大鼠孕/哺乳期暴露于雷公藤甲素對雄性子鼠生殖系統(tǒng)的影響

中圖分類號 R965；R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2025）05-0558-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.05.09

摘要 目的 探討雌性大鼠孕期及哺乳期暴露于雷公藤甲素（TP）對雄性子鼠生殖系統(tǒng)發(fā)育及功能的影響，為孕期和哺乳期的安全用藥提供參考。方法 將孕鼠隨機(jī)分為對照組（12 只，生理鹽水）和T1～T4 組[分別有12、13、14、17 只，給藥劑量分別為200、400、600、800 μg/（kg·d）]。每日灌胃相應(yīng)藥物/生理鹽水1 次，直至子鼠出生并斷乳，灌胃體積均為2 mL/只。哺乳喂養(yǎng)60 d 后，稱定雄性子鼠生殖系統(tǒng)臟器質(zhì)量，計(jì)算臟器系數(shù)，觀察其睪丸和附睪以及精子形態(tài)，測定其附睪組織中精子活力、精子數(shù)量以及血清中促性腺激素釋放激素（GnRH）、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、睪酮（T）水平和精子中糖原合酶激酶3α（GSK3α）、磷酸化GSK3α（p-GSK3α）、蛋白磷酸酶1γ2（PP1γ2）蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 與對照組比較，T1～T4 組子鼠的睪丸質(zhì)量、附睪質(zhì)量和血清中GnRH、T水平以及精子中PP1γ2 蛋白的相對表達(dá)量，T2～T4 組子鼠的精囊腺質(zhì)量、精囊腺系數(shù)、精子總數(shù)、精子濃度、精子活動力以及精子中GSKα、p-GSK3α蛋白的相對表達(dá)量，T3、T4 組子鼠的附睪系數(shù)，T4 組子鼠的睪丸系數(shù)、精子平均路徑速度、精子曲線速度均顯著降低或減小（P＜0.05）；T1～T4 組子鼠的畸形精子數(shù)、精子畸形率和血清中FSH、LH水平均顯著增多或升高（P＜0.05）；T1～T4 組子鼠的睪丸生精小管上皮細(xì)胞數(shù)量均減少，附睪組織內(nèi)可見上皮細(xì)胞變性壞死、間質(zhì)內(nèi)伴少量炎癥細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象。結(jié)論 雌性大鼠孕期及哺乳期暴露于TP可導(dǎo)致雄性子鼠生殖器官發(fā)育異常、精子生成減少、精子活性降低、雄激素合成減少，從而對子鼠生殖系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響；其機(jī)制可能與下調(diào)GSK3α、p-GSK3α和PP1γ2 蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 雷公藤甲素；孕期；哺乳期；雄性子鼠；生殖毒性

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，孕期和哺乳期的藥物安全性一直是臨床關(guān)注的重點(diǎn)。隨著藥物種類的增多和使用范圍的擴(kuò)展，藥物暴露對生殖系統(tǒng)及子代健康的潛在影響引起了廣泛關(guān)注。盡管許多藥物已完成針對孕期和哺乳期的毒理學(xué)評估，明確其對胎兒及新生兒的毒性作用，但仍有大量常用藥物缺乏充分的毒理學(xué)研究。已有證據(jù)表明，妊娠期使用某些藥物可能增加子代的出生缺陷及其他健康風(fēng)險(xiǎn)[1―2]。因此，評估孕期和哺乳期用藥對子代生長發(fā)育的影響具有重要臨床意義。

雷公藤甲素（triptolide，TP）是一種從雷公藤中提取的環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物，具有抗白血病、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗腫瘤等多重生物活性[3]，常被當(dāng)作免疫抑制劑用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病綜合征、強(qiáng)直性脊柱炎等自身免疫性疾病的治療[4]。此外，大量研究證明，TP還對多種惡性腫瘤（如白血病、乳腺癌、肺癌、胰腺癌等）具有良好的抗腫瘤活性[5―7]。但相關(guān)研究指出，TP對心臟、肝臟、腎臟等臟器以及生殖系統(tǒng)均有一定的毒性作用，尤其對雄性生殖系統(tǒng)影響較大[4，8―9]。目前關(guān)于TP 在母體孕期及哺乳期暴露對雄性子代生殖系統(tǒng)的發(fā)育是否有影響仍不明確，相關(guān)研究較為缺乏。因此，本研究旨在通過動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察雌性大鼠孕期及哺乳期暴露于TP 對雄性子鼠生殖系統(tǒng)的影響，為這一特殊時(shí)期的安全用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括SpectraMAX Plus384型酶標(biāo)儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]、HH-6 型恒溫水浴鍋（上海力辰邦西儀器科技有限公司）、UV752N型分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）、BA210Digital型數(shù)碼三目攝像顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）、JT-12S 型自動組織脫水機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）、H2050R型臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）、5200 Multi 型熒光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

TP原料藥（批號C14852118，純度98%）購自上海麥克林生化科技股份有限公司；血清促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（luteinizinghormone，LH）、睪酮（testosterone，T）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（ 批號分別為ZC-36486、ZC036477、ZC-36719、ZC-36635）均購自上海茁彩生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號P0009）購自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司；鼠源β-微管蛋白（β-tubulin）單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號分別為T0023、S0001）均購自江蘇親科生物研究中心有限公司；兔源糖原合酶激酶3α（glycogen synthase kinase 3α，GSK3α）單克隆抗體、兔源磷酸化GSK3α（p-GSK3α）單克隆抗體、HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗（批號分別為A19060、AP0582、AS003）均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；兔源蛋白磷酸酶1γ2（protein phosphatase1γ2，PP1γ2）單克隆抗體（批號ab134947）購自英國Abcam 公司；巴氏染色試劑盒（批號G1614）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF 級SD 大鼠，6 月齡，體重300～450 g，共100 只（雄性25 只、雌性75 只），購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物使用許可證號為SYXK（川）2021-246。購入后，所有大鼠均飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（23±3） ℃ ，相對濕度為（50±10）%，12 h 日/12 h 夜光照循環(huán)，通風(fēng)良好。實(shí)驗(yàn)期間大鼠均采用普通飼料喂養(yǎng)，自由攝食、飲水。本動物實(shí)驗(yàn)已通過蘭州大學(xué)第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會審批（受理編號為D2022-261）。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

將雌、雄大鼠分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，然后按照雌雄3∶1 的比例在每日22：00 合籠，次日若肉眼觀察到陰栓或雌性大鼠陰道涂片發(fā)現(xiàn)精子則視為受孕[10]，記為孕期的第0 天。受孕10 d 左右觀察大鼠腹部是否有明顯隆起，若沒有則視為假孕而剔除。經(jīng)檢查，共有68 只雌鼠成功受孕。采用隨機(jī)數(shù)字表法將孕鼠分為對照組（12只，灌胃生理鹽水）和T1～T4 組[分別有12、13、14、17只，給藥劑量分別為200、400、600、800 μg/（kg·d）][4，11]。各組大鼠每日灌胃給藥/生理鹽水1 次，直至子鼠出生并斷乳，平均給藥時(shí)間約為41 d，灌胃體積均為2 mL/只。實(shí)驗(yàn)期間，對照組孕鼠無死亡和流產(chǎn)；TP 各組孕鼠共死亡11 只、流產(chǎn)13 只，最終32 只完成妊娠。每組隨機(jī)選取3 只孕鼠進(jìn)行哺乳。子鼠出生后通過測量其肛門生殖器距離（anogenital distance，AGD）判斷雌雄——雄性AGD明顯更長，雌性更短[12]。將雌、雄子鼠分籠飼養(yǎng)。每組選取3 只雄性子鼠接受母乳喂養(yǎng)，母乳喂養(yǎng)期間母鼠仍然用TP 干預(yù)，斷乳后以普通飼料喂養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。自子鼠出生起共喂養(yǎng)60 d，并每日稱定其體重。

2.2 樣本取材及處理

喂養(yǎng)60 d 后，取雄性子鼠進(jìn)行腹主動脈采血，將血樣靜置1 h，然后以3 000 r/min 離心10 min，收集血清并置于－80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采血后?0 mg/kg 戊巴比妥鈉麻醉子鼠后處死，取睪丸、附睪、精囊腺并稱定質(zhì)量，然后將睪丸和附睪置于4% 多聚甲醛中固定24 h。

2.3 子鼠睪丸和附睪臟器系數(shù)計(jì)算

根據(jù)子鼠體重（處死前稱定）和生殖系統(tǒng)各臟器質(zhì)量計(jì)算臟器系數(shù)：臟器系數(shù)＝臟器質(zhì)量（g）/體重（g）×100%。

2.4 子鼠睪丸和附睪形態(tài)學(xué)觀察

采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察。將4% 多聚甲醛固定的睪丸和附睪依次進(jìn)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋及切片（厚度3 μm）處理，隨后進(jìn)行HE染色和中性樹脂封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組雄性子鼠睪丸和附睪的形態(tài)與結(jié)構(gòu)。

2.5 子鼠附睪組織中精子形態(tài)觀察

采用巴氏染色法觀察。取雄性子鼠的左側(cè)附睪，剪斷球狀部位，將斷面涂于滴有生理鹽水的潔凈玻片上，拉薄涂片，置于室溫下空氣干燥后按照試劑盒說明書方法操作，在巴氏染色、封片后鏡檢。每個切片隨機(jī)選取3個不同視野進(jìn)行觀察，每只子鼠共觀察200 個精子，計(jì)算各組子鼠的精子畸形率。精子畸形率＝畸形精子數(shù)/精子總數(shù)×100%。

2.6 子鼠附睪組織中精子活力測定

取雄性子鼠的右側(cè)附睪，用針刺破，置于37 ℃生理鹽水中浸泡10 min，使精子游出。將精子懸浮液在磷酸鹽緩沖液（PBS）中洗滌2 次，然后在4 ℃下以1 000 r/min離心10 min，收集精子沉淀并重懸于含有1% 苯甲基磺酰氟的80 mL RIPA緩沖液中，超聲處理（超聲功率200W，間斷超聲3 次，每次10 s、間隔10 s）。隨后，將精子懸浮液在4 ℃下以12 000 r/min 離心10 min，棄上清。取精子沉淀，加入RIPA 裂解液[精子沉淀與裂解液配比為1∶10（m/m）]，于碎冰上裂解10 min；收集裂解液，在4 ℃下以12 000 r/min 離心10 min，收集上清液。取20 μL上清液涂于載玻片上，蓋上蓋玻片，用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)檢測精子活力。精子活力參數(shù)包括精子濃度、精子前向運(yùn)動率（progressive motility rate，PR）、精子非前向運(yùn)動率（non-progressive motility rate，NP）、精子活動力（用PR+NP 表示）、精子平均路徑速度（average pathvelocity，VAP）、精子直線速度（straight-line velocity，VSL）、精子曲線速度（curvilinear velocity，VCL）。剩余上清液置于－80 ℃冰箱中保存，用于Western blot實(shí)驗(yàn)。

2.7 子鼠附睪組織中精子數(shù)量測定

取“2.6”項(xiàng)下精子懸浮液0.1 mL，加PBS 稀釋10 倍后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)懸浮液中的精子數(shù)。精子總數(shù)以單側(cè)附睪組織中懸浮液精子數(shù)×10（稀釋倍數(shù)）表示[13]。

2.8 子鼠血清中性激素水平測定

采用ELISA 法檢測。將子鼠血清從－80 ℃冰箱中取出，室溫下解凍，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定血清中GnRH、LH、FSH、T水平，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.9 子鼠精子中GSK3α、p-GSK3α、PP1γ2 蛋白表達(dá)測定

采用Western blot 法測定。取“2.6”項(xiàng)下－80 ℃保存的精子上清液適量，采用BCA 法檢測上清液中總蛋白濃度，并通過高溫（95 ℃、15 min）裂解變性。取變性蛋白進(jìn)行電泳（先在80 V電壓下電泳約25 min，然后在120 V電壓下電泳約1.5 h）分離、轉(zhuǎn)膜（恒流200 mA下轉(zhuǎn)膜1～2 h），然后用5% 脫脂牛奶常溫下封閉2 h；加入β-tubulin、GSK3α、p-GSK3α、PP1γ2 一抗（稀釋比例分別為1∶50 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶2 000），4 ℃搖床孵育過夜；洗膜3 次，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例1∶5 000），室溫下孵育2 h；洗膜后采用ECL法染色，然后將膜放入凝膠圖像分析儀中曝光成像。采用Image J 圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-tubulin）條帶的灰度值比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 9.5 軟件作圖，采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，均以x±s 表示。多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)組間兩兩比較采用Dunnett檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 TP對雄性子鼠生殖器官質(zhì)量及臟器系數(shù)的影響

與對照組比較，T1～T4 組子鼠的睪丸質(zhì)量、附睪質(zhì)量，T2～T4 組子鼠的精囊腺質(zhì)量、精囊腺系數(shù)，T3、T4 組子鼠的附睪系數(shù)及T4 組子鼠的睪丸系數(shù)均顯著降低或減?。≒＜0.05）。結(jié)果見表1。

3.2 TP對雄性子鼠睪丸、附睪組織形態(tài)學(xué)的影響

與對照組比較，T1～T4 組子鼠的睪丸生精小管上皮細(xì)胞數(shù)量均減少，且隨著TP 暴露劑量的增大上述病理變化越明顯；T1～T4 組子鼠的附睪組織內(nèi)可見上皮細(xì)胞變性壞死、細(xì)胞質(zhì)溶解、精子不同程度壞死、精子數(shù)量減少、間質(zhì)內(nèi)伴少量炎癥細(xì)胞浸潤，且隨著TP暴露劑量的增大上述病理改變有加重趨勢。結(jié)果見圖1、圖2。

3.3 TP對雄性子鼠精子形態(tài)的影響

T1～T4 組子鼠均出現(xiàn)精子形態(tài)異常的情況，主要表現(xiàn)為折疊、無鉤、香蕉型、無定型、胖頭、雙頭和雙尾。對照組和T1～T4 組子鼠的畸形精子數(shù)分別為3、21、31、44、60 個，精子畸形率分別為（0.50±0.00）%、（3.50±1.32）% 、（5.17±0.29）% 、（7.33±0.76）% 、（10.00±2.00）%；與對照組比較，T1～T4 組子鼠畸形精子數(shù)和精子畸形率均顯著升高（P＜0.05），且具有一定的劑量依賴性趨勢。結(jié)果見圖3。

3.4 TP對雄性子鼠精子數(shù)量和活力的影響

與對照組比較，T2～T4 組子鼠的精子總數(shù)、精子濃度、精子活動力以及T4 組子鼠的VAP、VCL均顯著減少或降低（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

3.5 TP對雄性子鼠性激素水平的影響

與對照組比較，T1～T4 組子鼠血清中GnRH、T 水平均顯著降低（P＜0.05），LH、FSH水平均顯著升高（P＜0.05），且具有一定的劑量依賴性趨勢。結(jié)果見表3。

3.6 TP對雄性子鼠精子中GSKα、p-GSK3α、PP1γ2 蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，T2～T4 組子鼠精子中GSKα、p-GSK3α蛋白的相對表達(dá)量以及T1～T4 組子鼠精子中PP1γ2 蛋白的相對表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖4、表4。

4 討論

本研究通過動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ吞接懥舜菩源笫笤衅诩安溉槠诒┞队赥P對雄性子鼠生殖健康的影響。結(jié)果顯示，TP 暴露后會導(dǎo)致雄性子鼠生殖器官質(zhì)量減輕、臟器系數(shù)降低、睪丸和附睪組織形態(tài)學(xué)異常，提示TP可能對雄性子鼠的生殖細(xì)胞產(chǎn)生損傷；此外，TP 暴露還顯著影響了雄性子鼠的精子質(zhì)量，包括導(dǎo)致精子形態(tài)異常、畸形率升高、活力下降。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)可知，這可能與TP破壞了睪丸間質(zhì)細(xì)胞活性并誘導(dǎo)其發(fā)生了凋亡等有關(guān)[14―15]。本研究結(jié)果還顯示，雌性大鼠孕期200 μg/（kg·d）的TP 暴露量對雄性子鼠生殖器官形態(tài)學(xué)的影響較輕，而600、800 μg/（kg·d）的TP暴露量的影響較大。

在雄性子鼠生殖系統(tǒng)發(fā)育過程中，下丘腦-垂體-性腺軸（hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPG）發(fā)揮了關(guān)鍵作用。下丘腦通過分泌GnRH刺激垂體釋放LH和FSH，進(jìn)而作用于性腺，調(diào)節(jié)睪酮分泌和精子生成。本研究發(fā)現(xiàn)，雌性大鼠孕期及哺乳期暴露于TP 可引起雄性子鼠血清中T 水平降低，LH、FSH 水平升高，而LH、FSH 水平升高又可抑制下丘腦分泌GnRH，且這一效應(yīng)具有一定的劑量依賴性趨勢。這提示TP可能通過干擾HPG功能，影響性激素的合成和分泌。此外，TP對精子功能相關(guān)蛋白也產(chǎn)生了重要影響。GSK3α與p-GSK3α在精子成熟及活動中起著至關(guān)重要的作用[16]；PP1γ2 則廣泛存在于哺乳動物睪丸和精子中，是精子生成和雄性生育能力維持不可或缺的物質(zhì)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，雌性大鼠孕期及哺乳期暴露于TP 可引起雄性子鼠精子中GSK3α、p-GSK3α和PP1γ2 蛋白表達(dá)下調(diào)。這表明TP可能通過抑制精子功能相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致精子活力下降和生殖功能受損。

綜上所述，雌性大鼠孕期及哺乳期暴露于TP 可導(dǎo)致雄性子鼠生殖器官發(fā)育異常、精子生成減少、精子活性降低、雄激素合成減少，從而對子鼠生殖系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響；其機(jī)制可能與下調(diào)GSK3α、p-GSK3α 和PP1γ2 蛋白表達(dá)有關(guān)。但本研究僅基于動物模型展開，未測定孕鼠乳汁、胎盤中TP 含量以及雄性子鼠體內(nèi)的TP 血藥濃度，且樣本量相對較小，后續(xù)還需開展更多實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)本研究結(jié)論。

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（收稿日期：2024-10-30 修回日期：2025-02-17）

（編輯：林靜）

基金項(xiàng)目甘肅省自然科學(xué)基金（青年科技基金）項(xiàng)目（No.22JR-5RA1015）；蘭州大學(xué)學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)行動計(jì)劃立項(xiàng)（No.20240050002）