桑樹桑黃總?cè)频奶崛〖兓捌渖锘钚匝芯?/h1>
2025-03-19 00:00:00劉坤付鑫垚郭彤張婉月趙慶生孔澤娟程華宋恒
廣西植物 2025年2期
摘 要：為了優(yōu)化桑樹桑黃總?cè)频奶崛」に嚕兓側(cè)撇⒎治銎浠瘜W(xué)成分及其抗腫瘤和抗氧化活性。該研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化桑樹桑黃總?cè)频奶崛」に?，?jīng)D101型大孔樹脂和Sephadex LH-20層析聯(lián)用純化總?cè)疲Y(jié)合UHPLC-ESI-MS技術(shù)分析三萜成分，并通過CCK8法、DPPH法和ABTS法對其進行抗腫瘤和抗氧化活性測定。結(jié)果表明：（1）最佳提取工藝為提取時間55 min、提取溫度45 ℃、乙醇濃度75%、液料比35∶1（mL·g-1），此條件下總?cè)坪繛?0.34 mg·g-1。（2）純化后的Fraction a（Fa）組分純度為47.98%，提高了3.8倍；從Fa中檢測出8種三萜成分，即甘草次酸、黃柏酮、熊果酸、大戟醇、24，25-二氫羊毛甾醇、大豆皂苷B、羊毛甾醇、山楂酸。（3）200 μg·mL-1時Fa對腫瘤細胞PC3的抑制率為68.65%，高于5-氟尿嘧啶66.30%；Fa對DPPH自由基和ABTS自由基均有較高的清除能力，半數(shù)清除率分別為42.76 μg·mL-1和66.24 μg·mL-1。該研究為桑樹桑黃總?cè)频倪M一步研究和利用提供理論基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞：桑樹桑黃，三萜，響應(yīng)面優(yōu)化，純化，抗腫瘤，抗氧化
中圖分類號：Q946
文獻標識碼：A
文章編號：1000-3142（2025）02-0217-11
基金項目：河北省重點研發(fā)計劃項目（21327109D）； 河北省科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費制度試點項目（2024PF04）。
第一作者：劉坤（1976—），博士，副教授，主要從事真菌資源利用研究，（E-mail）liuqueen2003@163.com。
*通信作者：程華，碩士，研究員，主要從事中藥藥效成分提取與活性研究，（E-mail）13933137792@139.com。
Extraction，purification and biological activity of total triterpenes from Sanghuangporus sanghuang
LIU Kun1，2，F(xiàn)U Xinyao1，GUO Tong1，ZHANG Wanyue1，ZHAO Qingsheng3，KONG Zejuan4，CHENG Hua4*，SONG Heng5
（1. College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Economics and Business，Shijiazhuang 050061，China; 2. Department of Mathematics and Statistics，Hebei University of Economics and Business，Shijiazhuang 050061，China; 3. Institute of Process Engineering，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190，China; 4. Institute of Biology，Hebei Academy of Sciences，Shijiazhuang 050081，China; 5. Research Office of Sanghuangporus sanghuang，Peace Angel （Zhejiang） Traditional Chinese Medicine Slices Co.，Ltd.，Jiaxing 314000，Zhejiang，China）
Abstract：In order to optimize the extraction process of total triterpenes from Sanghuangporus sanghuang，to purify total triterpenes，and to analyze its chemical components，as well as its antitumor and antioxidant activities. The response surface method was used to optimize the extraction process of total triterpenes from S. sanghuang. D101 macroporous resin and Sephadex LH-20 chromatography were used to purify total triterpenes. Meanwhile UHPLC-ESI-MS technology was used to analyze the component of triterpenes. The antitumor and antioxidant activities of total triterpenes were studied by the methods of CCK8，DPPH and ABTS. The results were as follows：（1） The optimal conditions were extraction time 55 min，extraction temperature 45 ℃，ethanol concentration 75% and liquid-solid ratio of 35∶1 （mL·g-1）. Under these conditions，the total triterpenes content was 10.34 mg·g-1. （2） The purity of Fraction a （Fa） was increased by 3.8 times to 47.98%. Eight triterpene components were identified from Fa，those were glycyrrhetinic acid，obakunone，ursolic acid，euphol，24，25-dihydrolanosterol，soyasaponin B，lanosterol and maslinic acid. （3） The inhibition rate of Fa on PC3 was 68.65% at 200 μg·mL-1，which was higher than that of 5-fluorouracil （66.30%）. Fa exhibited high DPPH and ABTS free radical scavenging capacities，and scavenging rates with IC50 values of 42.76 μg·mL-1 and 66.24 μg·mL-1，respectively. This study provides a theoretical basis for further research and utilization of total triterpenes from S. sanghuang.
Key words：Sanghuangporus sanghuang，triterpene，response surface optimization，purification，antitumor，antioxidant
桑黃是我國一類名貴的傳統(tǒng)藥用真菌，具有抗腫瘤和抗氧化等多種生物活性，其中桑樹桑黃（Sanghuangporus sanghuang）屬于桑黃的一種，為多年生大型真菌，分布于我國暖溫帶和溫帶的部分省份，以及日本、韓國、緬甸等國家（吳聲華和戴玉成，2020）。桑樹桑黃中含有的活性物質(zhì)主要有多糖和三萜等（付立忠等，2021；范祺等，2022），其中三萜類化合物是一類具有抗腫瘤和抗氧化等生理活性的次級代謝產(chǎn)物（譚世強等，2012），在健康輔助食品、天然藥物等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
三萜類化合物的提取方法主要有微波輔助提取法、超聲輔助提取法、超高壓提取法和超臨界提取法（薛巖偉，2023）。其中，超臨界提取法環(huán)境污染小、提取穩(wěn)定性高，但其提取技術(shù)較難，能耗較高；超高壓提取法的提取效率高、時間短，能較好地保持提取物活性，但其設(shè)備占用空間大，不易在實驗室使用（薛巖偉，2023）。微波輔助提取法和超聲輔助提取法具有提取率高、耗時少且適合實驗室操作等優(yōu)點，經(jīng)文獻查閱桑黃三萜的提取采用超聲輔助提取法較多且其提取率較高。例如，梁佳等（2011）利用微波輔助提取法優(yōu)化了桑黃三萜提取工藝，但得率較低，僅為1.48 mg·g-1；謝江寧等（2012）利用超聲輔助提取法優(yōu)化了桑黃總?cè)铺崛」に嚕繛?.40 mg·g-1；何策等（2021）利用超聲輔助提取法優(yōu)化了桑樹桑黃總?cè)铺崛」に?，純度?2.32%±0.17%，但未對其進行進一步純化及成分鑒定。大孔樹脂因其具有機械強度高、耐酸堿性能好、使用壽命長等優(yōu)點，被廣泛用于天然產(chǎn)物的分離純化和富集且目前是純化三萜常用的材料（李雪峰等，2017）。三萜類物質(zhì)分子量大小接近，Sephadex LH-20是根據(jù)化合物的分子大小來進行分離，與其他純化方法聯(lián)用會提高三萜純化效率（陳亞軍等，2016）。樊梓鸞等（2019）聯(lián)合使用大孔吸附樹脂及Sephadex LH-20對紅豆越橘總?cè)七M行分離純化，其純度從5.13%提高至43.25%。因此，采用超聲輔助提取，大孔樹脂結(jié)合Sephadex LH-20分離純化可能可以有效提高桑黃三萜提取率及提高桑黃三萜純度。
桑黃中含有大量的三萜類化合物，并且已有關(guān)于桑黃三萜抗腫瘤及抗氧化活性的研究報道，如桑黃三萜對人結(jié)腸癌細胞HT-29和人前列腺癌細胞PC3有一定的抑制作用（Kim et al.，2020）。桑黃三萜具有抗氧化活性（Zhou et al.，2022），但桑樹桑黃研究起步較晚，是吳聲華（2012）發(fā)現(xiàn)的一個新種。目前，活性物質(zhì)研究多集中在多糖（Cheng et al.，2020）和黃酮多酚（Liu et al.，2017），關(guān)于桑樹桑黃總?cè)萍兓⒊煞址治黾捌淇鼓[瘤和抗氧化活性的研究還少有報道。
本課題組通過響應(yīng)面法優(yōu)化桑樹桑黃總?cè)频奶崛」に?、?jīng)大孔樹脂和Sephadex LH-20層析聯(lián)用純化總?cè)?，采用UHPLC-ESI-MS分析其主要三萜成分，并研究其體外抗腫瘤和抗氧化活性，旨在探討桑樹桑黃總?cè)频奶崛」に?、純化方法、成分分析及其抗腫瘤和抗氧化活性，為桑樹桑黃總?cè)频倪M一步研究和開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料和儀器
桑樹桑黃購自吉林省敦化市，經(jīng)河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)張香美教授鑒定；人結(jié)腸癌細胞HCT-116、人胃腺癌細胞SGC7901、人前列腺癌細胞PC3由河北省科學(xué)院生物研究所程華老師提供。
香草醛、5-氟尿嘧啶和齊墩果酸（上海麥克林生化有限公司）；D101和NKA-9型大孔樹脂（北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司）；AB-8、ADS-8和HPD-100A型大孔樹脂（天津浩聚樹脂科技有限公司）；Sephadex LH-20（上海源葉生物科技有限公司）；DPPH和ABTS試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；高糖DMEM培養(yǎng)基、DEM/F-12 1∶1培養(yǎng)基（Cytiva公司）；胰蛋白酶-EDTA 消化液、DMSO、CCK8試劑盒和細胞凍存液（北京索萊寶科技有限公司）。
BJ-1000A振動式藥物超微粉碎機（青島聚創(chuàng)環(huán)保集團有限公司）；FRQ-1010HT超聲清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；Alpha 2-4 LDplus冷凍干燥機（德國Christ公司）；Multiskan GO酶標儀、液相色譜儀-Vanquish、質(zhì)譜儀-Orbitrap Exploris 120（賽默飛世爾科技有限公司）；C170 CO2細胞培養(yǎng)箱（德國艾本德股份公司）。
1.2 實驗方法
1.2.1 桑樹桑黃總?cè)频奶崛?將桑樹桑黃子實體粉碎，60 ℃烘干至恒重后，過40目篩備用。準確稱取1 g的桑樹桑黃干粉于離心管中，一定條件下進行超聲輔助乙醇提?。?00 W），冷卻后過濾提取液，進一步減壓濃縮和冷凍干燥后得到桑樹桑黃總?cè)拼痔嵛铩?/p>
1.2.2 總?cè)坪亢图兌鹊挠嬎?按照李英迪等（2021）的三萜測定方法，即依次吸取0.2 mg·mL-1的齊墩果酸標準品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于20 mL比色管中，水浴蒸干溶劑，加入0.2 mL 5%的香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，振蕩均勻，75 ℃恒溫水浴18 min，取出后快速冷卻，加入乙酸乙酯定容至5 mL，552 nm處測定吸光度（A）。繪制齊墩果酸標準曲線，得線性回歸方程y=3.591 1x-0.016 3（R2 = 0.992 9）。稱取定量的總?cè)铺崛∥镉谠嚬苤?，根?jù)線性方程計算樣品中總?cè)频馁|(zhì)量，再根據(jù)下面公式計算桑樹桑黃總?cè)坪亢图兌取?/p>
1.2.3 單因素試驗 按照1.2.1的提取工藝進行單因素分析，分別考察提取溫度、提取時間、液料比、乙醇濃度4個因素對桑樹桑黃總?cè)坪康挠绊憽?/p>
1.2.4 響應(yīng)面實驗 根據(jù)單因素結(jié)果，選擇乙醇濃度（A）、液料比（B）和提取溫度（C）作為自變量，以總?cè)坪孔鳛轫憫?yīng)值，設(shè)計三因素三水平實驗對總?cè)频奶崛」に囘M行優(yōu)化，試驗因素與水平設(shè)計見表1。
1.2.5 總?cè)频姆蛛x純化
1.2.5.1大孔樹脂的篩選 根據(jù)吸附率和解析率公式對AB-8、ADS-8、HPD-100A、D101和NKA-9 5種大孔樹脂進行篩選，選用最佳的大孔樹脂進行純化。將pH值為 6的1.5 BV的上樣溶液（濃度為1.0 mg·mL-1）以2 mL·min-1流速上樣，吸附5 h后，依次用2 BV蒸餾水和5 BV 70%乙醇溶液以2 mL·min-1的速度洗脫，收集70%乙醇的洗脫液。
式中：C0和C1分別為吸附前后溶液中總?cè)频臐舛龋╩g·mL-1）。
式中：C0和C1分別為吸附前后溶液中總?cè)频臐舛龋╩g·mL-1）； C2為解吸附后溶液中總?cè)频臐舛龋╩g·mL-1）； V1和V2為樣品液和解吸液的體積（mL）。
1.2.5.2 Sephadex LH-20純化桑樹桑黃總?cè)?將上述初步純化的三萜粗提物減壓濃縮，冷凍干燥，取10 mg三萜粗提物溶于1 mL甲醇中，用濾膜過濾（0.22 μm），上樣，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱（10 mm × 600 mm）進一步純化，分別使用30%、60%甲醇各250 mL先后洗脫，流速為1 mL·min-1，每10 mL收集一管，每個梯度收集25管，收集完成后用高氯酸-冰醋酸顯色法（李英迪等，2021）做出洗脫曲線，合并洗脫峰。
1.2.6 總?cè)瞥煞值臋z測 將純化后的三萜粉末3 mg溶解到3 mL甲醇溶液中，渦旋振蕩1 min，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，即得檢測溶液。
液相條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLCHSS T3（2.1 mm × 150 mm，1.8 μm）。正離子模式，流動相為0.1%甲酸水（A）和0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫：0～1 min，2% B；1～9 min，2%→50% B；9～12 min，50%→98% B；12～13.5 min，98% B；13.5～14 min，98%→2% B；14～20 min，2% B。負離子模式，流動相為5 mmol·L-1甲酸銨水（A）和乙腈（B），洗脫梯度與正離子模式相同；流速為0.25 mL·min-1；柱溫為40 ℃；進樣體積為2 μL。
質(zhì)譜條件：Thermo Orbitrap Exploris 120質(zhì)譜檢測器（Thermo Fisher Scientific，USA），電噴霧離子源（ESI），正負離子模式。噴霧電壓為3.50 kV（+）和-2.50 kV（-）；檢測質(zhì)量掃描范圍為m/z 100～1 000；鞘氣和輔助氣的體積流量分別為30 arb和10 arb；毛細管溫度為325 ℃；MS分辨率為60 000，MS/MS分辨率為15 000。
根據(jù)精確分子量進行代謝物的鑒定（分子量誤差≤5×10-6），后續(xù)根據(jù)MS/MS碎片模式對mzClound（https：//www.mzcloud.org）以及標準品數(shù)據(jù)庫等對比推測并篩選出三萜代謝物。
1.2.7 桑樹桑黃總?cè)瓶鼓[瘤活性 參照Liu等（2017）的方法（CCK8法），研究桑樹桑黃總?cè)茖Π┘毎鸋CT-116、SGC7901和PC3增殖的抑制作用。將濃度為每毫升5×104個的對數(shù)生長期的癌細胞加入96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)箱中孵育24 h。將不同濃度樣品100 μL加入各孔中，培養(yǎng)24 h；吸出各孔培養(yǎng)基，加入含10% CCK8的PBS溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，檢測450 nm的吸光度（A）。根據(jù)以下公式計算樣品對各個細胞的抑制率，陽性對照為5-氟尿嘧啶。
細胞增殖抑制率%=A對照組-A實驗組A對照組-A空白組×100。
式中：A對照組為陽性對照的吸光度; A實驗組為實驗樣品的吸光度； A空白組為不加樣品的空白組吸光度。
1.2.8 桑樹桑黃總?cè)瓶寡趸钚詼y定
1.2.8.1 DPPH自由基清除率的測定 參照劉坤等（2018）的方法，將100 μL DPPH自由基溶液（60 μmol·L-1）與100 μL不同濃度的樣品溶液混合，室溫避光孵育30 min，517 nm處測定吸光度（A），VC作為陽性對照。對照組和處理組都重復(fù)3次。
清除率%=A對照組-A樣品A對照組×100。
式中：A對照組為對照的吸光度； A樣品為樣品反應(yīng)液（處理組）的吸光度。
1.2.8.2 ABTS自由基清除率的測定 參照劉坤等（2017）的方法。200 μL反應(yīng)體系中加入150 μL ABTS反應(yīng)液和50 μL不同濃度的樣品，用酶標儀測定734 nm的吸光度（A），VC為陽性對照。對照組和處理組都重復(fù)3次。自由基清除率的計算公式與DPPH法一致。
1.2.9 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)使用Prism 9軟件作圖，并使用SPSS 22.0和Design-Expert 13進行數(shù)據(jù)分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素結(jié)果
提取時間、乙醇濃度、提取溫度、液料比對總?cè)坪康挠绊懸妶D1。由圖1可知，四因素均出現(xiàn)了三萜提取量先升后降的趨勢。固定條件為乙醇濃度85%、提取溫度35 ℃、液料比25∶1（mL·g-1）時，提取時間55 min時，總?cè)坪孔罡撸▓D1：A）；固定條件為提取溫度35 ℃、液料比25∶1（mL·g-1）、提取時間55 min時，乙醇濃度為75%時，總?cè)坪孔罡撸▓D1：B）；固定條件為液料比25∶1（mL·g-1）、提取時間55 min、乙醇濃度75%時，提取溫度45 ℃時，總?cè)坪孔罡撸▓D1：C）；固定條件為提取時間55 min、乙醇濃度75%、提取溫度35 ℃時，液料比35∶1（mL·g-1）時，總?cè)坪孔罡撸▓D1：D）。綜合考慮，最終選擇提取時間55 min、乙醇濃度75%、提取溫度45 ℃和液料比35∶1（mL·g-1）為最佳單因素條件。
2.2 響應(yīng)面優(yōu)化及分析
由于單因素試驗中，提取時間、乙醇濃度、提取溫度和液料最佳條件總?cè)坪颗c相鄰條件的最大差值分別為0.46、0.64、1.26、1.65 mg·g-1，可見時間因素對三萜提取量影響相對較小，綜合考慮只對乙醇濃度（A）、液料比（B）和提取溫度（C）3個因素做了響應(yīng)面分析，響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。采用軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到方程Y=10.75-0.704 5A+0.318 9B+0.079 0C+0.460 9AB-0.198 0AC-0.711 2BC-1.58A2-0.941 1B2-1.25C2。由表3可知，所建立模型的P＜0.01，差異極顯著；失擬項P＝0.140 5，差異不顯著，表明模型可靠性較高，實驗誤差較小，可用于桑樹桑黃總?cè)铺崛×康念A(yù)測。其中，A和B達到極顯著水平且A對總?cè)铺崛×康挠绊懘笥贐；AB、BC交互作用對結(jié)果影響極顯著；二次項A2、B2、C2對結(jié)果影響均極顯著。
響應(yīng)面圖的傾斜程度越大說明響應(yīng)值對該因素變化越敏感，等高線圖則是越接近橢圓說明2因素交互作用對總?cè)铺崛×康挠绊懺斤@著（謝小麗等，2023）。通過圖2：A、C的響應(yīng)面圖可看出曲線有較大弧度，表明交互項AB和BC對桑樹桑黃總?cè)铺崛×坑酗@著的影響，這個結(jié)果與表3的結(jié)果一致。從圖2：a、c中的等高線圖可看出其為橢圓形，而圖2：b等高線接近圓形，說明除AC交互項外，其他因素之間的交互作用對桑樹桑黃總?cè)铺崛×坑绊戯@著，這與表3的結(jié)果也一致。
通過響應(yīng)面分析得到桑樹桑黃總?cè)频淖罴烟崛」に嚍橐毫媳?5.56∶1（mL·g-1），乙醇濃度72.93%，超聲溫度45.15 ℃，預(yù)測在該條件下總?cè)坪繛?0.84 mg·g-1?？紤]到實際操作的可行性，將試驗條件調(diào)整為液料比36∶1（mL·g-1）、乙醇濃度73%、 超聲溫度45 ℃。重復(fù)3次進行驗證，桑樹桑黃總?cè)频暮繛椋?0.34±0.23） mg·g-1，該值與理論值接近，即實際值與理論值之間的擬合度較好。
2.3 桑樹桑黃總?cè)频姆蛛x純化
由表4可知，HPD-100A和D101對桑樹桑黃總?cè)贫加胁诲e的吸附率，但D101對桑樹桑黃總?cè)频慕馕雎室獜娪贖PD-100A，因此選擇D101型樹脂用于桑樹桑黃總?cè)频募兓?/p>
大孔樹脂純化后的總?cè)铺崛∥锝?jīng)Sephadex LH-20柱層析分離后得到2個峰（圖3），合并兩個峰得到Fa（峰a）和Fb（峰b）?？紤]到Fb為60%甲醇收集，顏色較深、色素影響較大且三萜含量較低，因此選擇峰值較大的Fa進行進一步研究且其純度提高至47.98%。
2.4 桑樹桑黃總?cè)瞥煞址治?/p>
采用UHPLC-ESI-MS檢測Fa組分，并采用正、負離子兩種模式對其信號進行了識別。鑒定結(jié)果見表5，共檢測出8個三萜類化合物，分別為甘草次酸、黃柏酮、熊果酸、大戟醇、24，25-二氫羊毛甾醇、大豆皂苷B、羊毛甾醇、山楂酸。
2.5 抗腫瘤活性及抗氧化活性
Fa組分較桑樹桑黃總?cè)拼痔嵛飳δ[瘤細胞HCT-116、SGC7901和PC3的抑制作用都有所提高且與濃度呈正相關(guān)關(guān)系，其對腫瘤細胞PC3的抑制作用相對較好（圖4）。在濃度為200 μg·mL-1時，F(xiàn)a組分對HCT-116、SGC7901和PC3的抑制率分別為40.65%、20.65%和68.65%，其中對腫瘤細胞PC3的抑制率高于5-氟尿嘧啶的66.30%，但其半數(shù)抑制率（IC50=53.39 μg·mL-1）高于5-氟尿嘧啶（IC50=35.31 μg·mL-1）且差異顯著（P＜0.05）。
Fa組分較桑樹桑黃總?cè)拼痔嵛锏腄PPH自由基和ABTS自由基清除率都有所提高，并且與濃度呈正相關(guān)關(guān)系（圖5）。在濃度為200 μg·mL-1時，F(xiàn)a組分對DPPH自由基和ABTS自由基的清除率分別為89.10%和72.45%，半數(shù)清除率濃度分別為42.76 μg·mL-1和66.24 μg·mL-1，低于VC的半數(shù)清除率濃度9.94 μg·mL-1和19.16 μg·mL-1且差異顯著（P＜0.05）。
3 討論與結(jié)論
本實驗首先對桑樹桑黃總?cè)频奶崛∵M行了單因素分析，其中提取時間、乙醇濃度和液料比等均出現(xiàn)了先升后降的趨勢，這是由于提取時間可以增加溶劑與溶質(zhì)之間的傳質(zhì)和相互作用，但加熱時間過長會使三萜物質(zhì)的結(jié)構(gòu)遭到破壞（何策等，2021），因此出現(xiàn)了先升后降的趨勢；不同乙醇濃度對三萜類化合物的溶解度不同，濃度超過75%時一些非極性雜質(zhì)可能會過多溶出，反而出現(xiàn)下降趨勢（楊開等，2018）；當(dāng)液料比低于35∶1（mL·g-1）時，可能單位體積液體受到的超聲波作用功率變小，而使三萜提取量下降（楊開等，2018）。單因素結(jié)合響應(yīng)面分析后，確定最佳提取工藝為提取時間55 min、提取溫度45 ℃、乙醇濃度75%、液料比35∶1（mL·g-1），此工藝提取的桑樹桑黃總?cè)坪繛?0.34 mg·g-1，與理論值之間的擬合度較好，高于微波輔助提取的暴馬桑黃總?cè)坪浚?.81 mg·g-1）（張林芳等，2015）和超聲輔助法提取的桑黃總?cè)坪浚?.40 mg·g-1）（謝江寧等，2012），并且與齊欣等（2010）的研究結(jié)果桑樹桑黃總?cè)频暮勘绕渌｜S要高相一致。此外，桑樹桑黃總?cè)拼痔嵛锛兌葹?2.61%，與何策等（2021）報道的總?cè)拼痔嵛锛兌?2.32%較接近。說明桑樹桑黃的三萜含量相對穩(wěn)定且屬于三萜含量較高的一種桑黃。
經(jīng)D101型樹脂純化后，桑樹桑黃總?cè)萍兌葟?2.61%提高到21.53%，這與杜令娟等（2017）的報道較一致（經(jīng)D101型樹脂純化后，總?cè)萍兌葟?.20%提高至20.94%）。再經(jīng)Sephadex LH-20進一步純化后，得到的Fa組分純度提高至47.98%。以上表明大孔吸附樹脂結(jié)合Sephadex LH-20是一種有效的桑樹桑黃三萜純化方法。
經(jīng)UHPLC-ESI-MS檢測，從Fa組分測出8個三萜類化合物，即甘草次酸、黃柏酮、熊果酸、大戟醇、24，25-二羥基羊毛甾醇、大豆皂苷B、羊毛甾醇和山楂酸，說明Fa中含具有良好藥用價值的三萜單體成分。通過體外實驗，發(fā)現(xiàn)Fa對腫瘤細胞HCT-116、SGC7901和PC3的抑制作用都有所提高，其中對PC3的抑制作用最佳，IC50值為53.39 μg·mL-1。Fa組分對DPPH自由基和ABTS自由基均有較好的清除活性，半數(shù)清除率濃度分別為42.76 μg·mL-1和66.24 μg·mL-1。有研究表明三萜結(jié)構(gòu)中側(cè)鏈上與羧基共軛的雙鍵可能是活性基團，具有羧基的三萜化合物具有抗腫瘤活性，各物質(zhì)中羥基取代基的位置也關(guān)系到抗腫瘤活性的強弱（王華，2012；杜國華等，2017）。經(jīng)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，化合物1、3-8在C-3位置上均有羥基，化合物1、3、6和8在C-12處有雙鍵的存在，這些基團可能是重要的抗腫瘤活性位點，并且化合物3（Zhang et al.，2010）、化合物4（Grade et al.，2022）和化合物7（Fu et al.，2022）都能促進腫瘤細胞PC3的凋亡?；衔?（Chen et al.，2013）和化合物3（Ramachandran amp; Prasad，2008）也有DPPH自由基和ABTS自由基清除活性的報道，F(xiàn)a組分對DPPH自由基和ABTS自由基的清除活性可能與這些三萜化合物密切相關(guān)。綜上所述，F(xiàn)a具有一定的抗腫瘤和抗氧化活性的三萜類物質(zhì)，可作為一種安全的天然抗腫瘤和抗氧化劑。
值得注意的是桑樹桑黃在純化過程中損失率較高，分離純化手段有待進一步探討，并且鑒定出的三萜種類較少，今后需要改善三萜成分的鑒定手段。本研究對桑樹桑黃總?cè)频闹苽浞蛛x、成分鑒定及抗腫瘤和抗氧化活性提供了依據(jù)，也為三萜生物活性的深入研究和開發(fā)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
參考文獻：
CHEN S，ZOU L，LI L，et al.，2013. The protective effect of glycyrrhetinic acid on carbon tetrachloride-induced chronic liver fibrosis in mice via upregulation of Nrf2 ［J］. PLoS ONE，8（1）：e53662.
CHEN YJ，GAO Y，YANG CJ，et al.，2016. Application of dextran gel Sephadex LH-20 in separation and purification of natural products ［J］. Chemical Engineer，30（8）：53-55. ［陳亞軍，高巖，楊春娟，等，2016. 葡聚糖凝膠Sephadex LH-20在天然產(chǎn)物分離純化中的應(yīng)用 ［J］. 化學(xué)工程師，30（8）：53-55.］
CHENG J，SONG J，WEI H，et al.，2020. Structural characterization and hypoglycemic activity of an intracellular polysaccharide from Sanghuangporus sanghuang mycelia ［J］. International Journal of Biological Macromolecules，164（12）：3305-3314.
DU GH，WANG HX，YAN Z，et al.，2017. Anti-tumor target prediction and activity verification of Ganoderma lucidum triterpenoids ［J］. China Journal of Chinese Materia Medica，42（3）：517-522. ［杜國華，王宏旭，閆征，等，2017. 靈芝三萜化合物的抗腫瘤靶點預(yù)測與活性驗證 ［J］. 中國中藥雜志，42（3）：517-522.］
DU LJ，KANG N，LI DH，et al.，2017. Primary purification and in vitro hypolipidemic activity of triterpenoid from Inonotus hispidus ［J］. Forest Engineering，33（5）：29-34. ［杜令娟，康寧，李德海，等，2017. 粗毛纖孔菌三萜初級純化及體外降血脂研究 ［J］. 森林工程，33（5）：29-34.］
FAN Q，WU MY，ZHANG BH，et al.，2022. Main active components of Phellinus linteus and its domestic and international research progress ［J］. China Fruit amp; Vegetable，42（11）：50-55. ［范祺，吳茂玉，張博華，等，2022. 桑黃的主要活性成分及國內(nèi)外研究進展 ［J］. 中國果菜，42（11）：50-55.］
FAN ZL，ZHAO ZR，ZHAO X，et al.，2019. Purification of total triterpenoids from lingonberry and anti-inflammatory activity in vitro ［J］. Journal of Nanjing Forestry University （Natural Science Edition），43（4）：132-138. ［樊梓鸞，趙梓煣，趙翔，等，2019. 紅豆越橘總?cè)频募兓绑w外抗炎活性 ［J］. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），43（4）：132-138.］
FU LZ，LU N，YAN J，et al.，2021. Analyses and evaluation of nutrition，active component and antioxidant activities of fruiting bodies of three species of Sanghuangporus ［J］. Mycosystema，40（8）：2148-2158. ［付立忠，陸娜，閆靜，等，2021. 三種桑黃屬真菌人工栽培子實體營養(yǎng)、藥效成分及抗氧化活性分析評價 ［J］. 菌物學(xué)報，40（8）：2148-2158.］
FU YK，WANG BJ，TSENG JC，et al.，2022. Combination treatment of docetaxel with caffeic acid phenethyl ester suppresses the survival and the proliferation of docetaxel-resistant prostate cancer cells via induction of apoptosis and metabolism interference ［J］. Journal of Biomedical Science，29（1）：16.
GADE IS，CHADNEAU C，TAGNE SIMOR，et al.，2022. Euphol from Tapinanthus sp. induces apoptosis and affects signaling proteins in glioblastoma and prostate cancer cells ［J］. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention，23（12）：4205-4212.
HE C，WANG C，CHEN C，et al.，2021. Optimization of extraction technology of total triterpenoids from Inonotus sanghuang and their hypolipidemic and antioxidant activities ［J］. Science and Technology of Food Industry，42（7）：208-215. ［何策，王超，陳純，等，2021. 桑樹桑黃總?cè)铺崛」に噧?yōu)化及其降血脂、抗氧化活性研究 ［J］. 食品工業(yè)科技，42（7）：208-215.］
KIM J，YANG SC，HWANG AY，et al.，2020. Composition of triterpenoids in Inonotus obliquus and their anti-proliferative activity on cancer cell lines ［J］. Molecules，25（18）：2618.
LIU K，JIA YJ，LI HX，et al.，2017. Analysis of antioxidant activity and active components of Phellinus robustus ［J］. Chinese Pharmaceutical Journal，52（16）：1393-1396. ［劉坤，賈艷菊，李會宣，等，2017. 稀硬木層孔菌的抗氧化活性及其活性成分分析 ［J］. 中國藥學(xué)雜志，52（16）：1393-1396.］
LIU K，LIU MF，WANG JL，et al.，2018. Antioxidant，antibacterial and antitumor activities and chemical constituents of Geastrum fimbriatum ［J］. Guihaia，38（7）：953-959. ［劉坤，劉名飛，王俊麗，等，2018. 毛咀地星的抗氧化、抗菌和抗腫瘤活性和化學(xué)成分研究 ［J］. 廣西植物，38（7）：953-959.］
LIU K，XIAO X，WANG J，et al.，2017. Polyphenolic composition and antioxidant，antiproliferative，and antimicrobial activities of mushroom Inonotus sanghuang ［J］. LWT - Food Science and Technology，82（12）：154-161.
LI XF，F(xiàn)U ZR，ZHANG XX，et al.，2017. Adsorption characteristic of total triterpenes in Akebia trifoliata pericarp by macroporous resin ［J］. Natural Product Research and Development，29（12）：1999-2003. ［李雪峰，符智榮，張曉旭，等，2017. 大孔樹脂對八月瓜果皮總?cè)频奈教匦匝芯?［J］. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，29（12）：1999-2003.］
LI YD，CAO Y，XIA QL，et al.，2021. Optimization of extraction process of Hericium erinaceus triterpenes and its antioxidant activity ［J］. Science and Technology of Food Industry，42（22）：153-159. ［李英迪，曹艷，夏其樂，等，2021. 猴頭菇三萜提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性分析 ［J］. 食品工業(yè)科技，42（22）：153-159.］
LIANG J，SUN MY，ZHANG T，et al.，2011. Optimization of extracting triterpene from Phellinus igniarius by response surface methodology ［J］. Chinese Agricultural Science Bulletin，27 （10）：235-238. ［梁佳，孫夢伊，張騰，等，2011. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化桑黃菌絲體中三萜的微波提取工藝 ［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報，27（10）：235-238.］
QI X，ZHANG J，CHEN Y，et al.，2010. Comparative analysis of bioactive components in fruit bodies of Phellinus linteus growing on six species of trees ［J］. Food Science，31（6）：199-201. ［齊欣，張峻，陳穎，等，2010. 六種不同樹種桑黃有效成分的比較 ［J］. 食品科學(xué)，31（6）：199-201.］
RAMACHANDRAN S，PRASAD NR，2008. Effect of ursolic acid，a triterpenoid antioxidant，on ultraviolet-B radiation-induced cytotoxicity，lipid peroxidation and DNA damage in human lymphocytes ［J］. Chemico-biological Interactionst，176（2/3）：99-107.
TAN SQ，XIE JY，GUO S，et al.，2012. Research advances in physiological activities of triterpenoids ［J］. Chinese Agricultural Science Bulletin，28（36）：23-27. ［譚世強，謝敬宇，郭帥，等，2012. 三萜類物質(zhì)的生理活性研究概況 ［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報，28（36）：23-27.］
WANG H，2012. Investigation on the antioxidant activity and antitumor activity of triterpenoid in Pleurotus eryngii ［D］. Tianjin：Tianjin University：46-47. ［王華，2012. 杏鮑菇中三萜類化合物的抗氧化、抗腫瘤活性的研究 ［D］. 天津：天津大學(xué)：46-47.］
WU SH，2012. Rectification the name of the precious medicinal fungus “Sanghuang” ［J］. Edible and Medical Mushroom，20（3）：177-179. ［吳聲華，2012. 珍貴藥用菌“桑黃”物種正名 ［J］. 食藥用菌，20（3）：177-179.］
WU SH，DAI YC，2020. Species clarification of the medicinal fungus Sanghuang ［J］. Mycosystema，39（5）：781-794. ［吳聲華，戴玉成，2020. 藥用真菌桑黃的種類解析 ［J］. 菌物學(xué)報，39（5）：781-794.］
XIE JN，SONG SF，LI X，et al.，2012. Extraction of total triterpenoids from Phellinus igniarius and evaluation its inhibitory activity on human glioblastoma U251 cells in vitro ［J］. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，18（5）：24-26. ［謝江寧，宋素芬，李香，等，2012. 桑黃總?cè)频奶崛〖捌潴w外抗腦膠質(zhì)瘤U251活性 ［J］. 中國實驗方劑學(xué)雜志，18（5）：24-26.］
XIE XL，HU X，CHEN ZX，et al.，2023. Extraction technology，component analysis and biological activity of Alpiniae officinarum Rhizoma essential oil ［J］. Chinese Traditional and Herbal Drugs，54（18）：5904-5915. ［謝小麗，胡璇，陳振夏，等，2023. 高良姜精油提取工藝優(yōu)化、成分分析及其生物活性研究 ［J］. 中草藥，54（18）：5904-5915.］
XUE YW，2023. Extraction，identification，synthesis and functional analysis of key genes of pentacyclic triterpenes in loquat ［D］. Yangzhou：Yangzhou University：1-2. ［薛巖偉，2023. 枇杷五環(huán)三萜提取、鑒定及合成關(guān)鍵基因的挖掘與鑒定 ［D］. 揚州：揚州大學(xué)：1-2.］
YANG K，XU MT，WANG LY，et al.，2018. Ultrasonic-assisted extraction and in vitro activity evaluation of total triterpenoids from Antrodia camphorata ［J］. Journal of Nuclear Agricultural Sciences，32（1）：112-122. ［楊開，徐夢婷，王玏縈，等，2018. 牛樟芝總?cè)瞥曁崛〖绑w外活性研究 ［J］. 核農(nóng)學(xué)報，32（1）：112-122.］
ZHANG Y，KONG C，ZENG Y，et al.，2010. Ursolic acid induces PC-3 cell apoptosis via activation of JNK and inhibition of Akt pathways in vitro ［J］. Molecular Carcinogenesis，49（4）：374-385.
ZHOU J，LIN X，LIU S，et al.，2022.Effects of compound elicitors on the biosynthesis of triterpenoids and activity of defense enzymes from Inonotus hispidus （Basidiomycetes） ［J］. Molecules，27（9）：2618.
ZHANG LF，SUN TT，ZOU L，2015. Extraction of total triterpenoids from Inonotus baumii and its inhibitory activity on breast cancer cells （MCF-7） in vitro ［J］. Drug Evaluation Research，38（5）：497-502. ［張林芳，孫婷婷，鄒莉，2015. 鮑姆纖孔菌總?cè)频奶崛〖捌潴w外抗乳腺癌細胞MCF-7活性 ［J］. 藥物評價研究，38（5）：497-502.］
（責(zé)任編輯 周翠鳴）
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摘 要：為了優(yōu)化桑樹桑黃總?cè)频奶崛」に嚕兓側(cè)撇⒎治銎浠瘜W(xué)成分及其抗腫瘤和抗氧化活性。該研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化桑樹桑黃總?cè)频奶崛」に?，?jīng)D101型大孔樹脂和Sephadex LH-20層析聯(lián)用純化總?cè)疲Y(jié)合UHPLC-ESI-MS技術(shù)分析三萜成分，并通過CCK8法、DPPH法和ABTS法對其進行抗腫瘤和抗氧化活性測定。結(jié)果表明：（1）最佳提取工藝為提取時間55 min、提取溫度45 ℃、乙醇濃度75%、液料比35∶1（mL·g-1），此條件下總?cè)坪繛?0.34 mg·g-1。（2）純化后的Fraction a（Fa）組分純度為47.98%，提高了3.8倍；從Fa中檢測出8種三萜成分，即甘草次酸、黃柏酮、熊果酸、大戟醇、24，25-二氫羊毛甾醇、大豆皂苷B、羊毛甾醇、山楂酸。（3）200 μg·mL-1時Fa對腫瘤細胞PC3的抑制率為68.65%，高于5-氟尿嘧啶66.30%；Fa對DPPH自由基和ABTS自由基均有較高的清除能力，半數(shù)清除率分別為42.76 μg·mL-1和66.24 μg·mL-1。該研究為桑樹桑黃總?cè)频倪M一步研究和利用提供理論基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞：桑樹桑黃，三萜，響應(yīng)面優(yōu)化，純化，抗腫瘤，抗氧化
中圖分類號：Q946
文獻標識碼：A
文章編號：1000-3142（2025）02-0217-11
基金項目：河北省重點研發(fā)計劃項目（21327109D）； 河北省科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費制度試點項目（2024PF04）。
第一作者：劉坤（1976—），博士，副教授，主要從事真菌資源利用研究，（E-mail）liuqueen2003@163.com。
*通信作者：程華，碩士，研究員，主要從事中藥藥效成分提取與活性研究，（E-mail）13933137792@139.com。
Extraction，purification and biological activity of total triterpenes from Sanghuangporus sanghuang
LIU Kun1，2，F(xiàn)U Xinyao1，GUO Tong1，ZHANG Wanyue1，ZHAO Qingsheng3，KONG Zejuan4，CHENG Hua4*，SONG Heng5
（1. College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Economics and Business，Shijiazhuang 050061，China; 2. Department of Mathematics and Statistics，Hebei University of Economics and Business，Shijiazhuang 050061，China; 3. Institute of Process Engineering，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190，China; 4. Institute of Biology，Hebei Academy of Sciences，Shijiazhuang 050081，China; 5. Research Office of Sanghuangporus sanghuang，Peace Angel （Zhejiang） Traditional Chinese Medicine Slices Co.，Ltd.，Jiaxing 314000，Zhejiang，China）
Abstract：In order to optimize the extraction process of total triterpenes from Sanghuangporus sanghuang，to purify total triterpenes，and to analyze its chemical components，as well as its antitumor and antioxidant activities. The response surface method was used to optimize the extraction process of total triterpenes from S. sanghuang. D101 macroporous resin and Sephadex LH-20 chromatography were used to purify total triterpenes. Meanwhile UHPLC-ESI-MS technology was used to analyze the component of triterpenes. The antitumor and antioxidant activities of total triterpenes were studied by the methods of CCK8，DPPH and ABTS. The results were as follows：（1） The optimal conditions were extraction time 55 min，extraction temperature 45 ℃，ethanol concentration 75% and liquid-solid ratio of 35∶1 （mL·g-1）. Under these conditions，the total triterpenes content was 10.34 mg·g-1. （2） The purity of Fraction a （Fa） was increased by 3.8 times to 47.98%. Eight triterpene components were identified from Fa，those were glycyrrhetinic acid，obakunone，ursolic acid，euphol，24，25-dihydrolanosterol，soyasaponin B，lanosterol and maslinic acid. （3） The inhibition rate of Fa on PC3 was 68.65% at 200 μg·mL-1，which was higher than that of 5-fluorouracil （66.30%）. Fa exhibited high DPPH and ABTS free radical scavenging capacities，and scavenging rates with IC50 values of 42.76 μg·mL-1 and 66.24 μg·mL-1，respectively. This study provides a theoretical basis for further research and utilization of total triterpenes from S. sanghuang.
Key words：Sanghuangporus sanghuang，triterpene，response surface optimization，purification，antitumor，antioxidant
桑黃是我國一類名貴的傳統(tǒng)藥用真菌，具有抗腫瘤和抗氧化等多種生物活性，其中桑樹桑黃（Sanghuangporus sanghuang）屬于桑黃的一種，為多年生大型真菌，分布于我國暖溫帶和溫帶的部分省份，以及日本、韓國、緬甸等國家（吳聲華和戴玉成，2020）。桑樹桑黃中含有的活性物質(zhì)主要有多糖和三萜等（付立忠等，2021；范祺等，2022），其中三萜類化合物是一類具有抗腫瘤和抗氧化等生理活性的次級代謝產(chǎn)物（譚世強等，2012），在健康輔助食品、天然藥物等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
三萜類化合物的提取方法主要有微波輔助提取法、超聲輔助提取法、超高壓提取法和超臨界提取法（薛巖偉，2023）。其中，超臨界提取法環(huán)境污染小、提取穩(wěn)定性高，但其提取技術(shù)較難，能耗較高；超高壓提取法的提取效率高、時間短，能較好地保持提取物活性，但其設(shè)備占用空間大，不易在實驗室使用（薛巖偉，2023）。微波輔助提取法和超聲輔助提取法具有提取率高、耗時少且適合實驗室操作等優(yōu)點，經(jīng)文獻查閱桑黃三萜的提取采用超聲輔助提取法較多且其提取率較高。例如，梁佳等（2011）利用微波輔助提取法優(yōu)化了桑黃三萜提取工藝，但得率較低，僅為1.48 mg·g-1；謝江寧等（2012）利用超聲輔助提取法優(yōu)化了桑黃總?cè)铺崛」に嚕繛?.40 mg·g-1；何策等（2021）利用超聲輔助提取法優(yōu)化了桑樹桑黃總?cè)铺崛」に?，純度?2.32%±0.17%，但未對其進行進一步純化及成分鑒定。大孔樹脂因其具有機械強度高、耐酸堿性能好、使用壽命長等優(yōu)點，被廣泛用于天然產(chǎn)物的分離純化和富集且目前是純化三萜常用的材料（李雪峰等，2017）。三萜類物質(zhì)分子量大小接近，Sephadex LH-20是根據(jù)化合物的分子大小來進行分離，與其他純化方法聯(lián)用會提高三萜純化效率（陳亞軍等，2016）。樊梓鸞等（2019）聯(lián)合使用大孔吸附樹脂及Sephadex LH-20對紅豆越橘總?cè)七M行分離純化，其純度從5.13%提高至43.25%。因此，采用超聲輔助提取，大孔樹脂結(jié)合Sephadex LH-20分離純化可能可以有效提高桑黃三萜提取率及提高桑黃三萜純度。
桑黃中含有大量的三萜類化合物，并且已有關(guān)于桑黃三萜抗腫瘤及抗氧化活性的研究報道，如桑黃三萜對人結(jié)腸癌細胞HT-29和人前列腺癌細胞PC3有一定的抑制作用（Kim et al.，2020）。桑黃三萜具有抗氧化活性（Zhou et al.，2022），但桑樹桑黃研究起步較晚，是吳聲華（2012）發(fā)現(xiàn)的一個新種。目前，活性物質(zhì)研究多集中在多糖（Cheng et al.，2020）和黃酮多酚（Liu et al.，2017），關(guān)于桑樹桑黃總?cè)萍兓⒊煞址治黾捌淇鼓[瘤和抗氧化活性的研究還少有報道。
本課題組通過響應(yīng)面法優(yōu)化桑樹桑黃總?cè)频奶崛」に?、?jīng)大孔樹脂和Sephadex LH-20層析聯(lián)用純化總?cè)?，采用UHPLC-ESI-MS分析其主要三萜成分，并研究其體外抗腫瘤和抗氧化活性，旨在探討桑樹桑黃總?cè)频奶崛」に?、純化方法、成分分析及其抗腫瘤和抗氧化活性，為桑樹桑黃總?cè)频倪M一步研究和開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料和儀器
桑樹桑黃購自吉林省敦化市，經(jīng)河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)張香美教授鑒定；人結(jié)腸癌細胞HCT-116、人胃腺癌細胞SGC7901、人前列腺癌細胞PC3由河北省科學(xué)院生物研究所程華老師提供。
香草醛、5-氟尿嘧啶和齊墩果酸（上海麥克林生化有限公司）；D101和NKA-9型大孔樹脂（北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司）；AB-8、ADS-8和HPD-100A型大孔樹脂（天津浩聚樹脂科技有限公司）；Sephadex LH-20（上海源葉生物科技有限公司）；DPPH和ABTS試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；高糖DMEM培養(yǎng)基、DEM/F-12 1∶1培養(yǎng)基（Cytiva公司）；胰蛋白酶-EDTA 消化液、DMSO、CCK8試劑盒和細胞凍存液（北京索萊寶科技有限公司）。
BJ-1000A振動式藥物超微粉碎機（青島聚創(chuàng)環(huán)保集團有限公司）；FRQ-1010HT超聲清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；Alpha 2-4 LDplus冷凍干燥機（德國Christ公司）；Multiskan GO酶標儀、液相色譜儀-Vanquish、質(zhì)譜儀-Orbitrap Exploris 120（賽默飛世爾科技有限公司）；C170 CO2細胞培養(yǎng)箱（德國艾本德股份公司）。
1.2 實驗方法
1.2.1 桑樹桑黃總?cè)频奶崛?將桑樹桑黃子實體粉碎，60 ℃烘干至恒重后，過40目篩備用。準確稱取1 g的桑樹桑黃干粉于離心管中，一定條件下進行超聲輔助乙醇提?。?00 W），冷卻后過濾提取液，進一步減壓濃縮和冷凍干燥后得到桑樹桑黃總?cè)拼痔嵛铩?/p>
1.2.2 總?cè)坪亢图兌鹊挠嬎?按照李英迪等（2021）的三萜測定方法，即依次吸取0.2 mg·mL-1的齊墩果酸標準品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于20 mL比色管中，水浴蒸干溶劑，加入0.2 mL 5%的香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，振蕩均勻，75 ℃恒溫水浴18 min，取出后快速冷卻，加入乙酸乙酯定容至5 mL，552 nm處測定吸光度（A）。繪制齊墩果酸標準曲線，得線性回歸方程y=3.591 1x-0.016 3（R2 = 0.992 9）。稱取定量的總?cè)铺崛∥镉谠嚬苤?，根?jù)線性方程計算樣品中總?cè)频馁|(zhì)量，再根據(jù)下面公式計算桑樹桑黃總?cè)坪亢图兌取?/p>
1.2.3 單因素試驗 按照1.2.1的提取工藝進行單因素分析，分別考察提取溫度、提取時間、液料比、乙醇濃度4個因素對桑樹桑黃總?cè)坪康挠绊憽?/p>
1.2.4 響應(yīng)面實驗 根據(jù)單因素結(jié)果，選擇乙醇濃度（A）、液料比（B）和提取溫度（C）作為自變量，以總?cè)坪孔鳛轫憫?yīng)值，設(shè)計三因素三水平實驗對總?cè)频奶崛」に囘M行優(yōu)化，試驗因素與水平設(shè)計見表1。
1.2.5 總?cè)频姆蛛x純化
1.2.5.1大孔樹脂的篩選 根據(jù)吸附率和解析率公式對AB-8、ADS-8、HPD-100A、D101和NKA-9 5種大孔樹脂進行篩選，選用最佳的大孔樹脂進行純化。將pH值為 6的1.5 BV的上樣溶液（濃度為1.0 mg·mL-1）以2 mL·min-1流速上樣，吸附5 h后，依次用2 BV蒸餾水和5 BV 70%乙醇溶液以2 mL·min-1的速度洗脫，收集70%乙醇的洗脫液。
式中：C0和C1分別為吸附前后溶液中總?cè)频臐舛龋╩g·mL-1）。
式中：C0和C1分別為吸附前后溶液中總?cè)频臐舛龋╩g·mL-1）； C2為解吸附后溶液中總?cè)频臐舛龋╩g·mL-1）； V1和V2為樣品液和解吸液的體積（mL）。
1.2.5.2 Sephadex LH-20純化桑樹桑黃總?cè)?將上述初步純化的三萜粗提物減壓濃縮，冷凍干燥，取10 mg三萜粗提物溶于1 mL甲醇中，用濾膜過濾（0.22 μm），上樣，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱（10 mm × 600 mm）進一步純化，分別使用30%、60%甲醇各250 mL先后洗脫，流速為1 mL·min-1，每10 mL收集一管，每個梯度收集25管，收集完成后用高氯酸-冰醋酸顯色法（李英迪等，2021）做出洗脫曲線，合并洗脫峰。
1.2.6 總?cè)瞥煞值臋z測 將純化后的三萜粉末3 mg溶解到3 mL甲醇溶液中，渦旋振蕩1 min，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，即得檢測溶液。
液相條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLCHSS T3（2.1 mm × 150 mm，1.8 μm）。正離子模式，流動相為0.1%甲酸水（A）和0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫：0～1 min，2% B；1～9 min，2%→50% B；9～12 min，50%→98% B；12～13.5 min，98% B；13.5～14 min，98%→2% B；14～20 min，2% B。負離子模式，流動相為5 mmol·L-1甲酸銨水（A）和乙腈（B），洗脫梯度與正離子模式相同；流速為0.25 mL·min-1；柱溫為40 ℃；進樣體積為2 μL。
質(zhì)譜條件：Thermo Orbitrap Exploris 120質(zhì)譜檢測器（Thermo Fisher Scientific，USA），電噴霧離子源（ESI），正負離子模式。噴霧電壓為3.50 kV（+）和-2.50 kV（-）；檢測質(zhì)量掃描范圍為m/z 100～1 000；鞘氣和輔助氣的體積流量分別為30 arb和10 arb；毛細管溫度為325 ℃；MS分辨率為60 000，MS/MS分辨率為15 000。
根據(jù)精確分子量進行代謝物的鑒定（分子量誤差≤5×10-6），后續(xù)根據(jù)MS/MS碎片模式對mzClound（https：//www.mzcloud.org）以及標準品數(shù)據(jù)庫等對比推測并篩選出三萜代謝物。
1.2.7 桑樹桑黃總?cè)瓶鼓[瘤活性 參照Liu等（2017）的方法（CCK8法），研究桑樹桑黃總?cè)茖Π┘毎鸋CT-116、SGC7901和PC3增殖的抑制作用。將濃度為每毫升5×104個的對數(shù)生長期的癌細胞加入96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)箱中孵育24 h。將不同濃度樣品100 μL加入各孔中，培養(yǎng)24 h；吸出各孔培養(yǎng)基，加入含10% CCK8的PBS溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，檢測450 nm的吸光度（A）。根據(jù)以下公式計算樣品對各個細胞的抑制率，陽性對照為5-氟尿嘧啶。
細胞增殖抑制率%=A對照組-A實驗組A對照組-A空白組×100。
式中：A對照組為陽性對照的吸光度; A實驗組為實驗樣品的吸光度； A空白組為不加樣品的空白組吸光度。
1.2.8 桑樹桑黃總?cè)瓶寡趸钚詼y定
1.2.8.1 DPPH自由基清除率的測定 參照劉坤等（2018）的方法，將100 μL DPPH自由基溶液（60 μmol·L-1）與100 μL不同濃度的樣品溶液混合，室溫避光孵育30 min，517 nm處測定吸光度（A），VC作為陽性對照。對照組和處理組都重復(fù)3次。
清除率%=A對照組-A樣品A對照組×100。
式中：A對照組為對照的吸光度； A樣品為樣品反應(yīng)液（處理組）的吸光度。
1.2.8.2 ABTS自由基清除率的測定 參照劉坤等（2017）的方法。200 μL反應(yīng)體系中加入150 μL ABTS反應(yīng)液和50 μL不同濃度的樣品，用酶標儀測定734 nm的吸光度（A），VC為陽性對照。對照組和處理組都重復(fù)3次。自由基清除率的計算公式與DPPH法一致。
1.2.9 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)使用Prism 9軟件作圖，并使用SPSS 22.0和Design-Expert 13進行數(shù)據(jù)分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素結(jié)果
提取時間、乙醇濃度、提取溫度、液料比對總?cè)坪康挠绊懸妶D1。由圖1可知，四因素均出現(xiàn)了三萜提取量先升后降的趨勢。固定條件為乙醇濃度85%、提取溫度35 ℃、液料比25∶1（mL·g-1）時，提取時間55 min時，總?cè)坪孔罡撸▓D1：A）；固定條件為提取溫度35 ℃、液料比25∶1（mL·g-1）、提取時間55 min時，乙醇濃度為75%時，總?cè)坪孔罡撸▓D1：B）；固定條件為液料比25∶1（mL·g-1）、提取時間55 min、乙醇濃度75%時，提取溫度45 ℃時，總?cè)坪孔罡撸▓D1：C）；固定條件為提取時間55 min、乙醇濃度75%、提取溫度35 ℃時，液料比35∶1（mL·g-1）時，總?cè)坪孔罡撸▓D1：D）。綜合考慮，最終選擇提取時間55 min、乙醇濃度75%、提取溫度45 ℃和液料比35∶1（mL·g-1）為最佳單因素條件。
2.2 響應(yīng)面優(yōu)化及分析
由于單因素試驗中，提取時間、乙醇濃度、提取溫度和液料最佳條件總?cè)坪颗c相鄰條件的最大差值分別為0.46、0.64、1.26、1.65 mg·g-1，可見時間因素對三萜提取量影響相對較小，綜合考慮只對乙醇濃度（A）、液料比（B）和提取溫度（C）3個因素做了響應(yīng)面分析，響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。采用軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到方程Y=10.75-0.704 5A+0.318 9B+0.079 0C+0.460 9AB-0.198 0AC-0.711 2BC-1.58A2-0.941 1B2-1.25C2。由表3可知，所建立模型的P＜0.01，差異極顯著；失擬項P＝0.140 5，差異不顯著，表明模型可靠性較高，實驗誤差較小，可用于桑樹桑黃總?cè)铺崛×康念A(yù)測。其中，A和B達到極顯著水平且A對總?cè)铺崛×康挠绊懘笥贐；AB、BC交互作用對結(jié)果影響極顯著；二次項A2、B2、C2對結(jié)果影響均極顯著。
響應(yīng)面圖的傾斜程度越大說明響應(yīng)值對該因素變化越敏感，等高線圖則是越接近橢圓說明2因素交互作用對總?cè)铺崛×康挠绊懺斤@著（謝小麗等，2023）。通過圖2：A、C的響應(yīng)面圖可看出曲線有較大弧度，表明交互項AB和BC對桑樹桑黃總?cè)铺崛×坑酗@著的影響，這個結(jié)果與表3的結(jié)果一致。從圖2：a、c中的等高線圖可看出其為橢圓形，而圖2：b等高線接近圓形，說明除AC交互項外，其他因素之間的交互作用對桑樹桑黃總?cè)铺崛×坑绊戯@著，這與表3的結(jié)果也一致。
通過響應(yīng)面分析得到桑樹桑黃總?cè)频淖罴烟崛」に嚍橐毫媳?5.56∶1（mL·g-1），乙醇濃度72.93%，超聲溫度45.15 ℃，預(yù)測在該條件下總?cè)坪繛?0.84 mg·g-1?？紤]到實際操作的可行性，將試驗條件調(diào)整為液料比36∶1（mL·g-1）、乙醇濃度73%、 超聲溫度45 ℃。重復(fù)3次進行驗證，桑樹桑黃總?cè)频暮繛椋?0.34±0.23） mg·g-1，該值與理論值接近，即實際值與理論值之間的擬合度較好。
2.3 桑樹桑黃總?cè)频姆蛛x純化
由表4可知，HPD-100A和D101對桑樹桑黃總?cè)贫加胁诲e的吸附率，但D101對桑樹桑黃總?cè)频慕馕雎室獜娪贖PD-100A，因此選擇D101型樹脂用于桑樹桑黃總?cè)频募兓?/p>
大孔樹脂純化后的總?cè)铺崛∥锝?jīng)Sephadex LH-20柱層析分離后得到2個峰（圖3），合并兩個峰得到Fa（峰a）和Fb（峰b）?？紤]到Fb為60%甲醇收集，顏色較深、色素影響較大且三萜含量較低，因此選擇峰值較大的Fa進行進一步研究且其純度提高至47.98%。
2.4 桑樹桑黃總?cè)瞥煞址治?/p>
采用UHPLC-ESI-MS檢測Fa組分，并采用正、負離子兩種模式對其信號進行了識別。鑒定結(jié)果見表5，共檢測出8個三萜類化合物，分別為甘草次酸、黃柏酮、熊果酸、大戟醇、24，25-二氫羊毛甾醇、大豆皂苷B、羊毛甾醇、山楂酸。
2.5 抗腫瘤活性及抗氧化活性
Fa組分較桑樹桑黃總?cè)拼痔嵛飳δ[瘤細胞HCT-116、SGC7901和PC3的抑制作用都有所提高且與濃度呈正相關(guān)關(guān)系，其對腫瘤細胞PC3的抑制作用相對較好（圖4）。在濃度為200 μg·mL-1時，F(xiàn)a組分對HCT-116、SGC7901和PC3的抑制率分別為40.65%、20.65%和68.65%，其中對腫瘤細胞PC3的抑制率高于5-氟尿嘧啶的66.30%，但其半數(shù)抑制率（IC50=53.39 μg·mL-1）高于5-氟尿嘧啶（IC50=35.31 μg·mL-1）且差異顯著（P＜0.05）。
Fa組分較桑樹桑黃總?cè)拼痔嵛锏腄PPH自由基和ABTS自由基清除率都有所提高，并且與濃度呈正相關(guān)關(guān)系（圖5）。在濃度為200 μg·mL-1時，F(xiàn)a組分對DPPH自由基和ABTS自由基的清除率分別為89.10%和72.45%，半數(shù)清除率濃度分別為42.76 μg·mL-1和66.24 μg·mL-1，低于VC的半數(shù)清除率濃度9.94 μg·mL-1和19.16 μg·mL-1且差異顯著（P＜0.05）。
3 討論與結(jié)論
本實驗首先對桑樹桑黃總?cè)频奶崛∵M行了單因素分析，其中提取時間、乙醇濃度和液料比等均出現(xiàn)了先升后降的趨勢，這是由于提取時間可以增加溶劑與溶質(zhì)之間的傳質(zhì)和相互作用，但加熱時間過長會使三萜物質(zhì)的結(jié)構(gòu)遭到破壞（何策等，2021），因此出現(xiàn)了先升后降的趨勢；不同乙醇濃度對三萜類化合物的溶解度不同，濃度超過75%時一些非極性雜質(zhì)可能會過多溶出，反而出現(xiàn)下降趨勢（楊開等，2018）；當(dāng)液料比低于35∶1（mL·g-1）時，可能單位體積液體受到的超聲波作用功率變小，而使三萜提取量下降（楊開等，2018）。單因素結(jié)合響應(yīng)面分析后，確定最佳提取工藝為提取時間55 min、提取溫度45 ℃、乙醇濃度75%、液料比35∶1（mL·g-1），此工藝提取的桑樹桑黃總?cè)坪繛?0.34 mg·g-1，與理論值之間的擬合度較好，高于微波輔助提取的暴馬桑黃總?cè)坪浚?.81 mg·g-1）（張林芳等，2015）和超聲輔助法提取的桑黃總?cè)坪浚?.40 mg·g-1）（謝江寧等，2012），并且與齊欣等（2010）的研究結(jié)果桑樹桑黃總?cè)频暮勘绕渌｜S要高相一致。此外，桑樹桑黃總?cè)拼痔嵛锛兌葹?2.61%，與何策等（2021）報道的總?cè)拼痔嵛锛兌?2.32%較接近。說明桑樹桑黃的三萜含量相對穩(wěn)定且屬于三萜含量較高的一種桑黃。
經(jīng)D101型樹脂純化后，桑樹桑黃總?cè)萍兌葟?2.61%提高到21.53%，這與杜令娟等（2017）的報道較一致（經(jīng)D101型樹脂純化后，總?cè)萍兌葟?.20%提高至20.94%）。再經(jīng)Sephadex LH-20進一步純化后，得到的Fa組分純度提高至47.98%。以上表明大孔吸附樹脂結(jié)合Sephadex LH-20是一種有效的桑樹桑黃三萜純化方法。
經(jīng)UHPLC-ESI-MS檢測，從Fa組分測出8個三萜類化合物，即甘草次酸、黃柏酮、熊果酸、大戟醇、24，25-二羥基羊毛甾醇、大豆皂苷B、羊毛甾醇和山楂酸，說明Fa中含具有良好藥用價值的三萜單體成分。通過體外實驗，發(fā)現(xiàn)Fa對腫瘤細胞HCT-116、SGC7901和PC3的抑制作用都有所提高，其中對PC3的抑制作用最佳，IC50值為53.39 μg·mL-1。Fa組分對DPPH自由基和ABTS自由基均有較好的清除活性，半數(shù)清除率濃度分別為42.76 μg·mL-1和66.24 μg·mL-1。有研究表明三萜結(jié)構(gòu)中側(cè)鏈上與羧基共軛的雙鍵可能是活性基團，具有羧基的三萜化合物具有抗腫瘤活性，各物質(zhì)中羥基取代基的位置也關(guān)系到抗腫瘤活性的強弱（王華，2012；杜國華等，2017）。經(jīng)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，化合物1、3-8在C-3位置上均有羥基，化合物1、3、6和8在C-12處有雙鍵的存在，這些基團可能是重要的抗腫瘤活性位點，并且化合物3（Zhang et al.，2010）、化合物4（Grade et al.，2022）和化合物7（Fu et al.，2022）都能促進腫瘤細胞PC3的凋亡?；衔?（Chen et al.，2013）和化合物3（Ramachandran amp; Prasad，2008）也有DPPH自由基和ABTS自由基清除活性的報道，F(xiàn)a組分對DPPH自由基和ABTS自由基的清除活性可能與這些三萜化合物密切相關(guān)。綜上所述，F(xiàn)a具有一定的抗腫瘤和抗氧化活性的三萜類物質(zhì)，可作為一種安全的天然抗腫瘤和抗氧化劑。
值得注意的是桑樹桑黃在純化過程中損失率較高，分離純化手段有待進一步探討，并且鑒定出的三萜種類較少，今后需要改善三萜成分的鑒定手段。本研究對桑樹桑黃總?cè)频闹苽浞蛛x、成分鑒定及抗腫瘤和抗氧化活性提供了依據(jù)，也為三萜生物活性的深入研究和開發(fā)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
參考文獻：
CHEN S，ZOU L，LI L，et al.，2013. The protective effect of glycyrrhetinic acid on carbon tetrachloride-induced chronic liver fibrosis in mice via upregulation of Nrf2 ［J］. PLoS ONE，8（1）：e53662.
CHEN YJ，GAO Y，YANG CJ，et al.，2016. Application of dextran gel Sephadex LH-20 in separation and purification of natural products ［J］. Chemical Engineer，30（8）：53-55. ［陳亞軍，高巖，楊春娟，等，2016. 葡聚糖凝膠Sephadex LH-20在天然產(chǎn)物分離純化中的應(yīng)用 ［J］. 化學(xué)工程師，30（8）：53-55.］
CHENG J，SONG J，WEI H，et al.，2020. Structural characterization and hypoglycemic activity of an intracellular polysaccharide from Sanghuangporus sanghuang mycelia ［J］. International Journal of Biological Macromolecules，164（12）：3305-3314.
DU GH，WANG HX，YAN Z，et al.，2017. Anti-tumor target prediction and activity verification of Ganoderma lucidum triterpenoids ［J］. China Journal of Chinese Materia Medica，42（3）：517-522. ［杜國華，王宏旭，閆征，等，2017. 靈芝三萜化合物的抗腫瘤靶點預(yù)測與活性驗證 ［J］. 中國中藥雜志，42（3）：517-522.］
DU LJ，KANG N，LI DH，et al.，2017. Primary purification and in vitro hypolipidemic activity of triterpenoid from Inonotus hispidus ［J］. Forest Engineering，33（5）：29-34. ［杜令娟，康寧，李德海，等，2017. 粗毛纖孔菌三萜初級純化及體外降血脂研究 ［J］. 森林工程，33（5）：29-34.］
FAN Q，WU MY，ZHANG BH，et al.，2022. Main active components of Phellinus linteus and its domestic and international research progress ［J］. China Fruit amp; Vegetable，42（11）：50-55. ［范祺，吳茂玉，張博華，等，2022. 桑黃的主要活性成分及國內(nèi)外研究進展 ［J］. 中國果菜，42（11）：50-55.］
FAN ZL，ZHAO ZR，ZHAO X，et al.，2019. Purification of total triterpenoids from lingonberry and anti-inflammatory activity in vitro ［J］. Journal of Nanjing Forestry University （Natural Science Edition），43（4）：132-138. ［樊梓鸞，趙梓煣，趙翔，等，2019. 紅豆越橘總?cè)频募兓绑w外抗炎活性 ［J］. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），43（4）：132-138.］
FU LZ，LU N，YAN J，et al.，2021. Analyses and evaluation of nutrition，active component and antioxidant activities of fruiting bodies of three species of Sanghuangporus ［J］. Mycosystema，40（8）：2148-2158. ［付立忠，陸娜，閆靜，等，2021. 三種桑黃屬真菌人工栽培子實體營養(yǎng)、藥效成分及抗氧化活性分析評價 ［J］. 菌物學(xué)報，40（8）：2148-2158.］
FU YK，WANG BJ，TSENG JC，et al.，2022. Combination treatment of docetaxel with caffeic acid phenethyl ester suppresses the survival and the proliferation of docetaxel-resistant prostate cancer cells via induction of apoptosis and metabolism interference ［J］. Journal of Biomedical Science，29（1）：16.
GADE IS，CHADNEAU C，TAGNE SIMOR，et al.，2022. Euphol from Tapinanthus sp. induces apoptosis and affects signaling proteins in glioblastoma and prostate cancer cells ［J］. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention，23（12）：4205-4212.
HE C，WANG C，CHEN C，et al.，2021. Optimization of extraction technology of total triterpenoids from Inonotus sanghuang and their hypolipidemic and antioxidant activities ［J］. Science and Technology of Food Industry，42（7）：208-215. ［何策，王超，陳純，等，2021. 桑樹桑黃總?cè)铺崛」に噧?yōu)化及其降血脂、抗氧化活性研究 ［J］. 食品工業(yè)科技，42（7）：208-215.］
KIM J，YANG SC，HWANG AY，et al.，2020. Composition of triterpenoids in Inonotus obliquus and their anti-proliferative activity on cancer cell lines ［J］. Molecules，25（18）：2618.
LIU K，JIA YJ，LI HX，et al.，2017. Analysis of antioxidant activity and active components of Phellinus robustus ［J］. Chinese Pharmaceutical Journal，52（16）：1393-1396. ［劉坤，賈艷菊，李會宣，等，2017. 稀硬木層孔菌的抗氧化活性及其活性成分分析 ［J］. 中國藥學(xué)雜志，52（16）：1393-1396.］
LIU K，LIU MF，WANG JL，et al.，2018. Antioxidant，antibacterial and antitumor activities and chemical constituents of Geastrum fimbriatum ［J］. Guihaia，38（7）：953-959. ［劉坤，劉名飛，王俊麗，等，2018. 毛咀地星的抗氧化、抗菌和抗腫瘤活性和化學(xué)成分研究 ［J］. 廣西植物，38（7）：953-959.］
LIU K，XIAO X，WANG J，et al.，2017. Polyphenolic composition and antioxidant，antiproliferative，and antimicrobial activities of mushroom Inonotus sanghuang ［J］. LWT - Food Science and Technology，82（12）：154-161.
LI XF，F(xiàn)U ZR，ZHANG XX，et al.，2017. Adsorption characteristic of total triterpenes in Akebia trifoliata pericarp by macroporous resin ［J］. Natural Product Research and Development，29（12）：1999-2003. ［李雪峰，符智榮，張曉旭，等，2017. 大孔樹脂對八月瓜果皮總?cè)频奈教匦匝芯?［J］. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，29（12）：1999-2003.］
LI YD，CAO Y，XIA QL，et al.，2021. Optimization of extraction process of Hericium erinaceus triterpenes and its antioxidant activity ［J］. Science and Technology of Food Industry，42（22）：153-159. ［李英迪，曹艷，夏其樂，等，2021. 猴頭菇三萜提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性分析 ［J］. 食品工業(yè)科技，42（22）：153-159.］
LIANG J，SUN MY，ZHANG T，et al.，2011. Optimization of extracting triterpene from Phellinus igniarius by response surface methodology ［J］. Chinese Agricultural Science Bulletin，27 （10）：235-238. ［梁佳，孫夢伊，張騰，等，2011. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化桑黃菌絲體中三萜的微波提取工藝 ［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報，27（10）：235-238.］
QI X，ZHANG J，CHEN Y，et al.，2010. Comparative analysis of bioactive components in fruit bodies of Phellinus linteus growing on six species of trees ［J］. Food Science，31（6）：199-201. ［齊欣，張峻，陳穎，等，2010. 六種不同樹種桑黃有效成分的比較 ［J］. 食品科學(xué)，31（6）：199-201.］
RAMACHANDRAN S，PRASAD NR，2008. Effect of ursolic acid，a triterpenoid antioxidant，on ultraviolet-B radiation-induced cytotoxicity，lipid peroxidation and DNA damage in human lymphocytes ［J］. Chemico-biological Interactionst，176（2/3）：99-107.
TAN SQ，XIE JY，GUO S，et al.，2012. Research advances in physiological activities of triterpenoids ［J］. Chinese Agricultural Science Bulletin，28（36）：23-27. ［譚世強，謝敬宇，郭帥，等，2012. 三萜類物質(zhì)的生理活性研究概況 ［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報，28（36）：23-27.］
WANG H，2012. Investigation on the antioxidant activity and antitumor activity of triterpenoid in Pleurotus eryngii ［D］. Tianjin：Tianjin University：46-47. ［王華，2012. 杏鮑菇中三萜類化合物的抗氧化、抗腫瘤活性的研究 ［D］. 天津：天津大學(xué)：46-47.］
WU SH，2012. Rectification the name of the precious medicinal fungus “Sanghuang” ［J］. Edible and Medical Mushroom，20（3）：177-179. ［吳聲華，2012. 珍貴藥用菌“桑黃”物種正名 ［J］. 食藥用菌，20（3）：177-179.］
WU SH，DAI YC，2020. Species clarification of the medicinal fungus Sanghuang ［J］. Mycosystema，39（5）：781-794. ［吳聲華，戴玉成，2020. 藥用真菌桑黃的種類解析 ［J］. 菌物學(xué)報，39（5）：781-794.］
XIE JN，SONG SF，LI X，et al.，2012. Extraction of total triterpenoids from Phellinus igniarius and evaluation its inhibitory activity on human glioblastoma U251 cells in vitro ［J］. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，18（5）：24-26. ［謝江寧，宋素芬，李香，等，2012. 桑黃總?cè)频奶崛〖捌潴w外抗腦膠質(zhì)瘤U251活性 ［J］. 中國實驗方劑學(xué)雜志，18（5）：24-26.］
XIE XL，HU X，CHEN ZX，et al.，2023. Extraction technology，component analysis and biological activity of Alpiniae officinarum Rhizoma essential oil ［J］. Chinese Traditional and Herbal Drugs，54（18）：5904-5915. ［謝小麗，胡璇，陳振夏，等，2023. 高良姜精油提取工藝優(yōu)化、成分分析及其生物活性研究 ［J］. 中草藥，54（18）：5904-5915.］
XUE YW，2023. Extraction，identification，synthesis and functional analysis of key genes of pentacyclic triterpenes in loquat ［D］. Yangzhou：Yangzhou University：1-2. ［薛巖偉，2023. 枇杷五環(huán)三萜提取、鑒定及合成關(guān)鍵基因的挖掘與鑒定 ［D］. 揚州：揚州大學(xué)：1-2.］
YANG K，XU MT，WANG LY，et al.，2018. Ultrasonic-assisted extraction and in vitro activity evaluation of total triterpenoids from Antrodia camphorata ［J］. Journal of Nuclear Agricultural Sciences，32（1）：112-122. ［楊開，徐夢婷，王玏縈，等，2018. 牛樟芝總?cè)瞥曁崛〖绑w外活性研究 ［J］. 核農(nóng)學(xué)報，32（1）：112-122.］
ZHANG Y，KONG C，ZENG Y，et al.，2010. Ursolic acid induces PC-3 cell apoptosis via activation of JNK and inhibition of Akt pathways in vitro ［J］. Molecular Carcinogenesis，49（4）：374-385.
ZHOU J，LIN X，LIU S，et al.，2022.Effects of compound elicitors on the biosynthesis of triterpenoids and activity of defense enzymes from Inonotus hispidus （Basidiomycetes） ［J］. Molecules，27（9）：2618.
ZHANG LF，SUN TT，ZOU L，2015. Extraction of total triterpenoids from Inonotus baumii and its inhibitory activity on breast cancer cells （MCF-7） in vitro ［J］. Drug Evaluation Research，38（5）：497-502. ［張林芳，孫婷婷，鄒莉，2015. 鮑姆纖孔菌總?cè)频奶崛〖捌潴w外抗乳腺癌細胞MCF-7活性 ［J］. 藥物評價研究，38（5）：497-502.］
（責(zé)任編輯 周翠鳴）
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