基于ITS片段和cpDNA片段的具鱗水柏枝譜系地理學(xué)分析

摘 要：【目的】研究具鱗水柏枝的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和譜系地理分布格局，為具鱗水柏枝品種改良、種質(zhì)資源保護(hù)和合理利用奠定理論基礎(chǔ)?！痉椒ā坷肐TS序列和葉綠體DNA片段（基因rps16和基因間隔區(qū)petA-psbJ、psbE-petL）對(duì)具鱗水柏枝54個(gè)居群共278個(gè)個(gè)體進(jìn)行譜系地理學(xué)研究，分析其遺傳多樣性?！窘Y(jié)果】基于cpDNA聯(lián)合片段和ITS片段分別發(fā)現(xiàn)具鱗水柏枝的41個(gè)單倍型和33個(gè)基因型，遺傳多樣性較高，總遺傳多樣性遠(yuǎn)高于居群內(nèi)遺傳多樣性。變異主要發(fā)生于居群間（ITS，54.75%；cpDNA，60.53%），具有較高的遺傳分化程度（ITS：FST=0.547 45，P<0.001。cpDNA：FST=0.605 25，P<0.001）和中等的基因流（ITS：Nm=0.410。cpDNA：Nm=0.326）。存在較為顯著的譜系地理結(jié)構(gòu)（ITS：NST=0.624>GST=0.438，P<0.05。cpDNA：NST=0.458>GST=0.424，P<0.05）。Mantel檢驗(yàn)顯示，其遺傳距離與地理距離呈顯著正相關(guān)（ITS：r=0.341，P=0.001。cpDNA：r=0.209，P=0.001），說(shuō)明地理隔離是其遺傳分化的重要因素。【結(jié)論】具鱗水柏枝群體整體發(fā)展平穩(wěn)，近期未經(jīng)歷較明顯的擴(kuò)張或收縮，處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，推測(cè)巴顏喀拉山西南部和阿尼瑪卿山南部為其主要冰期避難所。生態(tài)位模擬結(jié)果顯示，自末次間冰期以來(lái)其適生區(qū)范圍無(wú)較大程度變化，一定程度驗(yàn)證了群體歷史動(dòng)態(tài)分析結(jié)果。

關(guān)鍵詞：具鱗水柏枝；譜系地理學(xué)；ITS序列；cpDNA；遺傳多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)：S718.46 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-923X（2025）01-0152-16

基金項(xiàng)目：青海省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（2023-ZJ-749）。

Phylogeographic analysis of Myricaria squamosa Desv. based on ITS fragments and cpDNA fragments

WANG Mingjin1， LIU Haoyu1， YUAN Weibo1， YU Liming1， ZUO Wenming1， LIU Likuan1，2， LI Jinping1，2

（1. College of Life Science， Qinghai Normal University， Xining 810008， Qinghai， China； 2. Institute of Plateau Science and Sustainable Development， Xining 810008， Qinghai， China）

Abstract：【Objective】To study the genetic diversity， genetic structure and phylogeographic distribution pattern of M. squamosa， and to lay a foundation for the improvement of M. squamosa， the protection and rational utilization of germplasm resources.【Method】The ITS sequence and chloroplast DNA fragments （ gene rps16 and intergenic spacers petA-psbJ， psbE-petL） were used to study phylogeography and genetic diversity of 278 accessions from 54 populations of M. squamosa.【Result】Based on cpDNA fragments and ITS fragment， 41 haplotypes and 33 genotypes were discovered， respectively. The genetic diversity was high， and the total genetic diversity among the group was much higher than the genetic diversity within the group. The molecular variation mainly came from the inter-populations （ITS： 54.75%； cpDNA： 60.53%）， with significant genetic differentiation （ITS： FST=0.547 45， P<0.001； cpDNA： FST=0.605 25， P<0.001） and moderate gene flow （ITS： Nm=0.410； cpDNA： Nm=0.326）. There was a significant phylogeographic structure （ITS： NST=0.624>GST=0.438， P<0.05； cpDNA： NST=0.458>GST=0.424， P<0.05）. Mantel test showed that there was a significant positive correlation between genetic distance and geographical distance （ITS： r=0.341， P=0.001； cpDNA： r=0.209， P=0.001）， indicating that geographical isolation is an important factor in its genetic differentiation.【Conclusion】The overall phylogenetic structure of M. squamosa population is stable， and it has not experienced obvious expansion or contraction recently， which is in a dynamic equilibrium state. Our data suggests that the southwestern part of Bayan Har mountains and the southern part of Animaqing mountains may be the main glacial shelters during phylogenetic development of the species. The niche simulation results show that there has been no significant change in the range of suitable areas since the last interglacial period， which verifies the results of group historical dynamic analysis to a certain extent.

Keywords： Myricaria squamosa； phylogeography； ITS sequence ；cpDNA； genetic diversity

譜系地理學(xué)（Phylogeography）又名系統(tǒng)發(fā)育生物地理學(xué)，由Avise等[1]于20世紀(jì)80年代首次提出這一概念，是一門(mén)結(jié)合了生態(tài)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、分子遺傳學(xué)、地理學(xué)、古生物學(xué)等探討物種分布格局及演化歷史的綜合學(xué)科[2]。譜系地理學(xué)在時(shí)間和空間的尺度上推斷物種內(nèi)及物種間地理分布格局的形成過(guò)程和演化歷史[3]，是溝通群體遺傳（微觀進(jìn)化）和物種形成（宏觀進(jìn)化）的重要橋梁[4]。譜系地理學(xué)的研究不僅可以揭示生態(tài)環(huán)境的變化過(guò)程對(duì)物種分布范圍和居群動(dòng)態(tài)歷史的影響，而且對(duì)于人們根據(jù)物種地理分布格局演化特征，制定相應(yīng)的生物多樣性保護(hù)策略也具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[5]。

具鱗水柏枝Myricaria squamosa灌叢增生迅速，根系發(fā)達(dá)，抗寒、耐瘠薄，是河灘沙地造林和堤岸水土保持的優(yōu)良樹(shù)種[6]。包括具鱗水柏枝在內(nèi)的多種水柏枝屬植物具有悠久的藥用歷史，歷代藏醫(yī)藥典籍中均有記載。通常以干燥嫩枝入藥，臨床可用于治療麻疹不透、咽喉腫痛、中毒癥、黃水病、血熱病、瘟病時(shí)疫、臟腑毒熱等[7]。具鱗水柏枝具有重要的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)及藥用價(jià)值，其研究與應(yīng)用前景十分廣闊。同時(shí)，具鱗水柏枝所處的生境條件特異性較高，不同產(chǎn)地具鱗水柏枝所處生境的生態(tài)因子造就了其有效成分含量的差異，也影響其藥理活性。具鱗水柏枝的遺傳及分布格局深刻反映了地質(zhì)及氣候變遷，目前對(duì)具鱗水柏枝的分子遺傳學(xué)相關(guān)研究較少，屬內(nèi)和屬間的相關(guān)分類(lèi)仍存在爭(zhēng)議，具鱗水柏枝的遺傳特征及演化歷史亟待深入研究。

本研究利用雙親遺傳的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS片段和僅母系遺傳的葉綠體DNA片段對(duì)具鱗水柏枝進(jìn)行譜系地理學(xué)研究，綜合分析其遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)、居群遺傳分化等，探討具鱗水柏枝群體遺傳特征與地理格局間的相關(guān)性。最后，利用最大熵模型，探究具鱗水柏枝分布與氣候環(huán)境因子間的相關(guān)性，推測(cè)第四紀(jì)冰期以來(lái)具鱗水柏枝的分布變遷格局。綜合探討具鱗水柏枝群體動(dòng)態(tài)歷史及可能的冰期避難所，為第四紀(jì)冰期等重大地質(zhì)事件對(duì)青藏高原地區(qū)植物遺傳多樣性及分布格局的影響提供理論依據(jù)，亦為具鱗水柏枝的可持續(xù)利用和開(kāi)發(fā)、野生植物資源保護(hù)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2022年夏及2023年夏，對(duì)青海省大部及四川省西北部地區(qū)進(jìn)行具鱗水柏枝野外分布調(diào)查和樣品采集。采樣時(shí)確保居群兩兩之間相距20 km以上，居群內(nèi)個(gè)體間相距20 m以上。選取長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)病蟲(chóng)害的具鱗水柏枝嫩葉，采集后置于信封中放入變色硅膠盒保持干燥，樣品帶回后置于陰涼干燥處保存。本研究共采集到具鱗水柏枝54個(gè)居群共計(jì)278個(gè)個(gè)體（圖1）。

1.2 DNA提取與PCR擴(kuò)增

具鱗水柏枝干燥葉片充分研磨后，利用天根植物DNA提取試劑盒DP305提取其總DNA，具體操作流程參照試劑盒所附說(shuō)明書(shū)。利用微量核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)所提取總DNA的濃度和純度，純度較高的DNA其OD260與OD280的比值應(yīng)為1.7～1.9；并配置1%濃度瓊脂糖凝膠，2 μL擴(kuò)增后的DNA樣品與2 μL 6×Loading buffer混合后上樣，在120 V電壓下進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

選擇擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶清晰、變異位點(diǎn)較多的3條cpDNA片段（基因rps16和基因間隔區(qū)petApsbJ、psbE-petL）和1條ITS片段，片段引物信息見(jiàn)表1。利用具鱗水柏枝54個(gè)居群278個(gè)個(gè)體的總DNA對(duì)所選4個(gè)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25 μL：DNA模板1.5 μL，正向/反向引物0.5 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 10 μL。擴(kuò)增程序：預(yù)變性 94 ℃，4 min；變性94 ℃，30 s；退火：59 ℃（rps16）、62.4 ℃（petA-psbJ）、57.5 ℃（psbE-petL）、58.8 ℃（ITS），30 s；延伸72 ℃，1 min；循環(huán)31次；再延伸72 ℃，5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物取2 μL用于1%濃度瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)檢驗(yàn)質(zhì)量和濃度合格的擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 序列拼接與比對(duì)

利用DNASTAR中的SeqMan軟件對(duì)每條片段正反向測(cè)序得到的.ab1格式文件進(jìn)行拼接，根據(jù)峰形圖檢查每個(gè)位點(diǎn)的可靠性，并進(jìn)行人工編輯和校正。將所有樣本的同一片段拼接完成后，使用ClustalX2程序進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)完成后手動(dòng)調(diào)整序列首尾部分。最后將3條cpDNA片段合并，進(jìn)行聯(lián)合分析。

1.3.2 遺傳多樣性和單倍型分布分析

對(duì)具鱗水柏枝54個(gè)居群278個(gè)個(gè)體的cpDNA聯(lián)合片段和ITS序列核苷酸多態(tài)性進(jìn)行綜合分析，采用DnaSP 5.10軟件[8]統(tǒng)計(jì)居群?jiǎn)伪缎蛿?shù)目及變異位點(diǎn)，運(yùn)用ARLEQUIN 3.5軟件[9]計(jì)算具鱗水柏枝每個(gè)居群的單倍型多樣性（haplotype diversity，HD）、核苷酸多態(tài)性（nucleotide diversity）等遺傳多樣性指數(shù)及單倍型組成和頻率，利用ArcGIS10.2軟件制作單倍型地理分布圖。

1.3.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

分別用數(shù)字1、2、3、4替代變異位點(diǎn)堿基A、G、T、C，缺失位點(diǎn)用6表示，制作單倍型分布及變異位點(diǎn)矩陣，利用PERMUT 2.0軟件[10]計(jì)算具鱗水柏枝居群的總遺傳多樣性（total genetic diversity for species，HT）、居群內(nèi)平均遺傳多樣性（mean heterozygosity within populations，HS）以及遺傳分化系數(shù)（coefficient of gene differentiation，GST和NST），permutations設(shè)置為10 000次，若NST顯著大于GST，表明居群間存在明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)，即遺傳距離相近的單倍型分布于相同或相近的居群中，居群間遺傳分化程度的增大往往伴隨著地理距離的增加；若GST顯著大于NST，表明居群間不存在明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)。運(yùn)用ARLEQUIN 3.5軟件中的分子變異（AMOVA）分析方法檢測(cè)具鱗水柏枝的遺傳變異水平及分化系數(shù)（FST），檢測(cè)居群間和居群內(nèi)的遺傳變異分布情況。依據(jù)公式（1）計(jì)算物種水平上居群間的平均基因流（Nm）[11]。

利用MEGA 11中的Kimura 2-parameter遺傳距離模型計(jì)算各居群之間的遺傳距離，生成各居群之間遺傳距離三角矩陣；利用GenAlEx 6.51插件[12]，根據(jù)采樣點(diǎn)經(jīng)緯度生成各居群兩兩之間的地理距離三角矩陣，并對(duì)其作對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化，生成標(biāo)準(zhǔn)地理距離矩陣Log（1+GDD），然后利用該插件對(duì)遺傳距離矩陣與地理距離矩陣進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)，設(shè)置9 999次重復(fù)，檢驗(yàn)遺傳距離與地理距離的相關(guān)性，看是否與距離隔離模型（IBD）相符。

1.3.4 單倍型系統(tǒng)發(fā)育分析

使用DnaSP 5.10軟件將cpDNA聯(lián)合片段和ITS序列導(dǎo)出.rdf格式文件，利用NETWORK 10.2軟件Median-joining算法[13]處理生成.out格式文件，后分別構(gòu)建ITS序列基因型和cpDNA聯(lián)合片段單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，闡明各單倍型間的發(fā)育關(guān)系。

1.3.5 群體歷史動(dòng)態(tài)分析

利用DnaSP軟件進(jìn)行中性檢驗(yàn)（neutrality test）分析和失配分布（mismatch distribution）分析判斷群體動(dòng)態(tài)。中性檢驗(yàn)分析用來(lái)檢測(cè)物種群體是否有近期擴(kuò)張歷史，常常使用Tajima’s D值和Fu’s Fs值的正負(fù)和顯著性來(lái)檢驗(yàn)[14-15]。利用該軟件中的Pairwise No. of Differences進(jìn)行失配分布分析，根據(jù)失配分布圖中觀測(cè)值的分布曲線判斷具鱗水柏枝居群的歷史動(dòng)態(tài)[16]。

1.4 生態(tài)位模擬

選用最大熵模型（MaxEnt）[17]研究具鱗水柏枝當(dāng)前及歷史時(shí)期中潛在分布區(qū)域的變化。通過(guò)查閱全球生物多樣性信息服務(wù)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)（GBIF， https：//www.gbif.org/）、中國(guó)數(shù)字植物標(biāo)本館（CVH， http：//www.cvh.ac.cn/）以及本研究采樣點(diǎn)，整理去除重復(fù)無(wú)效數(shù)據(jù)，共獲得具鱗水柏枝分布記錄 194條。在Worldclim網(wǎng)站（http：//www.worldclim. org/）[18]下載末次間冰期（LIG，130 ka BP）、末次盛冰期（LGM，21 ka BP）、中全新世（HM，6 ka BP）和當(dāng)前的19個(gè)氣候變量數(shù)據(jù)（bio 1～bio 19），以及海拔（elev）、坡度（slope）、坡向（aspect）共22個(gè)變量數(shù)據(jù)。

在MaxEnt 3.4.4中，選用隨機(jī)取樣方法（Randomseed）選擇75%的樣點(diǎn)數(shù)據(jù)用于構(gòu)建模型，25%的數(shù)據(jù)用于對(duì)模型進(jìn)行檢驗(yàn)。通過(guò)受試者工作特征（ROC）曲線下的面積，即AUC值判定模型預(yù)測(cè)精度。利用刀切法（Jackknife）計(jì)算各環(huán)境因子貢獻(xiàn)率，將貢獻(xiàn)率較小的環(huán)境因子除去后，留下貢獻(xiàn)率前8的環(huán)境因子進(jìn)行后續(xù)處理，使用ArcGIS 10.8軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS片段譜系地理學(xué)分析

2.1.1 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

具鱗水柏枝54個(gè)居群共278個(gè)個(gè)體的ITS片段均成功擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果條帶清晰明亮（圖2），且均成功測(cè)序，測(cè)序峰圖的峰形良好（圖3），經(jīng)人工核對(duì)拼接后進(jìn)行比對(duì)，得到ITS片段長(zhǎng)度為723 bp。

2.1.2 基因型分布及多態(tài)性

具鱗水柏枝ITS片段T、C、A、G堿基平均含量分別為23.7%、24.8%、25.2%、26.3%。共有29個(gè)變異位點(diǎn)，其中有1個(gè)是堿基插入和缺失位點(diǎn)，其余28個(gè)為堿基替換位點(diǎn)（表2）。具鱗水柏枝所有樣本中共檢測(cè)出33個(gè)基因型（G1～G33），其中G3、G8、G9、G12、G14、G15、G18、G21、G25、G28、G29、G33為特有基因型，其余21種基因型為共享基因型。其中基因型G1出現(xiàn)頻率最高，被98個(gè)個(gè)體共享（占比35.3%），在阿尼瑪卿山以北的黃河流域和柴達(dá)木內(nèi)流區(qū)廣泛分布，部分居群如P35、P41、P45、 P48、P54等僅由G1一種基因型構(gòu)成；其次是基因型G10，有25個(gè)個(gè)體為該基因型（占比9.0%），在巴顏喀拉山脈西南側(cè)居群（如P6、P11、P16、P18、P19等）中廣泛分布，居群P19僅由G10一種基因型構(gòu)成（圖4）。具鱗水柏枝ITS片段遺傳多樣性分析結(jié)果表明，所有個(gè)體總的基因型多樣性為0.846，各居群基因型多樣性為0～0.900。其中居群P34的基因型多樣性最高，為0.900；居群P29次之，為0.867。所有個(gè)體總的核苷酸多樣性為0.003 61，各居群核苷酸多樣性為0～0.006 93，其中居群P5的核苷酸多樣性最高，達(dá)到了0.006 93，居群P33和P36次之，均為0.004 99。所有個(gè)體的核苷酸平均差異系數(shù)為2.599，各居群核苷酸平均差異數(shù)為0～5.000，同樣是居群P5的核苷酸平均差異數(shù)最高，達(dá)到了5.000，居群P33和P36次之，均為3.600。總的來(lái)看，位于巴顏喀拉山脈西南側(cè)的居群（P3、P4、P5、P12等）以及位于阿尼瑪卿山南部的居群（P23、P29、P32、P33等）的遺傳多樣性指數(shù)較高。各居群基因型組成、數(shù)量以及各遺傳多樣性指數(shù)見(jiàn)表3。

2.1.3 居群遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于ITS片段的分析結(jié)果顯示，具鱗水柏枝居群內(nèi)平均遺傳多樣性HS=0.481，總的遺傳多樣性HT=0.856，遺傳變異系數(shù)NST=0.624顯著大于GST=0.438（P<0.05），表明具鱗水柏枝ITS片段存在明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)（表4）。分子變異分析（AMOVA）表明，具鱗水柏枝居群間遺傳變異占54.75%，居群內(nèi)遺傳變異占45.25%，居群間遺傳分化顯著（FST=0.547 45，P<0.001）（表5）。根據(jù)公式計(jì)算出ITS片段的基因流Nm=0.410，表明具鱗水柏枝ITS片段在居群間有中等程度的基因交流。

基于ITS序列的遺傳距離和地理距離相關(guān)性的Mantel檢驗(yàn)結(jié)果顯示，具鱗水柏枝居群間的遺傳距離與地理距離顯著正相關(guān)（r=0.341，P=0.001），符合IBD距離隔離模型，說(shuō)明地理距離對(duì)于具鱗水柏枝ITS片段的遺傳分化有重要影響（圖5）。

2.1.4 基因型系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

利用NETWORK 10.2軟件Median-joining算法構(gòu)建了具鱗水柏枝ITS序列33個(gè)基因型的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。結(jié)果（圖6）顯示，33個(gè)基因型呈現(xiàn)出較為復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其中基因型頻率較高的G1、G4、G10亦位于網(wǎng)絡(luò)圖的核心位置，且這3種基因型均為共享基因型，推測(cè)其為較古老的基因型。而G8、G14、G25、G30、G33等基因型均位于分支的末端，且為居群特有基因型，推測(cè)其形成時(shí)間較晚，是由其他較古老單倍型進(jìn)一步突變衍生而來(lái)的。

2.1.5 群體歷史動(dòng)態(tài)分析

對(duì)具鱗水柏枝ITS片段的中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Tajima’s D為-1.214 00（P>0.1），F(xiàn)u and Li’s D*為-0.130 87（P>0.10），F(xiàn)u and Li’s F*為-0.709 21（P>0.10），均為不顯著負(fù)值，支持群體發(fā)展平穩(wěn)，但失配分布圖呈現(xiàn)出較為明顯的單峰曲線（圖7），綜合來(lái)看，認(rèn)為具鱗水柏枝群體整體處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，可能發(fā)生過(guò)較弱的擴(kuò)張事件。

2.2 cpDNA片段譜系地理學(xué)分析

2.2.1 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

具鱗水柏枝54個(gè)居群共278個(gè)個(gè)體的cpDNA片段（rps16、psbE-petL、petA-psbJ）均成功擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果條帶清晰明亮（圖8～10），且均成功測(cè)序，測(cè)序峰圖的峰形良好（圖11～13），經(jīng)人工核對(duì)拼接后進(jìn)行比對(duì)，得到3個(gè)片段，其長(zhǎng)度分別為794、918、1 028 bp。對(duì)3個(gè)片段依次拼接，得到2 740 bp的聯(lián)合片段。

2.2.2 單倍型分布及多樣性

具鱗水柏枝cpDNA聯(lián)合片段T、C、A、G堿基平均含量分別為34.3%、15.2%、35.7%、14.9%，與具鱗水柏枝葉綠體全基因組A/T堿基含量較高的情況相符[19]。具鱗水柏枝共有56個(gè)變異位點(diǎn)，其中有14個(gè)是堿基插入和缺失位點(diǎn)，其余42個(gè)為堿基替換位點(diǎn)。具鱗水柏枝所有樣本中共檢測(cè)出41個(gè)單倍型（H1～H41），其中H7、H11、H12、H14、H15、H16、H23、H25、H32、H36、H37、H39、H40、H41為特有單倍型，其余27種單倍型為共享單倍型。其中單倍型H1出現(xiàn)頻率最高，被103個(gè)個(gè)體共享（占比37.1%），在阿尼瑪卿山以北的黃河流域和柴達(dá)木內(nèi)流區(qū)以及果洛藏族自治州北部部分地區(qū)廣泛分布，部分居群如P34、P35、P40、P41、P45、P54等僅由H1一種單倍型構(gòu)成；其次是單倍型H3，有22個(gè)個(gè)體為該單倍型（占比7.9%），在巴顏喀拉山脈西南側(cè)位于長(zhǎng)江流域的居群（如P3、P4、P5、P8、P15、P16等）中廣泛分布，在部分居群如P6、P8、P15中單倍型H3占比超過(guò)一半，部分個(gè)體數(shù)較多的單倍型如P8、P9、P13等僅在玉樹(shù)藏族自治州內(nèi)的瀾滄江流域有分布（圖14）。

具鱗水柏枝cpDNA聯(lián)合片段遺傳多樣性分析結(jié)果表明，所有個(gè)體總的單倍型多樣性為0.859，各居群?jiǎn)伪缎投鄻有詾?～0.933，其中居群P30單倍型多樣性最高，為0.933，居群P22、P23次之，均為0.900。所有個(gè)體總的核苷酸多樣性為0.002 00，各居群核苷酸多樣性為0～0.004 41，其中居群P9核苷酸多樣性最高，達(dá)到了0.004 41，居群P10次之，為0.003 36。所有個(gè)體的核苷酸平均差異系數(shù)為5.344，各居群核苷酸平均差異數(shù)為0～11.800，同樣是居群P9核苷酸平均差異數(shù)最高，達(dá)到了11.800，居群P10次之，為9.000。與ITS片段的情況類(lèi)似?？偟膩?lái)看，位于巴顏喀拉山脈西南側(cè)的居群（P9、P10、P15、P19等）遺傳多樣性指數(shù)較高。

2.2.3 居群遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于cpDNA聯(lián)合片段的分析結(jié)果顯示，具鱗水柏枝居群內(nèi)平均遺傳多樣性HS=0.492，總的遺傳多樣性HT=0.853，與ITS片段的結(jié)果相近；遺傳變異系數(shù)NST=0.458大于GST=0.424，但是并不顯著（P>0.05），表明具鱗水柏枝cpDNA聯(lián)合片段存在一定的譜系地理結(jié)構(gòu)（表6）。分子變異分析（AMOVA）表明，具鱗水柏枝居群間遺傳變異占60.53%，居群內(nèi)遺傳變異占39.47%，居群間遺傳分化顯著（FST=0.605 25，P<0.001）（表7），結(jié)果較之ITS片段居群間遺傳變異所占比例更高，居群間遺傳分化也更高。根據(jù)公式計(jì)算出ITS片段的基因流Nm=0.326，表明具鱗水柏枝的cpDNA在居群間有一定程度的基因交流，但相較于ITS片段較弱。

基于cpDNA聯(lián)合片段的遺傳距離和地理距離相關(guān)性的Mantel檢驗(yàn)結(jié)果顯示，具鱗水柏枝居群間的遺傳距離與地理距離呈顯著正相關(guān)（r=0.209，P=0.001），r值低于ITS片段，但亦符合IBD距離隔離模型，說(shuō)明地理距離對(duì)于具鱗水柏枝cpDNA的遺傳分化有重要影響（圖15）。

2.2.4 群體歷史動(dòng)態(tài)分析

對(duì)具鱗水柏枝cpDNA聯(lián)合片段的中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Tajima’s D為-65 395（P>0.1），為不顯著負(fù)值；Fu and Li’s D*為0.616 63（P>0.10），F(xiàn)u and Li’s F*為0.736 65（P>0.10），均為不顯著正值，支持群體發(fā)展平穩(wěn)，同時(shí)失配分布圖呈現(xiàn)出典型的多峰曲線（圖16），綜合中性檢驗(yàn)和失配分布分析，認(rèn)為具鱗水柏枝群體拒絕擴(kuò)張假說(shuō)，整體處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。

2.3 生態(tài)位模擬

經(jīng)相關(guān)分析，選擇海拔（elev）、最冷季度平均溫度（Bio11）、等溫性（Bio3）、年降水量（Bio12）、降水量季節(jié)性變化（Bio15）、氣溫季節(jié)性變動(dòng)系數(shù)（Bio4）、坡度（slope）、坡向（aspect）8個(gè)貢獻(xiàn)率高的環(huán)境變量用于MaxEnt模型運(yùn)行（表8）。

經(jīng)過(guò)10次重復(fù)的交叉驗(yàn)證模型運(yùn)行，AUC值均大于0.9，說(shuō)明MaxEnt模型對(duì)具鱗水柏枝適生區(qū)的預(yù)測(cè)有較高的可信度。在所選的8個(gè)環(huán)境因子中，海拔的貢獻(xiàn)率占45.4%，說(shuō)明海拔是影響具鱗水柏枝分布的最關(guān)鍵因素；其次是最冷季度平均溫度，占13.8%。

根據(jù)適生度將0～1均分為5個(gè)等級(jí)：不適宜區(qū)[0.0， 0.2）、低適宜區(qū)[0.2， 0.4）、中適宜區(qū)[0.4， 0.6）、較適宜區(qū)[0.6， 0.8）、高適宜區(qū)[0.8， 1.0），分別統(tǒng)計(jì)面積（表9）。生態(tài)位模擬結(jié)果顯示，4個(gè)時(shí)期具鱗水柏枝較高適生度（>0.6）范圍變化不劇烈，在末次間冰期（LIG）適生區(qū)主要分布于青藏高原東側(cè)、云貴高原北部、祁連山等區(qū)域；末次盛冰期（LGM）適生區(qū)在青藏高原東北部，以及喜馬拉雅山脈北麓有一定程度擴(kuò)張；在中全新世（HM）適生區(qū)范圍達(dá)到最大，為 272 152 km2；而當(dāng)前具鱗水柏枝在青藏高原東北部適生區(qū)范圍有一定程度縮?。▓D17）。

3 結(jié)論與討論

3.1 遺傳多樣性及居群遺傳結(jié)構(gòu)

遺傳多樣性是評(píng)估物種種質(zhì)資源健康狀況的重要指標(biāo)之一，遺傳多樣性越高，物種對(duì)于外界不良因素的抵抗能力和環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)[20-21]。對(duì)具鱗水柏枝54個(gè)居群共278個(gè)個(gè)體的cpDNA聯(lián)合片段和ITS片段的分析結(jié)果顯示，cpDNA聯(lián)合片段共得到41種單倍型，總的單倍型多樣性為0.859，共有54個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)，總的核苷酸多樣性為0.002 00；ITS片段得到29種基因型，總的基因型多樣性為0.846，共有29個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)，總的核苷酸多樣性為0.003 61。在物種層面上，具鱗水柏枝的居群表現(xiàn)出較高的總體遺傳多樣性，其中cpDNA聯(lián)合片段的遺傳多樣性為0.853，而ITS片段的遺傳多樣性為0.856。同時(shí)，該物種居群內(nèi)的平均遺傳多樣性相對(duì)較低，cpDNA聯(lián)合片段的平均遺傳多樣性為0.492，ITS片段的平均遺傳多樣性為0.481。這兩組數(shù)據(jù)均表明，具鱗水柏枝的遺傳多樣性水平較為顯著，且高于Petit等[22]報(bào)告的170種植物的葉綠體基因組不同片段的平均遺傳多樣性（0.670）。類(lèi)似的研究結(jié)論在青藏高原地區(qū)分布的其他植物中也廣泛存在，例如黃纓菊Xanthopappus subacaulis（cpDNA：HT=0.720，HS=0.189。ITS：HT=0.853，HS=0.540）。AMOVA分析結(jié)果表明，黃纓菊的遺傳變異主要分布在不同居群間，顯示出較高的遺傳分化程度。此外，研究發(fā)現(xiàn)黃纓菊各居群之間的遺傳距離與其地理距離之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，這表明地理隔離是影響黃纓菊居群遺傳分化的主要因素。蕨麻Potentilla anserina（cpDNA：HT=0.849，HS=0.6400。ITS：HT=0.853，HS=0.540）的遺傳變異主要表現(xiàn)為居群內(nèi)遺傳變異，居群間分化水平較高[24]。藏紅豆杉Taxus wallichiana（cpDNA：HT=0.884，HS=0.271）共區(qū)分出19種不同的單倍型，發(fā)現(xiàn)較高水平的種群分化，種群之間的循環(huán)基因流動(dòng)水平較低[25]。對(duì)西藏沙棘Hippophae tibetana（cpDNA：HT=0.905，HS=0.216。ITS：HT=0.854，HS=0.168）進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在西藏沙棘的整個(gè)分布區(qū)域中，觀察到了明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)。然而，在東部組、中部組和西部組內(nèi)部并未顯示出譜系地理結(jié)構(gòu)的存在?；赾pDNA聯(lián)合片段的具鱗水柏枝群體的總體遺傳多樣性與基于ITS片段的總體遺傳多樣性非常相近。這一結(jié)果表明，盡管cpDNA是通過(guò)母系單親遺傳，但具鱗水柏枝依然表現(xiàn)出較強(qiáng)的種內(nèi)基因交流能力。這種特性暗示了該種群在氣候環(huán)境變化和選擇壓力下具備良好的抵御能力和適應(yīng)能力。唐古特虎耳草Saxifraga tangutica（cpDNA，HT=0.933；ITS，HT=0.987）中較高的遺傳變異特性主要由居群內(nèi)遺傳變異引起[27]。菊葉紅景天Rhodiola chrysanthemifolia（cpDNA，HT=0.937；ITS，HT=0.970）[28]等高原植物也得到了類(lèi)似結(jié)果。

本研究還發(fā)現(xiàn)具鱗水柏枝居群間具有很高的遺傳分化程度：ITS片段，F(xiàn)ST=0.547 45（P<0.001）；cpDNA聯(lián)合片段，F(xiàn)ST=0.605 25（P<0.001）。cpDNA遺傳分化程度要高于ITS片段，與其他多年生灌木相近或略低，如沙棘Hippophae rhamnoides（FST=0.670，P<0.01）[29]。根據(jù)ITS片段分析結(jié)果，具鱗水柏枝具有顯著的譜系地理結(jié)構(gòu)（NST=0.624>GST=0.438，P<0.05），基于cpDNA聯(lián)合片段得到的結(jié)果雖然沒(méi)有ITS片段顯著，但也支持具鱗水柏枝具有一定的譜系地理結(jié)構(gòu)（NST=0.458>GST=0.424，P>0.05）。根據(jù)AMOVA分析結(jié)果，具鱗水柏枝ITS片段及cpDNA片段的居群間變異分別占54.75%和60.53%，顯示具鱗水柏枝的分化和變異主要發(fā)生在居群間，同時(shí)發(fā)現(xiàn)具鱗水柏枝居群間亦具有一定程度的基因流（ITS：Nm=0.410。cpDNA：Nm=0.326）。此外，Mantel檢驗(yàn)的結(jié)果表明，具鱗水柏枝不同居群之間的遺傳距離與它們之間的地理距離之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（cpDNA：r=0.209，P=0.001。ITS：r=0.341，P=0.001）。特別是基于ITS片段所獲得的結(jié)果更加顯著，這表明地理隔離對(duì)具鱗水柏枝群體的遺傳分化產(chǎn)生了直接的影響。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了上述各項(xiàng)分析的結(jié)果。物種的群體遺傳結(jié)構(gòu)是由生殖系統(tǒng)特征、生活史特征以及棲息地地理特征等因素共同影響而形成的[30]，據(jù)此，推測(cè)具鱗水柏枝形成目前遺傳結(jié)構(gòu)的可能原因如下：1）具鱗水柏枝生境特異性較高，主要生長(zhǎng)于河谷沙地，青藏高原地勢(shì)極為復(fù)雜，諸如巴顏喀拉山、阿尼瑪卿山、橫斷山、唐古拉山，以及長(zhǎng)江、瀾滄江等高山深谷形成的地理屏障，對(duì)花粉和種子的傳播形成阻礙，致使不同地理區(qū)塊間產(chǎn)生較高的遺傳分化。2）雙親遺傳的ITS片段相較于母系單親遺傳的cpDNA，能更好地實(shí)現(xiàn)居群內(nèi)及居群間的傳播，因此具鱗水柏枝ITS片段的總遺傳多樣性及基因流均相對(duì)較高，但具鱗水柏枝種子較小且可以通過(guò)風(fēng)媒或動(dòng)物進(jìn)行廣泛傳播，相較于其他多年生灌木，具鱗水柏枝cpDNA同樣具有較高的總遺傳多樣性和基因流。

3.2 冰期避難所及群體歷史動(dòng)態(tài)

冰期避難所是植物在冰期惡劣環(huán)境條件下生存的集中區(qū)域，同時(shí)也是冰期之后物種重新擴(kuò)散和分布的起始點(diǎn)[31]。棲息在冰期避難所內(nèi)的植物群落經(jīng)歷了較長(zhǎng)時(shí)間的進(jìn)化演變，因而積累了更為豐富的變異，并展現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。當(dāng)物種從這些避難所向外擴(kuò)散時(shí)，通常會(huì)伴隨遺傳漂變或奠基者效應(yīng)的產(chǎn)生。隨著物種擴(kuò)散距離的增加，其遺傳多樣性水平往往會(huì)逐漸降低。因此，科學(xué)家可以依據(jù)遺傳多樣性的水平來(lái)推測(cè)物種避難所的具體位置[32]。目前，物種冰期避難所主要分為3種模式：1）居群遺傳多樣性由高原臺(tái)面向邊緣遞減，如祁連圓柏Juniperus przewalskii[33]和青海云杉Picea crassifolia[34]等，屬于“退縮/回遷”模式物種。2）大多為耐寒植物，特有單倍型或遺傳多樣性高的居群往往分布于高原臺(tái)面上被相互隔離的一個(gè)或多個(gè)本地避難所內(nèi)，如銀露梅Potentilla glabra [35]、露蕊烏頭Aconitum gymnandrum[36]等，屬于“高原臺(tái)面避難所/局部擴(kuò)張”模式物種。3）高原臺(tái)面形成多個(gè)微型避難所，特有單倍型和遺傳多樣性高的居群在整個(gè)分布范圍內(nèi)均勻分布，如西藏沙棘 Hippophae tibetana[26]和菊葉紅景天Rhodiola chrysanthemifolia[28]等，屬于“微型避難所”模式物種。

ITS片段的基因型系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示，33個(gè)基因型呈現(xiàn)出較為復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其中基因型頻率較高的G1、G4、G10亦位于網(wǎng)絡(luò)圖的核心位置，且這3種基因型均為共享基因型，推測(cè)其為較古老的基因型，其中基因型G1被阿尼瑪卿山以北的黃河流域和柴達(dá)木內(nèi)流區(qū)的眾多居群所共享；基因型G4、G10在巴顏喀拉山西南方廣泛分布，且其分布的諸如位于玉樹(shù)市的P4、P5、P12等居群具有很高的遺傳多樣性。cpDNA聯(lián)合片段的單倍型系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示，單倍型H1也位于網(wǎng)絡(luò)圖的絕對(duì)核心位置，很多單倍型是由H1直接衍生而來(lái)，推測(cè)其應(yīng)是最古老單倍型，且其分布范圍與ITS片段的基因型G1有很高的相似度；單倍型H3、H10、H28、H35等也位于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的主干位置，且均為共享單倍型，其分布的諸如囊謙縣（P9、P10）、石渠縣（P19）、班瑪縣（P30）、久治縣（P31）等居群遺傳多樣性亦較高。綜上所述，巴顏喀拉山西南方和阿尼瑪卿山以南的具鱗水柏枝居群不僅遺傳多樣性較高，且有眾多古老的單倍型分布，推測(cè)應(yīng)為具鱗水柏枝的主要冰期避難所，而在青藏高原東北部海拔較低的廣闊地區(qū)亦有具鱗水柏枝居群就地尋找避難所，由于其對(duì)環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)能力和抗寒旱能力，因冰期所隔斷的具鱗水柏枝各分布區(qū)內(nèi)仍有部分個(gè)體存活，物種整體保持較為穩(wěn)定的狀態(tài)，但形成了較高的居群間遺傳分化，較符合“高原臺(tái)面避難所/局部擴(kuò)張”模式。

通過(guò)對(duì)具鱗水柏枝的cpDNA聯(lián)合片段和ITS片段的中性檢驗(yàn)和失配分布分析，綜合分析Tajima’s D、Fu and Li’s D*、Fu and Li’s F*的值以及失配分布圖峰形，認(rèn)為具鱗水柏枝群體發(fā)展平穩(wěn)，未經(jīng)歷過(guò)大規(guī)模的擴(kuò)張或收縮，整體處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。利用MaxEnt模型的生態(tài)位模型模擬結(jié)果顯示，4個(gè)時(shí)期具鱗水柏枝的適生區(qū)范圍整體變化不大，在末次間冰期（LIG）適生區(qū)主要分布于青藏高原東側(cè)、云貴高原北部、祁連山等區(qū)域；末次盛冰期（LGM）適生區(qū)在青藏高原東北部，以及喜馬拉雅山脈北麓有一定程度的擴(kuò)張；在中全新世（HM）時(shí)適生區(qū)范圍達(dá)到最大；而當(dāng)前具鱗水柏枝在青藏高原東北部的適生區(qū)范圍有一定程度縮小。對(duì)于具鱗水柏枝的歷史動(dòng)態(tài)分析和生態(tài)位模擬結(jié)果也有力地支持了對(duì)于其冰期避難所的相關(guān)判斷，因其對(duì)于各時(shí)期氣候變化有較高的適應(yīng)能力，從而種群始終保持整體相對(duì)穩(wěn)定。

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[本文編校：謝榮秀]