǒng)在crRNA加工、PAM序列識別等方面存在明顯差異。在編輯初始階段，CRISPR/Cas12a系統(tǒng)僅用crRNA進(jìn)行識別［44］；PAM序列識別時，Cas12a識別富含A-T的序列。雖然CRISPR/Cas12a系統(tǒng)具有一定的脫靶效應(yīng)，但是可有效、準(zhǔn)確地對基因進(jìn)行編輯。

Cas12b系統(tǒng)是一種由雙RNA引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)，發(fā)揮編輯作用時與CRISPR/Cas9系統(tǒng)相似。Cas12b系統(tǒng)能特異性識別較簡單的PAM序列——5′-TTN-3′，并剪切雙鏈DNA（duble stranded DNA，dsDNA），在PAM序列遠(yuǎn)端形成交錯末端。同時也可以不依賴PAM序列對單鏈DNA（single stranded DNA，ssDNA）進(jìn)行剪切。由于Cas12b的體積小于SpCas9和Cas12a，所以更適合通過腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的體內(nèi)遞送進(jìn)行基因治療。并且因其較小的脫靶效率，Cas12b成為臨床應(yīng)用和治療中更安全的選擇［45］。

Cas12f系統(tǒng)也是一種依賴雙RNA介導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)，是目前已知最小的CRISPR/Cas系統(tǒng)，以依賴PAM序列的方式剪切dsDNA生成黏性末端。dsDNA或ssDNA靶標(biāo)均能激活Cas12f的反式剪切活性。由于Cas12f蛋白相對較小，更適合在一些對轉(zhuǎn)染或內(nèi)環(huán)境要求較高的細(xì)胞中應(yīng)用，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中也表現(xiàn)出獨特優(yōu)勢。目前，借助Cas12f系統(tǒng)已經(jīng)創(chuàng)建出一個高效的微型Cas系統(tǒng)（CasMINI），這種微型系統(tǒng)可以驅(qū)動高水平的基因激活，且激活活性與Cas12a相當(dāng)［46］。

2.2.2 基于CRISPR/Cas12系統(tǒng)的衍生技術(shù)

目前基于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)，已經(jīng)開發(fā)出兩種新型轉(zhuǎn)錄調(diào)控技術(shù)：CRISPR轉(zhuǎn)錄干擾（CRISPR interference，CRISPRi）和CRISPR轉(zhuǎn)錄激活（CRISPR activation，CRISPRa）。其中，CRISPRi是通過dCas9維持sgRNA定向特定DNA序列結(jié)合，從而阻斷細(xì)菌中一些基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抑制作用。而CRISPRa則是通過轉(zhuǎn)錄激活因子與dCas9結(jié)合形成復(fù)合體，sgRNA引導(dǎo)該復(fù)合體至目標(biāo)基因啟動子區(qū)域激活該基因的轉(zhuǎn)錄活性［47］?；蚪M轉(zhuǎn)錄表達(dá)是研究基因功能的關(guān)鍵，將這兩種新型轉(zhuǎn)錄調(diào)控技術(shù)應(yīng)用于基因組調(diào)控可以有效提高轉(zhuǎn)錄精確度。先前通過研究已經(jīng)在病原體化膿性鏈球菌（group A streptococcus，GAS）中發(fā)現(xiàn)多種必要基因，但是缺乏對其功能的研究。因此科研人員將CRISPRi系統(tǒng)引入血清型M1T1 GAS菌株中，發(fā)現(xiàn)其能對細(xì)菌基因表達(dá)有效抑制，除此之外，還發(fā)現(xiàn)GAS的毒力與保守細(xì)胞分裂基因ftsZ的表達(dá)密切相關(guān)［48］。研究人員又通過將高活性脫氨酶與Lachnospiraceae細(xì)菌Cas12a（LbCas12a）結(jié)合，開發(fā)出以LbCas12a介導(dǎo)的CBE系統(tǒng)和ABE系統(tǒng)［49］。這兩種堿基編輯系統(tǒng)具有更高的編輯效率和更廣的靶向范圍，可以作為重點突變的多功能工具。而且，利用體細(xì)胞和胚胎開發(fā)出的CBE系統(tǒng)和ABE系統(tǒng)可以進(jìn)行多重堿基編輯，極大提高了編輯效率。

迄今為止大部分PE系統(tǒng)的開發(fā)依賴于Cas9蛋白，但是由于Cas9蛋白的尺寸較大、脫靶效率較高和編輯范圍具有局限性等缺點，限制了PE系統(tǒng)應(yīng)用于更多領(lǐng)域。為提高PE系統(tǒng)的編輯精度、減少區(qū)域限制和降低脫靶效率，研究人員致力于找到合適的蛋白開發(fā)出更高效的PE系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，Cas12a蛋白及其crRNA的分子量更小，脫靶效應(yīng)更低，編輯范圍更廣泛［50］，故將Cas12a蛋白用于開發(fā)新型PE系統(tǒng)。但是傳統(tǒng)的pegRNA并不適用于基于Cas12a開發(fā)的PE系統(tǒng)，因此研究人員對傳統(tǒng)pegRNA進(jìn)行改造，最終開發(fā)出適用于不同場景的基于環(huán)狀RNA的先導(dǎo)編輯系統(tǒng)（circular RNA-mediated prime editors，CPEs）［51］。

除此之外，研究人員對Cas12i核酸酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)設(shè)計和蛋白質(zhì)工程優(yōu)化，開發(fā)出Cas12iMAX變體，為驗證該變體在在大型家畜中基因編輯的可行性，研究人員通過Cas12iMAX一步敲除了豬成纖維細(xì)胞中IGF2、ANPEP等基因，未發(fā)現(xiàn)脫靶現(xiàn)象，在牛上同樣使用該技術(shù)進(jìn)行基因編輯，得到相同結(jié)果［52］，這一研究結(jié)果為Cas12iMAX系統(tǒng)應(yīng)用于家畜改良領(lǐng)域提供依據(jù)。通過研究，還開發(fā)出一種CRISPR相關(guān)轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)（CRISPR-associated transposase，CAST）。該系統(tǒng)利用Cas12k在基因組上識別并結(jié)合在特定的序列位點上，借助轉(zhuǎn)座酶將目的序列直接插入靶位點。由于Cas12k不具有核酸內(nèi)切酶活性，因此CAST系統(tǒng)不會破壞DNA鏈，所以不涉及同源重組，且具有更高的編輯效率，DNA片段插入成率高達(dá)80%，具有極大的編輯潛力［53］。

2.3 其他CRISPR/Cas系統(tǒng)技術(shù)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)和CRISPR/Cas12系統(tǒng)編輯的主要對象均為DNA，而對于RNA的編輯，CRISPR/Cas13系統(tǒng)顯示出巨大潛力。通過研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物體內(nèi)靶向RNA過程中Cas13表現(xiàn)出較高的效率和特異性，且可以本質(zhì)性地靶向以前從未識別的宿主RNA［54-55］。其中，Cas13d是Cas13系統(tǒng)中最活躍的亞型，但在哺乳動物細(xì)胞的胞質(zhì)中活性不高，而大多數(shù)RNA病毒僅在胞質(zhì)中復(fù)制，這極大程度限制了病毒治療的效率。為解決這一問題，研究人員設(shè)計開發(fā)出一種核質(zhì)轉(zhuǎn)運Cas13d（Cas13d-NCS）系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用Cas13d蛋白的核定位特性以及核定位序列和核輸出序列的調(diào)控作用，將核內(nèi)的crRNA轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)，實現(xiàn)胞質(zhì)RNA高效靶向，提高了主要位于胞質(zhì)的mRNA的靶向效率。使用Cas13d-NCS系統(tǒng)對報告基因進(jìn)行編輯，表達(dá)量降低了99.3%［56］。該研究成果為開發(fā)針對特定RNA分子的精確分子工具和治療方案提供了新的可能。

由于ClassⅡ類結(jié)構(gòu)較簡單研究較方便，CRISPR/Cas9系統(tǒng)和CRISPR/Cas12系統(tǒng)在基因編輯方面的研究日趨成熟，且廣泛應(yīng)用于基因改良、疾病治療等多個領(lǐng)域，已在相應(yīng)領(lǐng)域取得顯著成就。但這并不代表結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的ClassⅠ類CRISPR/Cas系統(tǒng)不能成為高效的基因編輯工具。所有ClassⅠ類系統(tǒng)均使用CRISPR相關(guān)抗病毒復(fù)合物（CRISPR associated complex for antiviral defense，Cascade）負(fù)責(zé)處理pre-crRNA、結(jié)合crRNA和識別靶位點等［57］?；诖?，開發(fā)出CRISPR/Cas3系統(tǒng)，表現(xiàn)出有效的基因編輯效率。CRISPR/Cas3系統(tǒng)通過多亞基復(fù)合物Cascade-crRNA結(jié)合靶序列，之后借助具有DNA解旋酶活性和切口酶活性的Cas3酶，在PAM近端將靶DNA切碎并降解［58］。其中，CRISPR/Cas3系統(tǒng)可憑借一種單向誘導(dǎo)方式對crRNA靶位點進(jìn)行長范圍切割。

3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在家畜生殖細(xì)胞中的應(yīng)用

隨著基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)及后續(xù)不斷演進(jìn)更新，該技術(shù)日益成熟，為家畜育種、植物育種等領(lǐng)域基因研究提供強(qiáng)了有力的技術(shù)支撐，并取得突破性進(jìn)展。近年來對基因編輯研究逐漸深化，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在家畜生殖細(xì)胞方面的研究取得令人矚目的進(jìn)展，相對而言，CRISPR/Cas12系統(tǒng)尚不成熟，因此未能廣泛應(yīng)用于實際研究中。

3.1 生殖細(xì)胞發(fā)育及增殖方面的應(yīng)用

精子發(fā)生是雄性家畜生殖細(xì)胞正常生長、成熟的保障。而在精子發(fā)生過程中，不同階段需要不同基因相互調(diào)控，若超過一定范圍就會導(dǎo)致精子發(fā)生進(jìn)程受到影響，從而導(dǎo)致生殖細(xì)胞正常生長出現(xiàn)異常，最終影響家畜育種效果［59］。因此對基因功能的研究至關(guān)重要。在雄性家畜生殖細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)研究的過程中發(fā)現(xiàn)，BMP4、DAZL、NANOS3和SYCP2可促進(jìn)羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，且在睪丸發(fā)育過程中存在差異；借助CRISPR/dCas9系統(tǒng)有效激活4種基因表達(dá)，并成功構(gòu)建出一個多基因轉(zhuǎn)錄激活載體［60］。這是首次利用CRISPR/dCas9技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)誘導(dǎo)系統(tǒng)。之后研究發(fā)現(xiàn)，VASA可以通過調(diào)控雄性綿羊生殖細(xì)胞減數(shù)分裂過程從而影響生精細(xì)胞分化［61］。研究人員利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建VASA基因敲入載體，再利用CRISPR/dCas9系統(tǒng)激活經(jīng)轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞，使VASA基因成功表達(dá)，最終結(jié)果表明，該基因主要在精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞中表達(dá)，且在綿羊精子發(fā)生過程中發(fā)揮潛在功能。除此之外，Gata4同樣影響睪丸發(fā)育和精子形成［62］，研究人員通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)將雄性小鼠體內(nèi)的Gata4敲除，對比發(fā)現(xiàn)，敲除Gata4的雄性小鼠睪丸發(fā)育遲緩，精原細(xì)胞和精子生成減少，雄激素水平低下。Gata4基因也因具有保守性，而為探索豬等家畜基因功能提供了技術(shù)指導(dǎo)，并為提高育種精確度提供理論依據(jù)。

卵巢卵泡正常發(fā)育是雌性家畜產(chǎn)生卵子的基礎(chǔ)。FecB基因作為綿羊產(chǎn)羔性狀候選主效基因，突變會促進(jìn)卵泡發(fā)育和排卵。借助ABEmax系統(tǒng)對灘羊進(jìn)行基因編輯，成功獲得FecB突變?yōu)┭?，且編輯效率高達(dá)53.85%，結(jié)果顯示，灘羊FecB基因突變后卵泡顆粒細(xì)胞分化和卵泡發(fā)育均受阻，排卵數(shù)減少［63］，導(dǎo)致灘羊育種無法正常進(jìn)行，降低了育種效率?？捎纱藶榍腥朦c進(jìn)行探究，開發(fā)出適合灘羊的育種新技術(shù)。

CRISPR/Cas9技術(shù)通過將基因敲除達(dá)到編輯的效果，獲得基因敲除家畜，但是敲除后產(chǎn)生的基因型變化是否可以遺傳給下一代，這個問題仍待考究。在此背景下，研究人員以牛為實驗動物，分別收集MSTN牛卵細(xì)胞和精液進(jìn)行體外受精，并對胚胎進(jìn)行分析。為了深化對基因編輯效果的理解，還利用電穿孔技術(shù)對胚胎進(jìn)行額外基因編輯，之后將胚胎移植至代孕牛中，成功生產(chǎn)出健康的子一代。分析結(jié)果表明，子一代牛中存在雜合突變，但健康狀況良好且胚胎可以進(jìn)行額外突變［64］。這一研究不僅為CRISPR/Cas9技術(shù)在牛育種領(lǐng)域應(yīng)用奠定了實踐基礎(chǔ)，也為未來開發(fā)牛育種技術(shù)提供了寶貴的參考。此外，CRISPR技術(shù)在改進(jìn)胚胎操作和移植技術(shù)上也取得突破，使移植后的結(jié)果更符合商業(yè)目的。在綿羊大規(guī)模體外培養(yǎng)中，對受精卵進(jìn)行CRISPR/Cas顯微注射。第六天顯微注射胚胎的囊胚發(fā)育率為20.0%，而未進(jìn)行顯微注射的囊胚發(fā)育率為44.9%，雖然顯微注射后囊胚發(fā)育率較低，但是經(jīng)過顯微注射胚胎玻璃化后，出生率可達(dá)到85.7%［65］。胚胎操作技術(shù)改進(jìn)與CRISPR技術(shù)的結(jié)合在家畜育種精確度、遺傳改良等方面表現(xiàn)出極大前景。

3.2 家畜性別確定方面的應(yīng)用

研究發(fā)現(xiàn)，同一物種的脂肪沉積能力［66］、免疫能力［67］等生理特性與性別存在一定關(guān)系。在家畜生產(chǎn)領(lǐng)域，人們更偏向能帶來更高經(jīng)濟(jì)效益的家畜品種，而脂肪沉積能力、免疫能力等與家畜生產(chǎn)的畜產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量密切相關(guān)。若能人為確定家畜性別，將顯著提高畜產(chǎn)品的產(chǎn)量、質(zhì)量以及畜牧場的經(jīng)濟(jì)效益。

性別主要由性染色體決定，而性染色體的類型受基因調(diào)控，例如性別決定基因（sex-determining region Y，SRY）。在性別相關(guān)基因的研究中，Sry被證實可將XX小鼠轉(zhuǎn)化為雄性小鼠，該項研究不僅實現(xiàn)了性別轉(zhuǎn)化，還證明了Sry是小型嚙齒動物性別決定的關(guān)鍵基因［68］。為驗證該基因在雄性家畜中同樣具有性別決定作用，研究人員通過向胞質(zhì)內(nèi)顯微注射兩種CRISPR-Cas9 RNP復(fù)合物，靶向位于中心的高遷移率基團(tuán)（high mobility group，HMG），成功獲得SRY基因敲除豬，且培育出具有雌性表型的雄性豬，該研究進(jìn)一步證明了SRY基因在豬上同樣發(fā)揮重要作用，且HMG結(jié)構(gòu)域在雄性豬性別決定中具有核心作用［69］。鑒于大多數(shù)性別相關(guān)基因位于Y染色體上，研究者們利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)產(chǎn)生多重DSB將Y染色體降解，從而獲得XX基因型［70］。這種方法雖然保持了基因組的穩(wěn)定性，但仍有一定幾率發(fā)生特定染色體細(xì)胞消除。為優(yōu)化這一過程，研究人員借助CRISPR/Cas9系統(tǒng)在豬Y染色體中找到能被特異sgRNA識別的重復(fù)序列，進(jìn)行多位點切割產(chǎn)生多位點DSB損傷，利用DNA修復(fù)的穩(wěn)定性，有效促進(jìn)了目標(biāo)染色體的降解［71］。此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在體外試驗中表現(xiàn)出超過50%的切割效率，成功實現(xiàn)整條染色體的消除，并為后續(xù)實現(xiàn)豬的性別控制奠定基礎(chǔ)。除以上方法外，還可以利用熒光蛋白對胚胎后代性別進(jìn)行確定。通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的HDR在小鼠Y染色體上插入熒光報告基因eGFP獲得Y-Chr-eGFP轉(zhuǎn)基因雄鼠，經(jīng)過交配產(chǎn)生eGFP雄性后代，之后開始表達(dá)，僅通過觀察熒光便可以確定后代性別。為擴(kuò)大應(yīng)用范圍，研究人員將該方法應(yīng)用于巴馬豬。通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)對巴馬豬進(jìn)行基因編輯，最后成功獲得Y-Chr-eGFP轉(zhuǎn)基因克隆巴馬豬［72］，經(jīng)過交配產(chǎn)生雄性后代，eGFP則隨著Y染色體傳遞到雄性后代中，通過觀察熒光確定后代性別，觀察到熒光為雄性，反之則為雌性。該研究成功為豬性別預(yù)測提供了新思路。除了CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行性別控制外，TALENs技術(shù)也曾實現(xiàn)家畜的性別逆轉(zhuǎn)。通過TALENs技術(shù)將基因敲入牛SRY基因，之后將核進(jìn)行轉(zhuǎn)移成功生成性逆轉(zhuǎn)牛［73］。除了SRY基因，還有其他基因與性別決定有關(guān)。近期，Luthringer等［74］發(fā)現(xiàn)HMG-box基因也是動物性別的決定因素。由于該基因發(fā)現(xiàn)時間較短，具體功能和作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

隨著家畜性別控制技術(shù)日益成熟，顯著提高了育種精確度和實際生產(chǎn)的靈活性，有力地推動了畜牧業(yè)快速發(fā)展。CRISPR/Cas12系統(tǒng)具有較低的脫靶率，相比CRISPR/Cas9系統(tǒng)如果應(yīng)用在性別控制領(lǐng)域應(yīng)更具優(yōu)勢，但由于發(fā)展時間較短，目前并未應(yīng)用于該領(lǐng)域。

3.3 家畜模型構(gòu)建方面的應(yīng)用

在多種生殖細(xì)胞類型中，SSCs發(fā)揮重要作用。SSCs不僅可以通過自我更新維持干細(xì)胞池，還可以通過分化維持精子不斷產(chǎn)生。除此之外，SSCs還能受到細(xì)胞毒性損傷后再生生精譜系［75］。在研究SSCs相關(guān)基因表達(dá)的過程中發(fā)現(xiàn)，NANOS家族在所有生物生殖系發(fā)育過程中起著重要作用。相關(guān)研究表明，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對家豬NANOS2基因造成突變失活，使具有雙等位基因移碼突變（即敲除）的雄性豬生殖系消融，但仍具有形態(tài)完整的曲細(xì)精管，而且還發(fā)現(xiàn)具有完整NANOS2等位基因的雄性豬和雌性敲除豬是可育的［76］。從畜牧學(xué)角度看，NANOS2基因敲除的雄性豬未來可能成為供體SSCs移植的理想替代物，獲得理想品種。與NANOS2相比，NANOS3在胚胎發(fā)育早期就開始表達(dá)，并在原始生殖細(xì)胞中發(fā)揮抗凋亡的關(guān)鍵作用。研究人員將sgRNA和Cas9蛋白構(gòu)成的RNP復(fù)合物顯微注射至受精6 h的受精卵中，獲得NANOS3基因敲除牛，但是sgRNA的敲除效率并未超過75%。為提升敲除效率，對該系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計出雙gRNA編輯策略，敲除率高達(dá)75%。研究結(jié)果顯示，在NANOS3基因敲除牛胎兒睪丸中，原始生殖細(xì)胞在胎齡41天完全消除，但這并不影響生精小管的發(fā)育。此外，研究人員還成功生產(chǎn)出一頭活NANOS3敲除種系消融牛［77］。該研究不僅有助于研究人員深入了解NANOS3的功能，也為開發(fā)基于胚系互補(bǔ)的新型育種技術(shù)的開辟了全新的道路。此外，研究還發(fā)現(xiàn)ETV5基因?qū)SCs的自我更新和維持同樣起著重要作用。研究人員利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除萊蕪公豬ETV5基因，獲得理想的受體模型，成功構(gòu)建出生殖細(xì)胞消融的受體豬模型［78］。這種方法不僅擴(kuò)大了理想品種配子的可用性，還顯著提高了育種精確度、生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量。

異種移植成功的關(guān)鍵是異種抗原。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，GGTA1所編碼的酶是合成超急性排斥反應(yīng)主要異種抗原的關(guān)鍵成分，因此生成GGTA1編輯豬有助于推動異種移植的成功，利于深入了解其作用機(jī)制。研究人員通過電穿孔分別將設(shè)計的五種gRNA和Cas9蛋白共同引入豬合子中，使用編輯效率最高的gRNA生成GGTA1編輯豬。之后通過胚胎移植技術(shù)和電穿孔技術(shù)，子一代六頭仔豬中有五頭攜帶了GGTA1雙拷貝突變，且未出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象［79］。而在家畜生長過程中，細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子（suppressor of cytokine singnaling 2，SOCS2）作為生長激素負(fù)調(diào)控因子發(fā)揮重要作用。研究人員利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在山羊胚胎水平將SOCS2敲除，成功獲得SOCS2敲除山羊胚胎，有助于進(jìn)一步探索胚胎發(fā)育機(jī)制。其中，編輯效率高達(dá)94.1％，且未發(fā)現(xiàn)脫靶［80］。這些模型的成功塑造為家畜育種生物模型的構(gòu)建提供了有效參考。

4 總結(jié)與展望

隨著對CRISPR/Cas系統(tǒng)中ClassⅡ類研究的逐漸深入，CRISPR/Cas9系統(tǒng)和CRISPR/Cas12系統(tǒng)均表現(xiàn)出巨大潛力。從某些方面來看，CRISPR/Cas12系統(tǒng)或許更具優(yōu)勢，見表2［81］。但是由于CRISPR/Cas12系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)較晚，目前仍處于探索階段，所以并未得到廣泛應(yīng)用。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)已在畜牧學(xué)領(lǐng)域研究上取得顯著突破。例如，借助CRISPR/Cas9系統(tǒng)精準(zhǔn)編輯IGF2基因內(nèi)含子3中的ZBED6結(jié)合位點，極大地促進(jìn)了中國本土豬種的肌肉生長［82］。通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)將FAT-1基因成功敲入豬Rosa位點，有效提高了豬體內(nèi)多不飽和脂肪酸含量［83］。而通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除豬體內(nèi)分化簇163（Cluster of Differentiation，CD163）和組蛋白去乙酰酶6（Histone Deacetylase，HDAC6），進(jìn)一步表明CD163和HDAC6在豬繁殖與呼吸綜合征中具有關(guān)鍵抵抗活性［84-85］。同時，利用CRISPR/Cas9技術(shù)和TALENs技術(shù)產(chǎn)生堿基替換，成功在豬體內(nèi)生成人胰島素［86］。通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯與囊胚互補(bǔ)相結(jié)合，使嵌合宿主中培養(yǎng)完全外來器官的潛力被激活［87］。不僅如此，CRISPR/Cas9系統(tǒng)對家畜體細(xì)胞中的產(chǎn)肉基因［88］、產(chǎn)奶基因［89］、毛發(fā)基因［90］等進(jìn)行編輯，實現(xiàn)產(chǎn)肉量增加、奶品質(zhì)改善、毛發(fā)改良，成功將家畜品種進(jìn)行優(yōu)化。CRISPR/Cas9系統(tǒng)為家畜生殖細(xì)胞研究帶來的價值同樣是不可估量的。通過對生殖細(xì)胞生長、增殖相關(guān)基因編輯，獲得數(shù)量多、質(zhì)量好、活性高的配子［61-63］；對性別相關(guān)基因進(jìn)行編輯［69，71］，有助于生產(chǎn)出具有較高經(jīng)濟(jì)效益的同性家畜；構(gòu)建家畜模型［76-77，79］，則為進(jìn)一步研究精子發(fā)生和卵子發(fā)生的分子機(jī)制，加速育種進(jìn)程提供了有力工具。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前對小鼠生殖細(xì)胞的研究較多，而對家畜生殖細(xì)胞的研究較匱乏。鑒于物種間的差異，一些理論難以在家畜上應(yīng)用，因此有必要對家畜生殖細(xì)胞進(jìn)行專門研究。作為畜牧業(yè)大國，中國在

家畜的研究投入勢在必行。同時，由于CRISPR/Cas12系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)時間較短，對其了解尚不充分，限制了該技術(shù)在育種領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。但與CRISPR/Cas9系統(tǒng)相比，CRISPR/Cas12系統(tǒng)更具優(yōu)勢。但從CRISPR/Cas12系統(tǒng)的應(yīng)用現(xiàn)狀來看，仍有需要改進(jìn)的方面：CRISPR/Cas12系統(tǒng)高度依賴于宿主細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制，而這一機(jī)制與細(xì)胞分裂密切相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞分裂處于活躍狀態(tài)時，DNA修復(fù)機(jī)制受到明顯影響，從而導(dǎo)致CRISPR/Cas12系統(tǒng)編輯效率和準(zhǔn)確度下降。因此，在該方面仍需要進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化。未來，本團(tuán)隊將從優(yōu)化sgRNA設(shè)計、提高Cas12酶特異性、研發(fā)新型修復(fù)途徑等方面開發(fā)新策略，以增強(qiáng)CRISPR/Cas12系統(tǒng)的編輯性能，并將其應(yīng)用于牛、羊等大型家畜，并為提高育種精確度打下堅實基礎(chǔ)。

展望未來，CRISPR/Cas系統(tǒng)有望用于糾正家畜生殖細(xì)胞中由單基因突變引起的遺傳疾病，從而改善后代的遺傳特性。又鑒于家畜有限的壽命和生產(chǎn)能力，未來可通過CRISPR/Cas系統(tǒng)編輯胚胎細(xì)胞，從源頭對影響壽命和生產(chǎn)能力相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控，從而延長家畜壽命，提高畜產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量。目前，仍有很多研究方向尚未被充分挖掘，科研團(tuán)隊需不斷探索未知領(lǐng)域。隨著研究的深入，基因編輯技術(shù)也需要不斷更新升級，開發(fā)更精確、成本更低、編輯效率更高的新型CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)，不僅是當(dāng)前面臨的挑戰(zhàn)，也是基因編輯技術(shù)發(fā)展取得突破性進(jìn)展的關(guān)鍵。

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（編輯 郭云雁）