UVB對成纖維細胞中IFI16表達的影響

馬慧敏 趙 琦 劉 瑋

IFI16(interferon inducible protein 16)是干擾素誘導核蛋白。IFI16最初被發(fā)現(xiàn)于淋巴細胞核內(nèi)，后經(jīng)免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，IFI16廣泛表達于不同組織中[1]，包括血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等[2]。Hensler等證實IFI16基因包含在細胞老化中起作用的基因[3]。2010年，有學者發(fā)現(xiàn)IFI16可以抑制細胞生長，誘導細胞老化，并下調(diào)hTERT的表達[4,5]，由此將干擾素誘導蛋白引入到衰老研究領域。

IF116調(diào)節(jié)細胞增殖和細胞周期[6]，在老化成纖維細胞中IFI16 mRNA和蛋白水平高于年輕細胞[7]；在正常人前列腺細胞，細胞老化后IFI16表達水平升高；永生化的成纖維細胞中IFI16表達降低，過度表達IFI16可以明顯地抑制細胞增殖[8]。在鱗狀細胞癌細胞、睪丸癌及人前列腺癌中IFI16表達下調(diào)[9-11]。以上的研究結果表明細胞老化的生物學過程中IFI16表達增高且在該過程中發(fā)揮重要作用。

β-半乳糖苷酶活性升高是典型的復制老化的生物學標志[12]，細胞生長停滯是細胞老化的另一特征。實驗中，以人成纖維細胞為研究對象，使用UVB重復照射細胞，檢測β-半乳糖苷酶及細胞周期，以確定細胞老化模型建立，進而檢測IFI16 mRNA及蛋白水平變化，以明確IFI16在細胞光老化過程中其表達是否變化。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 DMEM高糖培養(yǎng)液(德國，PAA)，胎牛血清(北京元享圣馬生物技術有限公司)，雙抗(100 U/mL青霉素及100 ug/ml鏈霉素)，UVB照射裝置(sigma),UVB輻照計(北京師范大學光電儀器廠)，CCK-8試劑盒(碧云天生物技術研究所)，酶聯(lián)免疫檢測儀(美國BIO-RAD)，trizol(invitrogen),cDNA合成試劑盒(北京天根)，real time PCR mix(北京天根)，IFI16單克隆抗體(abcam)。

1.2 細胞培養(yǎng)與UVB照射 常規(guī)分離培養(yǎng)人成纖維細胞。取5～10代以內(nèi)成纖維細胞，按10000個/cm2細胞接種至培養(yǎng)皿中，UVB照射細胞時，將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液換成PBS,照射完畢后換回培養(yǎng)液。UVB照射劑量為：100、200、 300、400 及 500 mJ/cm2，對照組除不接受UVB照射外，其他處理同UVB照射組細胞。

為了更加準確地模擬光老化的過程，根據(jù)UVB對成纖維細胞活性影響的試驗結果選擇小劑量重復照射方式，以300 mJ/cm2作為照射總劑量，每次100 mJ/cm2，共三次照射。

1.3 細胞增殖率測定 用WST-8分析細胞活性。UVB照射后24 h，用含10% WST-8溶液的新鮮培養(yǎng)液孵育細胞2 h后，用酶標儀于450 nm處測定OD值。

1.4 原位β-半乳糖苷酶染色分析 根據(jù)試劑使用說明，用2%甲醛和0.2%戊二醛固定細胞后，PBS沖洗2遍，按說明配制X-gal溶液，于37℃孵育24 h后，觀察三個視野，每個視野至少計數(shù)100個細胞，并計算染色細胞陽性率。

1.5 細胞周期分析 根據(jù)試劑盒(Cycletest plus, BecTon Dickinson, USA)說明行細胞周期分析。收集細胞，用70%酒精于4℃固定過夜后，離心用PBS清洗2次，依次加入A和B溶液于室溫下孵育10 min，最后用C溶液于冰上染色10 min；過濾后，上機檢測。

1.6 RNA提取及實驗定量PCR 用Trizol提取細胞總RNA，取0.5 ug RNA為模板合成cDNA；用1 ul cDNA為模板進行實時定量PCR反應，以β-actin為內(nèi)參并設陰性對照，每個樣本設三個重復。反應條件為：95℃，15 min，熱激活；95℃ 15 s 變性，65℃ 1 min退火和延伸，共40個循環(huán)。擴增結束時，做熔解曲線。用“△△CT方法”分析表達水平。

IFI16及β-actin引物如下：IFI16 forward (5′-ACTGAGTACAACAAAGCCATTTGA-3′), IFI16 reverse (5′-TTGTGACATTGTCCTGTCCCCAC-3′)， β-actin forward (5′-GTTGCTATCCAGGCTGTG-3′), β-actin reverse (5′-TGTCCACGTCACACTTCA-3′)。

1.7 Western分析 用RIPA裂解細胞提取蛋白并用BCA做蛋白定量，10% SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，二抗室濕孵育1 h，ECL發(fā)光，壓片，分析各條帶的灰度，將目的條帶的灰度值與內(nèi)參的灰度值的比值作為目的蛋白的表達水平。

1.8 統(tǒng)計學方法 結果用mean±S.D.方式表示。根據(jù)需要采用t檢驗或單因素方差分析不同處理組之間的差異，P<0.05被認為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 UVB細胞毒性分析 UVB照射后，在照射劑量為300 mJ/cm2時，細胞活性輕度下降,與對照組無顯著差異(P>0.05)；當劑量達到400 mJ/cm2和500 mJ/cm2時，細胞活性下降顯著(*P<0.0001)(表1，圖1)。

2.2 UVB照射后老化相關β-半乳糖苷酶染色分析 在本研究中，UVB照射后，β-半乳糖苷酶染色陽性率由11%上升為84% (圖2)。

2.3 UVB照射后細胞周期分析 UVB照射后，處于G2/M期的細胞比例由9.29%上升到31.16%，與對照組相比，有顯著性差異(P<0.05)(圖3)。

2.4 UVB照射細胞后，IFI16表達水平升高 UVB照射后，IFI16 mRNA和蛋白表達水平均上升，分別為2.11±0.45倍和1.59±0.23倍，且升高有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見圖4、5。

表1 紫外線對細胞增殖活性的影響

圖1 UVB照射后細胞毒性分析：UVB處理劑量由0～500 mJ/cm2。(*,與對照組相比p<0.05)圖2 三次小劑量UVB(100 mJ/cm2)重復照射后β-gal活性分析：(2a)對照組(β-gal染色,×200)，(2b)UVB處理組細胞(β-gal染色,×200)

圖3 三次小劑量UVB(100 mJ/cm2)重復照射后細胞周期分析：(a)對照組細胞周期分布；(b)UVB處理組細胞周期分布；(c)細胞周期百分比條圖；(d)兩組細胞處于細胞周期G2/M期百分比分析(*,與對照組相比P<0.05)

圖4 三次小劑量UVB(100 mJ/cm2)重復照射后，IFI16 mRNA表達水平的變化(*P<0.05)圖5 a、b三次小劑量UVB(100 mJ/cm2)重復照射后，IFI16蛋白表達水平變化

3 討論

目前，光老化機制的研究是學者關注的熱點問題，對該問題的研究可以預防紫外線引起的損害。為了研究這一機制，細胞光老化模型的建立是尤為關鍵的步驟。

首先，根據(jù)UVB對成纖維細胞的光毒性作用，選擇小劑量重復照射的方式作用于成纖維細胞。有研究認為，當β-半乳糖苷酶染色陽性細胞比例達到55%時，細胞即進入老化階段[13]。在本研究中，β-半乳糖苷酶染色陽性細胞數(shù)達到84%，因此，符合細胞老化的標準。細胞周期停滯是老化細胞的另一特征。UVB照射后，細胞周期停滯于G2/M期，這與以前的研究相一致，即老化細胞的細胞周期停滯于G2/M[14]期。以上實驗結果證實，UVB小劑量重復照射的方式可以在短時間內(nèi)建立穩(wěn)定的細胞老化模型。

在近期研究中，證實IFI16參與自然老化過程，在該過程中，IFI16表達升高，且轉錄性調(diào)節(jié)P53及端粒酶而介導細胞老化過程[15，16]。在本研究中，UVB照射后誘導細胞老化，在該老化細胞中，IFI16 mRNA及蛋白表達均升高。但是，在細胞光老化過程中，IFI16表達升高能否調(diào)節(jié)P53及端粒酶，并進而影響細胞光老化進程中的生物學行為，仍然需要進一步研究。

[1] Gariglio M, Azzimonti B, Pagano M, et al. Immunohistochemical expression analysis of the human interferon-inducible gene IFI16, a member of the HIN200 family, not restricted to hematopoietic cells[J]. J Interferon Cytokine Res, 2002, 22(7):815-821.

[2] Dawson MJ, Elwood NJ, Johnstone RW, et al. The IFN-inducible nucleoprotein IFI 16 is expressed in cells of the monocyte lineage, but is rapidly and markedly down-regulated in other myeloid precursor populations[J]. J Leukoc Biol,1998,64(4):546-554.

[3] Hensler PJ, Annab LA, Barrett JC, et al. A gene involved in control of human cellular senescence on human chromosome 1q[J]. Mol Cell Biol,1994,14(4):2291-2297.

[4] Liao JC, Lam R, Brazda V, et al. Interferon-inducible protein 16: insight into the interaction with tumor suppressor p53[J]. Structure,2011,19(3):418-429.

[5] Song LL, Ponomareva L, Shen H, et al. Interferon-inducible IFI16, a negative regulator of cell growth, down-regulates expression of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene[J]. PLoS One,2010,5(1):e8569.

[6] Galatro TF, Holtman IR, Lerario AM, et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes[J]. Nat Neurosci,2017,20(8):1162-1171.

[7] Xin H, Pereira-Smith OM, Choubey D. Role of IFI 16 in cellular senescence of human fibroblasts[J]. Oncogene,2004,23(37):6209-6217.

[8] Clarke CJ, Hii LL, Bolden JE, et al. Inducible activation of IFI 16 results in suppression of telomerase activity, growth suppression and induction of cellular senescence[J]. J Cell Biochem,2010,109(1):103-112.

[9] Almstrup K, Leffers H, Lothe RA, et al. Improved gene expression signature of testicular carcinoma in situ[J]. Int J Androl,2007,30(4):292-302; discussion 303.

[10] Alimirah F, Chen J, Davis FJ, et al. IFI16 in human prostate cancer[J]. Mol Cancer Res,2007,5(3):251-259.

[11] Mazibrada J, De Andrea M, Rittà M, et al. In vivo growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma by the Interferon-inducible gene IFI16[J]. Cancer Lett,2010,287(1):33-43.

[12] Dimri GP, Lee X, Basile G, et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,1995,92(20):9363-9367.

[13] Maier AB, Westendorp RG, VAN Heemst D. Beta-galactosidase activity as a biomarker of replicative senescence during the course of human fibroblast cultures[J]. Ann N Y Acad Sci,2007,1100:323-332.

[14] Ma W, Hommel C, Brenneisen P, et al. Long-term growth arrest of PUVA-treated fibroblasts in G2/M in the absence of p16(INK4a) p21(CIP1) or p53[J]. Exp Dermatol,2003,12(5):629-637.

[15] Kwak JC, Ongusaha PP, Ouchi T, et al. IFI16 as a negative regulator in the regulation of p53 and p21(Waf1)[J]. J Biol Chem,2003,278(42):40899-40904.

[16] Choubey D, Panchanathan R. IFI16, an amplifier of DNA-damage response: Role in cellular senescence and aging-associated inflammatory diseases[J]. Ageing Res Rev,2016,28:27-36.