油茶bHLH基因家族鑒定與響應(yīng)干旱脅迫的基因表達分析

摘 要：【目的】探究油茶bHLH基因家族成員及其應(yīng)對干旱脅迫的表達調(diào)控模式?！痉椒ā炕谟筒枞蚪M數(shù)據(jù)，鑒定CobHLHs基因成員，分析其系統(tǒng)發(fā)育進化關(guān)系，研究其在油茶染色體上的分布、順式作用元件預測、家族成員間共線性分析，探究CobHLHs基因的組織表達特異性及其在干旱脅迫、ABA處理下的表達模式。【結(jié)果】共鑒定出127個CobHLHs。根據(jù)其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，將其分為17個亞族。共線性分析結(jié)果顯示，全基因組范圍內(nèi)共發(fā)生了22次片段復制事件。干旱脅迫下葉組織轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，共有106個CobHLHs參與油茶干旱脅迫響應(yīng)過程。組織特異表達分析發(fā)現(xiàn)，參與干旱脅迫的CobHLHs主要在葉中高表達，在根中表達相對較低。PEG模擬干旱脅迫和同源基因功能預測證實，9個CobHLHs的表達均在不同程度上受干旱脅迫誘導，不同基因表達調(diào)控模式存在差異，CobHLH071在干旱脅迫下為低表達，表現(xiàn)為12、48 h分別為對照的0.07和0.24倍；CobHLH006、CobHLH082在干旱脅迫下高表達，CobHLH006在12、48 h為對照的8.2、54.1倍，而CobHLH082在48 h才出現(xiàn)顯著高表達。進一步進行ABA處理研究其可能的表達調(diào)控模式發(fā)現(xiàn)，CobHLH071可能通過ABA依賴負調(diào)控干旱脅迫應(yīng)答。CobHLH006、CobHLH082可能通過影響ABA信號通路相關(guān)基因的表達，正調(diào)控油茶干旱脅迫應(yīng)答，但兩者的響應(yīng)時間存在差異，前者可能同時存在非ABA依賴調(diào)控模式。【結(jié)論】大部分CobHLHs基因在干旱脅迫下參與響應(yīng)，其中CobHLH071、CobHLH082在干旱脅迫下和ABA處理下均出現(xiàn)響應(yīng)，且兩者響應(yīng)方式不同，研究進一步表明CobHLH可能通過不同方式參與ABA信號途徑響應(yīng)干旱脅迫。

關(guān)鍵詞：油茶；bHLH基因家族；表達分析；干旱脅迫

中圖分類號：S722.5 文獻標志碼：A 文章編號：1673-923X（2025）01-0168-13

基金項目：江西省自然科學基金面上項目（20232BAB205054）；江西省林業(yè)局油茶研究專項項目（YCYJZX{2023}114號）；江西省研究生創(chuàng)新專項資金項目（YC2023-S354）。

Identification of bHLH gene family in Camellia oleifera and analysis of its expression under drought stress

XIE Huiqing， SU Wenjuan， ZHAO Nahong， CHENG Qinhua， ZHU Hongyang， FAN Haoqi ， HU Dongnan， LIU Juan

（a. Jiangxi Provincial Key Laboratory of Subtropical Forest Resources Cultivation； b. College of Forestry， Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045， Jiangxi， China）

Abstract：【Objective】This study aimed to explore the bHLH gene family members of Camellia oleifera and their expression and regulation mode in response to drought stress.【Method】This research based on complete genomic data from C. oleifera to identify CobHLH family members， investigate their evolutionary connections， map their positions on chromosomes， forecast their cis-regulatory elements， and assess the conservation of gene order among family members. Additionally， the study aimed to delineate the tissue-specific expression profiles of CobHLHs and to examine their expression dynamics in response to drought stress and ABA treatment.【Result】 A total of 127 CobHLH gene were identified in the study. They were classified into 17 distinct subfamilies based on their evolutionary relationships. The collinearity analysis revealed 22 segmental duplication events spanning the entire genome. When examining the leaf tissue’s transcriptome under drought conditions， it was found that 106 CobHLHs played a role in drought stress response. Furthermore，the tissue-specific expression analysis indicated that those CobHLHs implicated in drought stress response were predominantly highly expressed in leaves and comparatively less so in roots. Using PEG to simulate drought stress， along with predictions of homologous gene functions， demonstrated that the expression levels of 9 CobHLH genes were modulated by drought to varying extents， highlighting disparities in their regulatory mechanisms. Specifically， CobHLH071 exhibited reduced expression under drought conditions， with levels 0.07 and 0.24 times that of the control at 12 and 48 hours post-stress， respectively. In contrast， CobHLH006 and 082 displayed robust expression under drought stress. CobHLH006 showed a significant upregulation， being 8.2 and 54.1 times the control levels at 12 and 48 hours after the onset of drought stress. CobHLH082 also showed a marked increase in expression， particularly at the 48-hour mark following drought stress. Further investigation into the potential regulatory mechanisms of CobHLH071 under ABA treatment suggested that this gene may act as a negative regulator in the response to drought stress， potentially through an ABA-dependent pathway. On the other hand， CobHLH006 and CobHLH082 were likely to act as positive regulators in the drought stress response of C. oleifera， potentially by modulating the expression of genes involved in the ABA signaling pathway. However， it appeared that the temporal dynamics of their response might differ； CobHLH006 may also possess an ABA-independent regulatory mechanism， indicating a complex interplay between these transcription factors in the plant’s stress response network.【Conclusion】The majority of CobHLH genes were implicated in the response to drought stress， with CobHLH042 and CobHLH071 being notable for their responses to both drought stress and ABA treatment， albeit with distinct response profiles. Further research suggested that CobHLHs likely engaged in the ABA signaling pathway as part of the plant’s drought stress response， employing diverse mechanisms in the process.

Keywords： Camellia oleifera； bHLH gene family； expression analysis； drought stress

油茶Camellia oleifera為山茶科Theaceae山茶屬Camellia植物，是我國特有的木本食用油料植物。茶油不飽和脂肪酸含量達80%以上，是一種優(yōu)質(zhì)的食用油，且富含油酸、角鯊烯、茶多酚、植物甾醇等功能性成分，具有較高的營養(yǎng)保健價值。在我國耕地面積不斷減少、食用油自給率嚴重不足的情況下，利用丘陵山地，加快發(fā)展油茶等木本油料樹種，對保障我國糧油安全、優(yōu)化食用油結(jié)構(gòu)、推進生態(tài)建設(shè)、促進鄉(xiāng)村振興等方面具有重要的戰(zhàn)略意義[1]。截至2023年11月，全國新增油茶種植面積127.8萬hm2?！都涌煊筒璁a(chǎn)業(yè)發(fā)展三年行動方案》指出，2025年底，我國油茶面積將達到600萬hm2以上，茶油產(chǎn)能達到200萬t。油茶根系發(fā)達，耐干旱，其主要栽培區(qū)域為長江中下游地區(qū)的丘陵地帶[2]，雨水相對豐沛，但是隨著全球氣候的變暖，極端天氣日益頻發(fā)。近年來該地區(qū)夏秋持續(xù)伏旱高溫，嚴重影響了油茶集約化生產(chǎn)及其經(jīng)濟效益[3]。大量研究也證實，輕度干旱導致油茶光合速率和蒸騰速率下降，嚴重干旱將導致油茶落花落果，油脂轉(zhuǎn)化率降低，甚至植株死亡，最終造成油茶林大面積減產(chǎn)，茶油品質(zhì)下降，極大地阻礙了油茶產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展[4-8]。目前油茶響應(yīng)干旱脅迫相關(guān)研究主要關(guān)注形態(tài)指標和生理指標，對其應(yīng)對干旱的分子響應(yīng)機制研究相對有限，特別是對轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機制關(guān)注較少。

堿性螺旋-環(huán)-螺旋（Basic Helix-LoopHelix，bHLH）基因家族編碼真核生物的第二大轉(zhuǎn)錄因子家族。該家族成員包含兩個保守基序，分別為一個基本的堿性區(qū)域和一個螺旋-環(huán)-螺旋（HLH）區(qū)[9]。其中堿性區(qū)域與下游基因啟動子結(jié)合，調(diào)控下游基因表達，而HLH結(jié)構(gòu)依賴疏水氨基酸的互作，促進bHLH蛋白形成二聚體。在植物中，該蛋白常以二聚體形式參與分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在植物的生長發(fā)育、生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用[10-11]。大量研究表明，bHLH轉(zhuǎn)錄因子作為關(guān)鍵調(diào)控因子，參與植物響應(yīng)干旱脅迫過程。例如，Zhou等[12]發(fā)現(xiàn)，過表達灰藜bHLH001顯著提高了轉(zhuǎn)基因煙草在干旱脅迫下DREB1、ERD、P5CS等與抗旱相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄積累量。Dong等[13]發(fā)現(xiàn)，胡楊bHLH035基因的過表達，可通過調(diào)節(jié)葉片氣孔、影響光合作用等方式提高胡楊的抗旱能力。此外，眾多研究發(fā)現(xiàn)，bHLH轉(zhuǎn)錄因子可通過影響脫落酸ABA激素信號途徑來調(diào)節(jié)植物代謝，進而調(diào)控干旱脅迫響應(yīng)。例如，郭敏[14]發(fā)現(xiàn)大豆bHLH120基因通過ABA依賴的氣孔關(guān)閉，負調(diào)控植物干旱脅迫應(yīng)答。Wang等[15]發(fā)現(xiàn)過表達的葡萄bHLH001，可通過增加ABA信號通路累積，增加轉(zhuǎn)基因擬南芥黃酮類化合物，從而來增強葡萄對干旱脅迫的耐受能力。目前，油茶bHLH基因家族尚未開展相關(guān)研究，不清楚其參與油茶干旱脅迫響應(yīng)的應(yīng)答和可能的調(diào)控機制。

本研究以油茶全基因組數(shù)據(jù)為參考，與擬南芥bHLH蛋白序列進行比對，結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域分析，篩選并鑒定CobHLH家族成員，進一步分析其系統(tǒng)發(fā)育進化關(guān)系，研究其在油茶染色體上的分布、順式作用元件預測、家族成員間共線性分析等；并基于已發(fā)表的油茶轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，進行CobHLH成員參與干旱脅迫的表達模式分析，采用qRTPCR分析不同CobHLHs基因表達的組織特異性及其在干旱脅迫和ABA處理表達模式差異，以期為后續(xù)油茶CobHLH基因家族功能解析、耐旱基因挖掘和油茶耐旱遺傳改良提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 植物選材

材料選取于江西農(nóng)業(yè)大學科技園油茶種質(zhì)資源庫，取新生根系、嫩枝、新葉、幼果、種仁。干旱脅迫試驗選取相對耐旱的油茶品種‘長林53’[16]，以2年生油茶幼苗為研究對象，采用水培法將油茶苗根部浸在30%聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG 6000）溶液中，在對照及其PEG處理12、36、48 h后分別收集幼葉[17]。ABA處理采用葉面噴施法，在油茶葉面噴灑濃度100 μmol·L-1的ABA溶液，在對照及其ABA處理12、24、36、48 h后分別收集幼葉。以上樣品均置于液氮中速凍，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 油茶bHLH基因家族成員鑒定

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載二倍體油茶全基因組序列文件（GI： GCA_022316695.1），從擬南芥全基因組數(shù)據(jù)庫下載擬南芥bHLH蛋白序列。以bHLH結(jié)構(gòu)域（PF00010）為查詢序列，Hidden Markov Model（HMM）配置文件，blast比對，對油茶全基因組數(shù)據(jù)進行檢索，參數(shù)設(shè)置e-value為1e-10，獲得潛在的油茶bHLH基因家族成員[18]，用NCBI的Batch CD-search（www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ bwrpsb/bwrpsb.cgi）進行蛋白結(jié)構(gòu)域的預測，去除無bHLH結(jié)構(gòu)域的候選序列，最終得到候選的油茶bHLH基因。

1.3 油茶bHLH蛋白系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

以擬南芥bHLH蛋白作為參考序列，利用MEGA11.0軟件，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（參數(shù)選擇默認值），并參照擬南芥bHLH蛋白分類將油茶bHLH蛋白進行基因家族亞家族分族。將進化樹上傳至iTOL（https：//itol.embl.de/），對進化樹進行美化注釋。

1.4 油茶bHLH啟動子區(qū)域的順式作用元件預測

基于油茶全基因組比對，獲得了CobHLHs啟動子區(qū)域上游2 000 bp序列。使用PlantCARE在線數(shù)據(jù)庫（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）對順式作用元件進行搜索、分析和鑒定。

1.5 染色體定位分析與共線性分析

根據(jù)油茶全基因組的注釋文件（GFF3），使用mapchart（Version 7.0），確定CobHLHs的染色體分布。利用MCScanX對基因的復制事件進行分析，使用默認參數(shù)，并經(jīng)Circos軟件進行可視化[19-20]。

1.6 油茶bHLH基因在干旱脅迫下的表達分析

為探究CobHLHs參與油茶干旱脅迫的響應(yīng)過程，從NCBI-SRA（National Center for Biotechnology Information Short Read Archive）數(shù)據(jù)庫（www.ncbi. nlm.nih.gov.sra）下載（SRP094080）油茶干旱脅迫下葉轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)[21]。該數(shù)據(jù)是通過對油茶耐干旱品種‘岑軟3號’與不耐旱品種‘桂無4號’進行干旱脅迫處理，分別在處理后0、12、24、36 h采集葉片，分析不同品種干旱轉(zhuǎn)錄表達模式差異。利用Galaxy（https：//usegalaxy.org/）生成油茶bHLH基因表達數(shù)據(jù)，依據(jù)基因表達的TPM（transcripts per kilobase million）值，利用Tbtools（v1.120）繪制基因表達熱圖。

1.7 熒光定量PCR（qPCR）分析

根據(jù)CobHLHs在干旱脅迫下葉組織轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果，篩選耐旱型品種中高表達而干旱敏感性品種中低表達的基因，同時參照前人對擬南芥bHLHs響應(yīng)干旱脅迫的研究結(jié)果[22]，選擇與AtbHLH在干旱脅迫下響應(yīng)的同源CobHLHs，并篩選預測具備干旱順式元件的基因，最后選定9個CobHLHs進行qRT-PCR表達分析。利用在線軟件Primer3Plus（www.primer3plus.com/）設(shè)計引物（表1），選用CoEF1a1作為內(nèi)參基因[23]。采用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的總RNA提取試劑盒，提取油茶不同組織的總RNA，經(jīng)純化后獲得mRNA，使用HiScript Ⅲ All-in-one RT SuperMix Perfect for Qpcr（Vazyme Code： R333-01）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。熒光定量反應(yīng)體系（20 μL）：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme Code： Q711-02）10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 7.2 μL。熒光定量反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個樣品設(shè)置3個生物學重復。利用2-ΔΔT方法計算基因相對表達量，利用SPSS 25.0軟件對不同組織、干旱脅迫和ABA處理在不同時間下的CobHLHs相對表達量進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶bHLHs系統(tǒng)進化樹分析

通過與擬南芥bHLHs同源比較，本研究共鑒定出127個含有bHLH保守結(jié)構(gòu)域的序列，命名為CobHLH001～CobHLH127。根據(jù)bHLH保守結(jié)構(gòu)域，運用MEGA11.0對油茶bHLH（CobHLHs）和擬南芥bHLH（AtbHLHs）家族蛋白進行比對，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[24]。系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果分析（圖1）顯示，兩個物種的bHLH轉(zhuǎn)錄因子可劃分成19個亞族，其中127個CobHLHs聚類在17個亞家族上，在第ⅩⅨ亞族上無擬南芥bHLH家族成員，在第Ⅳ和Ⅵ亞族上無油茶bHLH家族成員。在進化樹其他亞家族上均有油茶和擬南芥bHLH分布，第Ⅰ亞家族中油茶bHLH成員最多，包含18個CobHLHs，而在Ⅻ亞家族只有一個CobHLH。根據(jù)系統(tǒng)進化樹的結(jié)果以及各亞族中AtbHLH蛋白的功能，可以初步判斷油茶bHLH蛋白的功能。

2.2 油茶bHLHs啟動子區(qū)域的順式作用元件預測

順式作用元件是基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性控制基因表達所必需的。本研究使用PlantCARE，利用5′上游啟動子2 000 bp區(qū)域預測順式作用元件。研究發(fā)現(xiàn)，CobHLHs基因存在一系列有關(guān)于激素、植物生長發(fā)育、位點結(jié)合、啟動子、生物與非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件（圖2）。例如，與激素相關(guān)的順式作用元件包括脫落酸響應(yīng)（ABRE）、與啟動子構(gòu)成相關(guān)的順式作用元件（TATA-box）、與干旱響應(yīng)調(diào)控相關(guān)的順式作用元件MBS（與干旱誘導相關(guān)的MYB結(jié)合位點）、STRE（應(yīng)激響應(yīng)的順式作用元件）等廣泛存在于啟動子區(qū)域。其中，有44個CobHLHs啟動子區(qū)域存在MBS順式作用元件，107個CobHLHs啟動子區(qū)域存在STRE順式作用元件[25]。

2.3 油茶bHLHs家族染色體定位及共線性分析

染色體定位分析顯示，油茶bHLH基因在油茶的15條染色體上均有分布（圖3），但分布不均勻，存在異質(zhì)性。其中6號染色體上分布最少，只有4個CobHLH基因；12號染色體上分布最多，有18個CobHLH基因。3條染色體（第2、3、5號染色體）上均有6個CobHLH基因分布，有3條染色體（第8、14、15號染色體）上均有5個CobHLH基因分布；在1、4、7、9、10、11、13號染色體上分別包含12、8、14、9、12、7、10條CobHLH基因。

共線性分析結(jié)果表明，CobHLH家族基因在全基因組范圍內(nèi)存在22對共線性對。一般來說，位于同一染色體上，在200 kb以內(nèi)的兩個或者兩個以上的基因被認為起源于同一基因簇。CobHLHs基因重復分析共檢測到8個串聯(lián)重復基因，產(chǎn)生了4個基因簇（CobHLH062與CobHLH076、CobHLH021與CobHLH105、CobHLH013與CobHLH040、CobHLH017與CobHLH027）。這些基因分別分布于第3、4、8、13號染色體上。此外，CobHLH轉(zhuǎn)錄因子家族在進化過程發(fā)生了22個片段重復事件，包括CobHLH011與CobHLH001、CobHLH009與CobHLH122、CobHLH117與CobHLH110、CobHLH126與CobHLH127、CobHLH090與CobHLH043、CobHLH107與CobHLH089、CobHLH118與CobHLH014、CobHLH035與CobHLH068、CobHLH045與CobHLH010、CobHLH098與CobHLH099、CobHLH113與CobHLH004、CobHLH005與CobHLH034、CobHLH039與CobHLH080、CobHLH028與CobHLH100、CobHLH019與CobHLH032、CobHLH087與CobHLH091、CobHLH072與CobHLH037、CobHLH014與CobHLH048、CobHLH048與CobHLH077、CobHLH091與CobHLH096、CobHLH052與CobHLH066、CobHLH030與CobHLH080。

2.4 油茶bHLHs基因在干旱脅迫下的表達分析

基于已公開的油茶干旱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（PRJNA355046/），本研究比較了耐旱與不耐旱油茶品種在干旱處理0、12、24、36 h下的CobHLHs相對表達量。結(jié)果表明，干旱脅迫誘導了106個CobHLHs差異表達（圖4）。其中，部分CobHLHs在耐旱品種（‘岑軟3號’）和不耐旱品種（‘桂無4號’）中表現(xiàn)出顯著的表達差異。例如，CobHLH042在耐旱品種干旱脅迫24 h后為顯著高表達，在不耐旱品種中全程低表達；CobHLH068在耐旱品種干旱脅迫36 h后為顯著高表達，在不耐旱品種中低表達；CobHLH023在不耐旱品種中低表達，在耐旱品種遭受干旱脅迫12 h時顯著高表達。通過對這些基因啟動子區(qū)域的順式作用元件預測發(fā)現(xiàn)，均存在參與干旱響應(yīng)調(diào)控的順式作用元件，如CobHLH023、CobHLH042、CobHLH068存在STRE（應(yīng)激響應(yīng)順式作用元件）。

2.5 油茶bHLH基因在不同組織內(nèi)和干旱脅迫、ABA處理下葉組織的表達分析基于干旱轉(zhuǎn)錄組表達量、順式作用元件分析結(jié)果，本研究選取了干旱脅迫下存在差異表達、具有應(yīng)激響應(yīng)順式作用元件的9個CobHLHs，分別為CobHLH006、CobHLH035、CobHLH040、CobHLH042、CobHLH068、CobHLH071、 CobHLH082、CobHLH109和CobHLH127?；跓晒舛縋CR，本研究分析了這些CobHLHs在油茶根、莖、葉、幼果和種仁等組織中的表達特異性。結(jié)果（圖5）表明，CobHLHs的表達量在油茶不同組織內(nèi)存在顯著差異，且在葉內(nèi)均呈現(xiàn)高表達。例如，CobHLH109在葉中的表達量是根的13.9倍，是莖的25.1倍，是幼果的20.8倍，是種仁的113.6倍。此外，CobHLH006和CobHLH042在莖、幼果或種仁內(nèi)表達量較高。前者在莖中的表達量是根的1.4倍，在種仁中的表達量是根的2.0倍；后者在莖中的表達量是根的2.1倍，在幼果中的表達量是根的14.1倍。

本研究進一步驗證CobHLHs在PEG模擬干旱脅迫下不同時間段（12、36、48 h）的瞬時表達水平差異，探討CobHLHs參與油茶干旱脅迫響應(yīng)的調(diào)控機制。研究結(jié)果（圖6）表明，干旱脅迫下，與對照相比，9個CobHLHs在不同時間段的表達均存在顯著差異，但是不同基因的表達模式存在差異。例如，CobHLH042、CobHLH068、CobHLH109和CobHLH127的表達量在3個時間段均顯著高于對照，其中CobHLH042的表達量在12、36、48 h分別是對照的39.4、4.9、38.2倍，CobHLH109的表達量分別是對照的4.3、4.4、119.0倍。而CobHLH082的表達為緩慢上升趨勢，在干旱處理12、24 h下，與對照無顯著差別，但在48 h后為對照的2.5倍。CobHLH035的表達水平則表現(xiàn)為先上升后下降，在12、36 h分別為對照的2.9、8.1倍，在48 h為對照的0.5倍。而CobHLH071的表達水平在處理期間顯著低于對照，其中在12、48 h分別為對照的0.07倍和0.24倍。由此說明，CobHLHs可能通過多種調(diào)控方式參與油茶干旱脅迫響應(yīng)。

進一步研究ABA處理下CobHLHs的表達水平差異，探討CobHLHs參與ABA激素途徑的可能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究結(jié)果（圖7）顯示，在ABA處理下，CobHLHs的表達與對照相比均存在顯著差異，且不同基因的表達模式不同。例如CobHLH035、CobHLH071、CobHLH082、CobHLH127表達水平在不同處理階段均顯著高于對照，表達量呈現(xiàn)顯著上調(diào)趨勢。其中CobHLH035的表達量在12、24、36、48 h分別是對照的26.0、39.5、51.0、6.1倍； CobHLH071的表達水平分別為對照的67.8、14.9、207.7、271.6倍。而部分基因的表達量在ABA處理一段時間后呈現(xiàn)下降趨勢。例如，CobHLH006、CobHLH040在ABA處理后12、24 h出現(xiàn)顯著上調(diào)，而在ABA處理48 h后，兩者的表達量開始下降，分別為對照的0.35倍和0.10倍。

3 討 論

油茶耐干旱瘠薄，經(jīng)濟價值高，生態(tài)效益好，是南方山地或丘陵地區(qū)主要的油料經(jīng)濟樹種。發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)也是推動山區(qū)鄉(xiāng)村振興、提高林農(nóng)增收致富和維護生態(tài)文明安全的重要途徑。然而，長江中下游地區(qū)夏秋伏旱嚴重影響了油茶集約化生產(chǎn)，導致油茶產(chǎn)量減產(chǎn)，品質(zhì)下降。干旱脅迫已成為油茶產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的一個主要障礙。因此，發(fā)掘油茶耐旱基因并解析其耐旱機制對油茶耐旱型品種改良具有重要意義。bHLH基因家族作為轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物應(yīng)對非生物脅迫過程中具有重要調(diào)控作用。

本研究從二倍體油茶基因組中共鑒定出127個CobHLH基因家族成員。系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果分析顯示，CobHLHs可劃分為17個亞族。絕大多數(shù)分支上均包含有油茶與擬南芥bHLH家族成員分布，表明其具有同源性，而部分亞族表現(xiàn)為物種特有。例如，XIX亞族上未出現(xiàn)擬南芥bHLH家族成員，Ⅳ和Ⅵ亞族上未包含油茶bHLH家族成員。已有研究表明，bHLH基因家族分布的物種特有性在其他植物研究中有類似的結(jié)論。例如，徐秀榮等[26]發(fā)現(xiàn)毛竹bHLH基因在5個亞類（G、H、J、O和T亞類）中沒有分布，推測在毛竹bHLH進化過程中發(fā)生了基因丟失。染色體分布和共線性分析表明，CobHLHs在進化過程中共發(fā)生了22次片段重復事件，8個基因曾發(fā)生過串聯(lián)重復，而串聯(lián)復制的基序與保守區(qū)域相似，表明部分油茶bHLHs來自染色體區(qū)域或整個染色體的重復，可能在CobHLHs家族擴增過程中發(fā)揮重要作用。Dong等[27]發(fā)現(xiàn)中國白梨58.9%的bHLH基因為復制而來，且主要來源于全基因組片段的重復，Ka/Ks分析發(fā)現(xiàn)PrbHLHs在長期進化過程中可能經(jīng)歷了正選擇，以適應(yīng)復雜的環(huán)境變化。推測在歷史進化過程中油茶經(jīng)過了不同環(huán)境的變化，為適應(yīng)所處環(huán)境帶來的脅迫，CobHLHs通過基因組片段復制增加其家族成員來應(yīng)對不利條件對植株的影響。

大量研究表明，位于同一系統(tǒng)發(fā)育分支上的同源蛋白被認為具有相同或相似的生物學功能。根據(jù)bHLH蛋白結(jié)構(gòu)域的保守性，可用經(jīng)驗證過的擬南芥或其他植物bHLH的功能推斷與其同源的油茶bHLH蛋白的功能及其可能的調(diào)控機制[28]。例如，系統(tǒng)發(fā)育進化樹中位于第X族的AtbHLH004、AtbHLH005、AtbHLH006、AtbHLH017基因在植物應(yīng)對非生物脅迫中具有重要作用[29-31]。其中，AtbHLH017正調(diào)控擬南芥干旱、鹽等非生物脅迫響應(yīng)[32]。本研究中，同亞族的CobHLH109在耐旱品種干旱脅迫36 h后顯著高表達，q-PCR結(jié)果也證實，該基因在干旱處理下持續(xù)呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達的趨勢。由此推測，該基因可能作為正調(diào)控因子，在油茶響應(yīng)干旱脅迫中具有重要作用。第Ⅷ族的AtbHLH122，研究證實可通過抑制CYP707A3 mRNA水平，在干旱、鹽和滲透等信號中起到正調(diào)控作用[33]。本研究中，同源的CobHLH082在轉(zhuǎn)錄組分析和q-PCR分析中均證實，干旱脅迫下表達量呈現(xiàn)緩慢上升趨勢，后者在干旱處理48 h后，表達量是對照的2.5倍，推測CobHLH082可以通過抑制下游mRNA的表達，正調(diào)控油茶干旱。第Ⅸ族的AtbHLH018被證實可通過氣孔關(guān)閉方式，負調(diào)控參與擬南芥的干旱脅迫響應(yīng)[14]。本研究中，Ⅸ族分支的CobHLH071在干旱脅迫12 h后顯著低表達，是對照的0.07倍，推測該基因通過影響植株氣孔導度，從而負調(diào)控油茶干旱脅迫。在干旱脅迫環(huán)境下，過表達Ⅶ族的AtbHLH106植株能通過減少氣孔開度來減少水分的蒸騰，同時能通過結(jié)合G-box和E-box順式作用元件來抑制下游基因表達，提高植株的干旱耐受性[34]。而同族的CobHLH068（Ⅶ族）分別在耐旱品種干旱脅迫24、36 h后高表達，同時在q-PCR結(jié)果分析中發(fā)現(xiàn)該基因在干旱脅迫36、48 h后出現(xiàn)高表達，進一步推測CobHLH068通過結(jié)合順式作用元件來影響下游基因表達，參與油茶干旱脅迫調(diào)控。此外，本研究對組織表達特異性分析發(fā)現(xiàn)，參與油茶干旱脅迫響應(yīng)的CobHLHs在葉片中顯著高表達，這與已有研究中干旱脅迫響應(yīng)的bHLH家族成員常通過減少葉片氣孔開度、減少蒸騰作用來參與干旱脅迫響應(yīng)的結(jié)果高度吻合。

植物遭受干旱脅迫時，常通過調(diào)控細胞內(nèi)激素含量作出響應(yīng)，從而形成一系列調(diào)控反應(yīng)來應(yīng)對干旱脅迫[36]。大量研究證實，bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與ABA介導的植物干旱脅迫應(yīng)答。但不同的bHLH基因參與ABA應(yīng)答途徑不同，調(diào)控機制可能存在差異。例如，大豆gmbHLH120（Ⅸ族）突變體對PEG敏感性降低，離體葉片失水速率相對正常植株減慢，氣孔孔徑比減小，過表達株系表明通過ABA依賴的氣孔關(guān)閉，負調(diào)控植物干旱脅迫響應(yīng)[14]。本研究中，位于Ⅸ族CobHLH071的表達受到干旱脅迫和ABA處理的誘導，前者表現(xiàn)為顯著低表達，后者為顯著高表達。推測該基因可能通過ABA依賴途徑負調(diào)控響應(yīng)干旱脅迫。此外，Liang等[36]發(fā)現(xiàn)番茄SlbHLH96的表達受到干旱脅迫和ABA處理的誘導，過表達株系可通過增強抗氧化酶相關(guān)基因、ABA信號通路基因的表達，提高植株的抗旱能力，而沉默突變體則降低植株的耐旱性，進一步分析發(fā)現(xiàn)該基因可以通過結(jié)合ABA降解基因SlCYP707A2的啟動子來抑制其表達。SlbHLH96基因與AtbHLH130同源，均來源于bHLH基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹的Ⅷ族。在本研究中，位于同族的CobHLH082在干旱脅迫48 h后表現(xiàn)為顯著高表達，而ABA處理下的葉組織內(nèi)4個時間段均呈現(xiàn)顯著高表達。位于同族的CobHLH006在干旱脅迫12、48 h后顯著高于對照，ABA處理下12、24、36 h顯著高于對照。推測，CobHLH006、CobHLH082可能通過影響ABA信號通路相關(guān)基因的表達，正調(diào)控參與ABA依賴的油茶干旱脅迫應(yīng)答，且在應(yīng)答機制上存在相似特點，如兩者在ABA處理后均表現(xiàn)為迅速高表達，而在干旱脅迫的應(yīng)答時間上存在差異，前者為迅速應(yīng)答，后者在脅迫48 h才出現(xiàn)高表達。CobHLH006可能同時存在通過非ABA依賴途徑直接參與干旱脅迫響應(yīng)。導致這種差異的原因可能是由于油茶bHLH基因家族成員在長期進化過程中出現(xiàn)了功能上的分化，以應(yīng)對生長發(fā)育過程中復雜的環(huán)境脅迫。

此外，本研究缺少對油茶bHLH蛋白網(wǎng)絡(luò)互作、生物學功能進行深入研究，尚不清楚油茶bHLH轉(zhuǎn)錄因子對干旱脅迫的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，后續(xù)可通過基因克隆、遺傳轉(zhuǎn)化等試驗進一步驗證其功能，探索CobHLHs基因參與油茶抗旱分子網(wǎng)絡(luò)。

4 結(jié) 論

基于油茶全基因組數(shù)據(jù)庫，共鑒定出127個CobHLHs基因，并將其劃分為17個亞族，發(fā)現(xiàn)在物種進化過程中常發(fā)生基因丟失，片段復制為CobHLH基因復制的主要形式。干旱脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和qPCR結(jié)果均證實，CobHLHs參與了油茶響應(yīng)干旱脅迫調(diào)控，如CobHLH042、CobHLH109在干旱脅迫12、36、48 h的表達量均顯著高于對照的表達量；研究進一步表明CobHLH可能通過參與ABA信號途徑響應(yīng)干旱脅迫。本研究的結(jié)果為進一步深入探討CobHLHs的功能和油茶耐旱機制研究提供理論基礎(chǔ)。

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[本文編校：謝榮秀]