PRMT1介導(dǎo)的EZH2甲基化通過靶向抑制SOCS3促進(jìn)帕金森病發(fā)生和發(fā)展

【摘要】 目的 探究精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1（PRMT1）通過調(diào)味增強(qiáng)子同源物2（EZH2）調(diào)控細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子3（SOCS3）介導(dǎo)的帕金森?。≒D）機(jī)制。方法 以小鼠多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞為研究對(duì)象，采用1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）建立PD體外細(xì)胞模型。將小鼠多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞分為對(duì)照組、MPP+組、MPP++si-NC組、MPP++si-PRMT1組、MPP++si-PRMT1+oe-NC組、MPP++si-PRMT1+oe-EZH2組。觀察各組細(xì)胞在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞活力、EZH2在SOCS3啟動(dòng)子上的富集程度、PRMT1、EZH2、SOCS3、pT311-EZH2方面的表達(dá)。結(jié)果 MPP+組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組（Plt;0.05），而細(xì)胞活力低于對(duì)照組（Plt;0.05）。MPP+組EZH2在SOCS3啟動(dòng)子上的富集程度顯著高于對(duì)照組，且PRMT1及EZH2表達(dá)高于對(duì)照組（Plt;0.05），SOCS3及pT311-EZH2低于對(duì)照組。MPP++si-PRMT1組細(xì)胞凋亡率低于MPP++si-NC組（Plt;0.05），但細(xì)胞活力高于MPP++si-NC組（Plt;0.05）。MPP++si-PRMT1組EZH2在SOCS3啟動(dòng)子上的富集程度少于MPP++si-NC組，PRMT1及EZH2表達(dá)低于MPP++si-NC組（Plt;0.05），但SOCS3及pT311-EZH2表達(dá)高于MPP++si-NC組（Plt;0.05）。MPP++si-PRMT1+oe-EZH2組EZH2高于MPP++si-PRMT1+oe-NC組（Plt;0.05），而SOCS3低于MPP++si-PRMT1+oe-NC（Plt;0.05）。MPP++si-PRMT1+oe-EZH2組細(xì)胞凋亡率高于MPP++si-PRMT1+oe-NC組（Plt;0.05），但細(xì)胞活力低于MPP++si-PRMT1+oe-NC組（Plt;0.05）。結(jié)論 PRMT1通過抑制EZH2蛋白T311殘基磷酸化增強(qiáng)EZH2穩(wěn)定性，進(jìn)而下調(diào)SOCS3，引起PD中多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞死亡，促進(jìn)PD發(fā)生和發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】 帕金森病；細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子3；精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1；調(diào)味增強(qiáng)子同源物2

【中圖分類號(hào)】 R742.5" 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A" 【文章編號(hào)】 1672-7770（2025）01-0061-08

PRMT1-mediated methylation in EZH2 promoted the occurrence and development of Parkinson’s disease via inhibiting SOCS3

Abstract： Objective To reveal protein arginine methyltransferase 1（PRMT1） regulates suppressor of cytokine signaling 3（SOCS3）-mediated pathology of Parkinson’ disease（PD） via Enhancer of zeste homolog 2（EZH2）." Methods In this study， mouse dopaminergic neuronal cells were incubated with 1-methyl-4-phenylpyridiniumion（MPP+） to mimic PD in vitro. Mouse dopaminergic neuronal cells were divided into control， MPP+， MPP++si-NC， MPP++si-PRMT1， MPP++si-PRMT1+oe-NC and MPP++si-PRMT1+oe-EZH2 group. The changes in apoptosis， viability， enrichment of EZH2 in SOCS3， PRMT1， EZH2， SOCS3 and pT311-EZH2 in the six groups were compared. Results Compared to control group， MPP+ group developed the increases in apoptosis， PRMT1， EZH2 and enrichment of EZH2， and the decreases in cel viability， SOCS3 and p-T311-EZH2. Compared to MPP++si-NC group， MPP++si-PRMT1 group showed the reductions in apoptosis， PRMT1， EZH2 and enrichment of EZH2， and the elevations in cell viability， SOCS3 and p-T311-EZH2. Compared to MPP++si-PRMT1+oe-NC group， MPP++si-PRMT1+oe-EZH2 group displayed the enhancement of apoptosis and EZH2 and the decline in SOCS3 and cell viability. Conclusions PRMT1 stabilizes EZH2 via inhibiting the phosphorylation of Thr311 located in EZH2， thereby downregulating SOCS3 to induce the death in dopaminergic neuronal cells during PD， so as to promoted the occurrence and development of D.

Key words： Parkinson’s disease; suppressor of cytokine signaling 3; protein arginine methyltransferase 1; enhancer of zeste homolog 2

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是第二大神經(jīng)退行性疾病，患者總?cè)藬?shù)占全球65歲及以上人口的2%～3%［1］。PD具有“黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞退變及減少”及“路易小體形成”等病理學(xué)特征，臨床上主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)障礙、強(qiáng)直、震顫、情緒障礙、睡眠障礙、認(rèn)知障礙、疼痛等癥狀［24］。在PD發(fā)病機(jī)制中，路易小體的形成及積累促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞變性、死亡，從而導(dǎo)致人體內(nèi)多巴胺耗竭，引起運(yùn)動(dòng)障礙等PD臨床癥狀［56］，因此多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞死亡是引起PD發(fā)生的核心機(jī)制。引起多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞死亡的原因復(fù)雜且多變，探清多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞死亡機(jī)制有助于提高人們對(duì)PD發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為PD治療提供潛在的作用靶點(diǎn)。

精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1（arginine methyltransferase 1， PRMT1）是精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶的主要成員，介導(dǎo)蛋白質(zhì)精氨酸殘基側(cè)鏈的單甲基化及不對(duì)稱二甲基化修飾［7］。有研究指出PRMT1在PD動(dòng)物及細(xì)胞模型中表達(dá)顯著上調(diào)，過表達(dá)PRMT1可誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞死亡，并促進(jìn)PD發(fā)生。由此可見，PRMT1對(duì)PD發(fā)病機(jī)制具有重要影響［8］，但其確切的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。轉(zhuǎn)錄因子調(diào)味增強(qiáng)子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）在PD中表達(dá)上調(diào)，且在多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育和生長(zhǎng)發(fā)揮重要作用［910］。PRMT1參與調(diào)控EZH2的轉(zhuǎn)錄因子活性，新近研究證實(shí)PRMT1通過催化EZH2第342位精氨酸甲基（meR342）化修飾抑制EZH2蛋白T311殘基磷酸化，這一機(jī)制可增強(qiáng)EZH2蛋白穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)EZH2增強(qiáng)EZH2對(duì)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用［11］。細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）在PD發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮重要的調(diào)控作用。SOCS3是細(xì)胞因子調(diào)控蛋白，可抑制多種細(xì)胞類型中細(xì)胞因子白介素-6（interleukin-6，IL-6）的信號(hào)傳導(dǎo)［1213］。在PD大鼠模型中SOCS3活化可抑制HMGB1/RAG/NF-κB通路介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，緩解炎癥引起的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞死亡［14］，因此SOCS3是調(diào)控多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)及存活的重要靶點(diǎn)。有證據(jù)指出，EZH2可通過調(diào)控SOCS3基因上組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化（H3K27me3）抑制SOCS3轉(zhuǎn)錄 ［1516］，提示在PD中EZH2可能通過抑制SOCS3轉(zhuǎn)錄調(diào)控多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞死亡。綜上，本研究擬以MPP+誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞SN-4741細(xì)胞為研究對(duì)象，旨在探究PRMT1/EZH2/SOCS3軸對(duì)多巴胺能細(xì)胞死亡的調(diào)控作用，為PD機(jī)制研究提供有力的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 選用小鼠多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞SN-4741細(xì)胞為建模對(duì)象（BS-C02402946，上海賓穗生物科技有限公司）。采用含10%胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）及1%鏈青霉素混合液（美國(guó)Gibco公司）的高糖DMEM培養(yǎng)基［E600003；生工生物工程（上海）股份有限公司］孵育細(xì)胞，37 ℃及5% CO2下培養(yǎng)，每隔兩天更換1次新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%覆蓋率后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.2 PD體外模型 采用1-甲基-4-苯基吡啶離子（1-methyl-4-phenylpyridiniumion，MPP+）（HY-W008719；美國(guó)MedChemExpress公司）處理SN-4741細(xì)胞以構(gòu)建PD體外模型。MPP+試劑溶于DMSO中，使用100 μL新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋。細(xì)胞接種至6孔板中，貼壁后吸去100 μL細(xì)胞培養(yǎng)基，加入100 μL含MPP+試劑的細(xì)胞培養(yǎng)基，MPP+最終濃度為50 μmol/L。33 ℃及5% CO2下處理24 h。對(duì)需進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)組，先行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，48 h后進(jìn)行MPP+誘導(dǎo)。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 為探究PRMT1在PD中的調(diào)控作用，本研究擬構(gòu)建PRMT1 siRNA序列以敲低PRMT1在PD體外模型中的表達(dá)。PRMT1 siRNA及NC siRNA由美國(guó)圣克魯斯生物公司設(shè)計(jì)并合成。為進(jìn)一步驗(yàn)證PRMT1通過EZH2發(fā)揮調(diào)控作用，本研究擬基于pcDNA3.1質(zhì)粒構(gòu)建EZH2過表達(dá)質(zhì)粒（oe-EZH2），以期逆轉(zhuǎn)PRMT1對(duì)EZH2的作用效果。首先，使用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）體外擴(kuò)增EZH2目的基因片段，回收DNA，并通過雙酶切對(duì)EZH2片段進(jìn)行切割，取pcDNA 3.1質(zhì)粒，行雙酶切。隨后，通過DNA連接酶將EZH2連接至pcDNA3.1質(zhì)粒上，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌中，培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后挑選陽性菌落，測(cè)序，獲得EZH2過表達(dá)載體（oe-EZH2），并以空載pcDNA3.1質(zhì)粒為陰性對(duì)照（oe-NC）。

采用Lipofectamine 3000試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）轉(zhuǎn)染oe-EZH2至細(xì)胞以上調(diào)EZH2表達(dá)，oe-NC為陰性對(duì)照。使用Lipofectamine RNAiMAX試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）行PRMT1 siRNA（si-PRMT1）轉(zhuǎn)染以敲低PRMT1表達(dá)，NC siRNA（si-NC）為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染6 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后通過熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 本研究采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞接種至6孔板中，貼壁后根據(jù)分組給予相應(yīng)處理。實(shí)驗(yàn)后消化細(xì)胞，加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）溶液重懸細(xì)胞，1 000 g離心5 min，收集細(xì)胞，加入PBS溶液重懸細(xì)胞。取細(xì)胞，1 000 g離心5 min，棄上清液，采用Annexin V-FITC/PI染色試劑盒（C1062S；上海碧云天生物技術(shù)有限公司）對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色標(biāo)記。通過流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman公司）表征細(xì)胞凋亡率。

1.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力 本研究采用CCK-8試劑盒（C0037；上海碧云天生物技術(shù)有限公司）檢測(cè)各組細(xì)胞活力。細(xì)胞接種至6孔板中，貼壁后根據(jù)分組給予相應(yīng)處理。實(shí)驗(yàn)后每孔加入10 μL CCK-8試劑，33 ℃孵育1 h。采用酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）檢測(cè)450 nm處吸光度（optical density，OD）。計(jì)算細(xì)胞活力（%）。

1.6 熒光定量PCR 本研究采用熒光定量PCR對(duì)各組細(xì)胞中PRMT1及SOCS3表達(dá)行定量分析。取細(xì)胞樣品，采用RNA提取試劑盒（R1200；北京索萊寶科技有限公司）提取總RNA。使用PCR儀并結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR試劑盒（一步法）［FP313；天根生化科技（北京）有限公司］對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量分析。PCR程序如下：逆轉(zhuǎn)錄，50 ℃反應(yīng)30 min；預(yù)變性，95 ℃反應(yīng)3 min；變性，95 ℃反應(yīng)15 s，退火/延伸/熒光采集，60 ℃反應(yīng)30 s，共40次循環(huán)；熔解曲線分析：95 ℃，5 s；60 ℃，15 s；95 ℃，15 s。PRMT1上游引物：5′-CTGCCTCTTCTA CGAGTCCATG-3′；PRMT1下游引物：5′-TCGGTC CTCAATGGCTGTCACA-3′；SOCS3上游引物序列：5′-GCTCCAAAAGCGAGTACCAG-3′；SOCS3下游引物序列：5′-TGACGCTCAACGTGAAGAAG-3′；GAPDH上游引物序列：5′-AGCCCAAGATGCCCTTCAGT-3′；GAPDH下游引物序列：5′-CCGTGTTCCTACCCC CAATG-5′。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法對(duì)SOCS3及PRMT1表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.7 Western Blot""" 本研究采用Western Blot對(duì)各組細(xì)胞中SOCS3、EZH2、pT311 EZH2行蛋白水平檢測(cè)。收集細(xì)胞樣品，加入RIPA裂解液RIPA裂解液（R0020；北京索萊寶科技有限公司），置于冰上，至細(xì)胞充分裂解后，12 000 g、4 ℃離心10 min，取上清液。取少量上清液，采用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒定量。向蛋白樣品中加入loading buffer，95 ℃加熱至蛋白變性。使用SDS-PAGE凝膠試劑盒（P0901；上海碧云天生物）制備SDS-PAGE凝膠，上樣，每條泳道加入20 μL上清液，使用電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）行電泳分離。冰浴條件下，通過濕式轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司）將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（ISEQ00010，北京索萊寶科技有限公司）。加入Western Blot封閉液（SW3010，北京索萊寶科技有限公司），室溫封閉1 h，期間搖床振蕩。移除Western Blot封閉液，1X TBST緩沖液洗滌3次后加入1抗，4 ℃孵育過夜?；厥?抗，1× Tris鹽緩沖液（Tris buffer solution Tween，TBST）緩沖液（T1081；北京索萊寶生物）洗滌3次后加入辣根過氧化物酶交聯(lián)的2抗（稀釋度1∶1 000），室溫孵育1 h?；厥?抗，洗滌3次后使用超敏增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒（enhanced chemiluminescence，ECL）（P0018S；上海碧云天生物技術(shù)有限公司）行顯影處理。通過蛋白凝膠成像儀觀察蛋白條帶，并以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算蛋白相對(duì)水平。1抗及其稀釋度如下：SOCS3抗體（52113，美國(guó)Cell signaling technolgy公司），稀釋度1∶1 000；GAPDH抗體（2118，美國(guó)Cell signaling technology公司），稀釋度1∶1 000；EZH2抗體（4905，美國(guó)Cell signaling technolgy公司），稀釋度1∶1 000；pT311-EZH2抗體（IPH2494，江蘇泰州佰嘉生物科技有限公司），稀釋度1∶2 000。

1.8 ChIP-PCR 使用ChIP-PCR試劑盒（Bes5104，廣州伯信生物）驗(yàn)證EZH2與SOCS3啟動(dòng)子的結(jié)合關(guān)系。取細(xì)胞，加入4%多聚甲醛，室溫固定10 min。移除甲醛，加入裂解液透化細(xì)胞膜，超聲破碎使DNA片段化，4 ℃、10 000 g離心10 min，去除不溶物質(zhì)，取300 μL樣本，并與EZH2抗體或正常兔IgG抗體（陰性對(duì)照）（ab172730，美國(guó)Abcam公司，稀釋度1∶100）混合，4 ℃孵育過夜。使用ChIP級(jí)蛋白A/G磁珠沉淀蛋白-DNA復(fù)合物。解交聯(lián)并純化DNA，采用熒光定量PCR技術(shù)定量SOCS3水平。ChIP-qPCR引物序列如下：SOCS3上游引物，5′ -CGCTTCGGGACTAGGTAGGA-3′；SOCS3下游引物，5′-AGAAACCGGGAAAAGCTCCC-3′。

1.9 統(tǒng)計(jì)與分析 本研究使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均經(jīng)過三次生物重復(fù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)三次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取均值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。采用單因素方差分比較組間差異，事后兩兩比較為L(zhǎng)SD-t檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)方法均為雙尾檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 敲低PRMT1對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SN-4741細(xì)胞凋亡及活力的影響 經(jīng)單因素方差分析，對(duì)照組、MPP+組、MPP++si-NC組、MPP++si-PRMT1組在PRMT1、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞活力方面存在顯著性差異（均Plt;0.05）；MPP+組PRMT1表達(dá)高于對(duì)照組（Plt;0.05），MPP+組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組（Plt;0.05），而細(xì)胞活力小于對(duì)照組（Plt;0.05），表明MPP+誘導(dǎo)的PD體內(nèi)模型伴隨有細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞活力降低，以及PRMT1表達(dá)上調(diào)；MPP++si-NC組與MPP+組在PRMT1表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞活力方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Pgt;0.05），表明siRNA轉(zhuǎn)染這一方式不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；MPP++si-PRMT1組PRMT1表達(dá)低于MPP++si-NC組（Plt;0.05）；MPP++si-PRMT1組細(xì)胞凋亡率小于MPP++si-NC組（Plt;0.05），而細(xì)胞活力高于MPP++si-NC組（Plt;0.05），表明下調(diào)PRMT1可抑制MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。見圖1。

2.2 敲低PRMT1對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SN-4741細(xì)胞中SOCS3表達(dá)的影響 經(jīng)單因素方差分析，對(duì)照組、MPP+組、MPP++si-NC組、MPP++si-PRMT1組的SOCS3表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Plt;0.05）；MPP+組SOCS3表達(dá)低于對(duì)照組，MPP++si-NC組與MPP+組的SOCS3表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，MPP++si-PRMT1組SOCS3表達(dá)高于MPP++si-NC組（Plt;0.05）。見圖2。由此可見，SOCS3在MPP+誘導(dǎo)的PD體外模型中表達(dá)下調(diào)，而敲低PRMT1可逆轉(zhuǎn)這一趨勢(shì)，引起SOCS3上調(diào)，提示在PD中PRMT1可能負(fù)向調(diào)控SOCS3表達(dá)。

2.3 敲低PRMT1抑制EZH2在SOCS3上的募集通過ChIP-qPCR檢測(cè)EZH2在SOCS3啟動(dòng)子上的富集程度。經(jīng)單因素方差分析，對(duì)照組、MPP+組、MPP++si-NC組、MPP++si-PRMT1組的EZH2富集程度具有顯著性差異（Plt;0.05）；MPP+組富集程度高于對(duì)照組（Plt;0.05），MPP++si-NC組與MPP+組的富集程度無顯著性差異（Pgt;0.05），MPP++si-PRMT1組富集程度低于MPP++si-NC組（Plt;0.05）。由此可見，在PD中EZH2高度富集于SOCS3啟動(dòng)子上，敲低PRMT1抑制了EZH2在SOCS3上的募集。見圖3。

2.4 敲低PRMT1對(duì)EZH2表達(dá)及其T311磷酸化的影響 經(jīng)單因素方差分析，對(duì)照組、MPP+組、MPP++si-NC組、MPP++si-PRMT1組EZH2及pT311-EZH2蛋白水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Plt;0.05）；MPP+組EZH2高于對(duì)照組（Plt;0.05），而pT311-EZH2低于對(duì)照組（Plt;0.05）；MPP++si-NC組與MPP+組的EZH2及pT311-EZH2蛋白水平無顯著性差異（Pgt;0.05）；MPP++si-PRMT1組EZH2蛋白水平低于MPP++si-NC組（Plt;0.05），而pT311-EZH2高于MPP++si-NC組（Plt;0.05）。以上結(jié)果表明，在PD中EZH2上調(diào)，其T311位點(diǎn)磷酸化水平降低，而敲低PRMT1導(dǎo)致EZH2下調(diào)，其T311位點(diǎn)磷酸化水平升高，由此可見EZH2上T311位點(diǎn)磷酸化可負(fù)向調(diào)控EZH2表達(dá)，敲低PRMT1可能促進(jìn)T311位點(diǎn)磷酸化。見圖4。

2.5 上調(diào)EZH2逆轉(zhuǎn)敲低PRMT1對(duì)SOCS3的調(diào)控經(jīng)單因素方差分析，MPP++si-NC組、MPP++si-PRMT1組、MPP++si-PRTMT1+oe-NC組、MPP++si-PRMT1+oe-SOCS3組的EZH2及SOCS3表達(dá)具有顯著性差異（Plt;0.05）；MPP++si-PRMT1組EZH2表達(dá)低于MPP++si-NC組（Plt;0.05），SOCS3表達(dá)高于MPP++si-NC組（Plt;0.05），表明敲低PRMT1引起EZH2下調(diào)及SOCS3上調(diào)；MPP++si-PRMT1+oe-NC與MPP++si-PRMT1組的EZH2及SOCS3表達(dá)無顯著性差異（Pgt;0.05），表明過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染這一方式不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；MPP++si-PRMT1+oe-EZH2組EZH2高于MPP++si-PRMT1+oe-NC組（Plt;0.05），SOCS3低于MPP++si-PRMT1+oe-NC組（Plt;0.05），表明過表達(dá)EZH2可逆轉(zhuǎn)敲低PRMT1對(duì)SOCS3的作用，引起SOCS3下調(diào)。見圖5。

2.6 上調(diào)EZH2逆轉(zhuǎn)敲低PRMT1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 經(jīng)單因素方差分析，MPP++si-NC組、MPP++si-PRMT1組、MPP++si-PRTMT1+oe-NC組、MPP++si-PRMT1+oe-SOCS3組細(xì)胞凋亡率具有顯著性差異（Plt;0.05）；MPP++si-PRMT1組細(xì)胞凋亡率低于MPP++si-NC組（Plt;0.05）；MPP++si-PRMT1+oe-NC與MPP++si-PRMT1組的細(xì)胞凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Pgt;0.05），MPP++si-PRMT1+oe-EZH2組細(xì)胞凋亡率高于MPP++si-PRMT1+oe-NC組（Plt;0.05）。以上結(jié)果表明，在PD中敲低PRMT1可抑制細(xì)胞凋亡，而過表達(dá)EZH2逆轉(zhuǎn)敲低PRMT1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡升高。見圖6。

2.7 上調(diào)EZH2逆轉(zhuǎn)敲低PRMT1對(duì)細(xì)胞活力的影響 經(jīng)單因素方差分析，MPP++si-NC組、MPP++si-PRMT1組、MPP++si-PRTMT1+oe-NC組、MPP++si-PRMT1+oe-SOCS3組細(xì)胞活力具有顯著性差異（Plt;0.05）；MPP++si-PRMT1組細(xì)胞活力高于MPP++si-NC組（Plt;0.05）；MPP++si-PRMT1+oe-NC與MPP++si-PRMT1組的細(xì)胞活力無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Pgt;0.05）；MPP++si-PRMT1+oe-EZH2組細(xì)胞活力低于MPP++si-PRMT1+oe-NC組（Plt;0.05）。見圖7。以上結(jié)果表明，在PD中敲低PRMT1可促進(jìn)細(xì)胞活力，而過表達(dá)EZH2逆轉(zhuǎn)敲低PRMT1對(duì)細(xì)胞活力的影響，導(dǎo)致細(xì)胞活力降低。

3 討 論

多巴胺能神經(jīng)元死亡是PD神經(jīng)病理學(xué)的主要特征［17］。多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞死亡受多種因素影響，在這之中基因?qū)W異常發(fā)揮重要作用。PMRT1與細(xì)胞死亡密切相關(guān)。既往研究證實(shí)，PRMT1可通過Sirtuin 1依賴性途徑及p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）/c-Jun N端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［1819］。本研究發(fā)現(xiàn)，在PD多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞模型表現(xiàn)為PRMT1表達(dá)顯著上調(diào)，并伴隨有細(xì)胞凋亡升高及細(xì)胞活力降低，而敲低PRMT1可抑制多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)細(xì)胞活力。由此可見，PRMT1是改善PD中多巴胺能神經(jīng)元缺陷的重要靶點(diǎn)。

EZH2是一種組蛋白賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶，通過催化靶基因的H3K27me修飾引起基因沉默［20］。PRMT1具有精氨酸甲基化催化酶活力。新近研究表明在乳腺癌細(xì)胞中PRMT1可通過催化EZH2上精氨酸甲基化上調(diào)EZH2蛋白水平，繼而影響EZH2對(duì)目標(biāo)靶基因的基因沉默作用［2122］。然而既往研究中并無證據(jù)證實(shí)兩者在PD中的確切聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)，PD多巴胺能神經(jīng)元模型表現(xiàn)為EZH2表達(dá)下調(diào)，而敲低PRMT1可促進(jìn)EZH2蛋白T311磷酸化，并導(dǎo)致EZH2下調(diào)。同時(shí)本研究也證實(shí)，上調(diào)EZH2可逆轉(zhuǎn)敲低PRMT1對(duì)PD多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及活力的影響。由此可見，在PD中PRMT1通過抑制EZH2的T311磷酸化上調(diào)其表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞死亡。

SOCS3與多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞死亡息息相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，SOCS3在PD多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)降低，提示SOCS3與PD發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切。有研究指出，SOCS3在伴隨有-突觸核蛋白過度沉積的神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，而SOCS3表達(dá)增加有助于抑制-突觸核蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡及炎癥反應(yīng)［23］。由此可見，SOCS3表達(dá)異常是導(dǎo)致PD中多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞死亡的重要原因。新近研究證實(shí)，EZH2可催化SOCS3上H3K27me修飾，通過抑制SOCS3表達(dá)激活神經(jīng)元的炎癥信號(hào)通路，并影響神經(jīng)生理活動(dòng)［1516，24］，表明EZH2可通過組蛋白甲基化調(diào)控神經(jīng)元中SOCS3轉(zhuǎn)錄表達(dá)。鑒于PRMT1對(duì)EZH2的表觀學(xué)作用，本研究進(jìn)一步探究了PRMT、EZH2、SOCS3在PD多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞中的調(diào)控關(guān)系。結(jié)果顯示，敲低PRMT1導(dǎo)致SOCS3表達(dá)上調(diào)，并降低EZH2在SOCS3啟動(dòng)子上的富集程度，而上調(diào)EZH2可逆轉(zhuǎn)敲低PRMT1對(duì)SOCS3表達(dá)的影響。以上結(jié)果表明，PRMT1可通過EZH2抑制SOCS3表達(dá)，繼而引起多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞死亡。

目前觀點(diǎn)認(rèn)為，SOCS3可通過抑制JAK2/STAT3通路影響神經(jīng)退行性病變［25］。當(dāng)細(xì)胞因子與細(xì)胞膜受體結(jié)合后引起JAK2磷酸化，繼而激活SOCS3并促進(jìn)其易位至細(xì)胞核以調(diào)節(jié)IL-6等促炎基因表達(dá)。SOCS3可通過結(jié)合細(xì)胞膜受體抑制JAK2磷酸化，從而干擾后續(xù)STAT3激活及IL-6基因表達(dá)，并最終促進(jìn)神經(jīng)炎癥，加速多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞死亡［26］。由此可見，JAK2/STAT3通路是SOCS3調(diào)控PD進(jìn)展的重要機(jī)制。因此，當(dāng)PRMT1通過EZH2依賴性途徑下調(diào)SOCS3表達(dá)后，JAK2/STAT3通路活性隨之升高，從而上調(diào)細(xì)胞核中靶基因表達(dá)，并最終促進(jìn)PD進(jìn)展。本研究結(jié)果提示，PRMT1/EZH2/SOCS3軸與JAK2/STAT3通路存在潛在關(guān)系，故而后續(xù)研究可深入探究?jī)烧咴赑D發(fā)病機(jī)制中的調(diào)控作用，進(jìn)一步揭示PRMT1在PD中的調(diào)控機(jī)制，為PD防治及診斷提供研究依據(jù)。

本研究仍存在以下不足。首先，盡管本研究通過MPP+誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞損傷模型模擬了PD體外病理狀況，然而該模型仍存在無法完全模擬人體多巴胺能神經(jīng)元復(fù)雜環(huán)境的局限性，且未能在結(jié)合PD體內(nèi)模型驗(yàn)證PRMT1/EZH2/SOCS3軸對(duì)多巴胺能神經(jīng)元缺失的調(diào)控機(jī)制，這也是本研究的局限性之一。后續(xù)擬增加動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，通過MPTP誘導(dǎo)的PD大鼠模型驗(yàn)證PRMT1/EZH2/SOCS3軸對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的調(diào)控作用。其次，本研究已證實(shí)PRMT1、EZH2、SOCS3在PD多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞中的重要作用，卻未能結(jié)合臨床研究探討三者的臨床價(jià)值。PRMT1、EZH2、SOCS3在PD中的差異表達(dá)提示三者具有生物標(biāo)志物潛能，可用于PD早期診斷及風(fēng)險(xiǎn)分層。此外，本研究結(jié)果也表明PRMT1、EZH2、SOCS3可作為作用靶點(diǎn)用于PD治療，PRMT1抑制劑、EZH2抑制劑、SOC3激活劑等靶向藥物將有助于逆轉(zhuǎn)PD中多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞死亡。然而目前上述藥物在PD中的治療效果及機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。為解決上述不足，后續(xù)將設(shè)計(jì)一系列臨床前實(shí)驗(yàn)以探清PRMT1/EZH2/SOCS3軸靶向藥物在PD中的治療作用及價(jià)值，隨后在臨床水平上對(duì)PD患者展開前瞻性研究分析，應(yīng)用相關(guān)性分析探究PRMT1、EZH2、SOCS3與PD患者臨床病理特征的相關(guān)性，評(píng)價(jià)三者在PD診斷中的預(yù)測(cè)效能，并觀察相關(guān)靶向藥物在PD中的臨床療效。

綜上所述，本研究證實(shí)PRMT1通過促進(jìn)EZH2蛋白T311殘基磷酸化增強(qiáng)EZH2穩(wěn)定性，進(jìn)而抑制下游SOCS3表達(dá)，引起多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞死亡。本研究從表觀遺傳學(xué)角度揭示了導(dǎo)致PD中SOCS3失活的可能原因，并首次明確了PRMT1、EZH2、SOCS3在PD多巴胺能神經(jīng)元缺陷中的調(diào)控作用，三者有望作為重要靶點(diǎn)用于PD治療。此外，PRMT1、EZH2、SOCS3也具有PD生物標(biāo)志物的潛在價(jià)值。

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