辣椒C2H2型鋅指蛋白家族基因鑒定及其在澇脅迫下的表達分析

收稿日期：2024-06-03

基金項目：貴州省農(nóng)業(yè)科學院一般基金項目[黔農(nóng)科一般基金（2024）26號]；貴州省山地農(nóng)業(yè)關鍵核心技術攻關項目（GZNYGJHX-2023008）；貴州省辣椒產(chǎn)業(yè)技術體系遺傳育種功能實驗室項目（GZLJCYJSTX-02）

作者簡介：王楠藝（1997-），男，貴州畢節(jié)人，碩士，助理研究員，主要從事辣椒種質(zhì)資源遺傳改良與創(chuàng)新研究。（E-mail）wangnanyi0202@163.com

通訊作者：何建文，（E-mail）569809092@qq.com

摘要：為了探究辣椒C2H2型鋅指蛋白家族在響應澇脅迫中的作用，本研究通過生物信息學方法對辣椒C2H2型鋅指蛋白家族蛋白理化性質(zhì)、基因結(jié)構、染色體定位、順式作用元件進行了全面分析。結(jié)果表明，辣椒C2H2型鋅指蛋白家族包含91個成員，多數(shù)成員定位于細胞核。91個成員可被分為6個亞族，不同亞族的成員基因結(jié)構存在差異。C2H2型鋅指蛋白家族基因啟動子區(qū)域主要包含植物生長發(fā)育元件、植物激素響應元件及逆境脅迫響應元件。對耐澇辣椒資源GC41和澇脅迫敏感型辣椒資源GC39在澇脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果表明，在GC41中，CaC2H2-17、CaC2H2-87在澇脅迫處理3d時相對表達量高，CaC2H2-17、CaC2H2-87在GC39中未表達。篩選出CaC2H2-16（Capana01g003556）、CaC2H2-32（Capana04g001616）、CaC2H2-72（Capana11g000176）、CaC2H2-73（Capana11g000178）、CaC2H2-87（Capana12g000773）5個轉(zhuǎn)錄因子，這5個轉(zhuǎn)錄因子分別調(diào)控了419個、526個、566個、305個、480個差異表達基因。本研究結(jié)果為辣椒C2H2家族成員的功能解析及耐澇辣椒資源的分子育種提供了重要的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

關鍵詞：辣椒；C2H2型鋅指蛋白；澇脅迫；生物信息學

中圖分類號：S641.3文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2025）01-0134-16

IdentificationoftheC2H2-typezincfingerproteinfamilygenesinCapsicumannuumL.andtheirexpressionanalysisunderwaterloggingstress

WANGNanyi¹，F(xiàn)ANGaoling¹，F(xiàn)UWenting¹，WUDi¹，YANGYa¹，HUANGDongfu¹，WANGLihao²，WUKangyun³，HEJianwen¹

（1.InstituteofPepper，GuizhouAcademyofAgriculturalSciences，Guiyang550006，China;2.InstituteofVegetablesandFlowers，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100081，China;3.KeyLaboratoryofCropGeneticResourcesandGermplasmInnovationinKarstRegion，MinistryofAgricultureandRuralAffairs，Guiyang550006，China）

Abstract：ToinvestigatetheroleoftheCapsicumannuumL.C2H2-typezincfingerproteinfamilyinresponsetowaterloggingstress，thephysicalandchemicalproperties，genestructure，chromosomelocalization，andcis-actingelementsoftheC2H2-typezincfingerproteinfamilywerecomprehensivelyanalyzedbybioinformaticsmethods.TheresultsshowedthattheCapsicumannuumL.C2H2-typezincfingerproteinfamilycontained91members，mostofwhichwerelocatedinthenucleus.The91memberscouldbedividedintosixsubfamilies，andthegenestructureofmembersindifferentsubamilieswasdifferent.ThepromoterregionsofC2H2-typezincfingerproteinfamilygenesmainlyincludedplantgrowthanddevelopmentelements，planthormoneresponseelements，andabioticstressresponseelements.Thetranscriptomedataofthewaterlogging-tolerantpepperGC41andthewaterlogging-sensitivepepperGC39underwaterloggingstresswereanalyzed.InGC41，CaC2H2-17andCaC2H2-87werehighlyexpressedat3dunderwaterloggingstress，whileCaC2H2-17andCaC2H2-87werenotexpressedinGC39.Inthisstudy，fivetranscriptionfactorsCaC2H2-16（Capana01g003556），CaC2H2-32（Capana04g001616），CaC2H2-72（Capana11g000176），CaC2H2-73（Capana11g000178），andCaC2H2-87（Capana12g000773）werescreenedout，andthesefivetranscriptionfactorsregulated419，526，566，305，and480differentiallyexpressedgenes，respectively.TheresultsofthisstudyprovideimportanttheoreticalbasisanddatasupportforthefunctionalanalysisofC2H2familymembersinCapsicumannuumL.andmolecularbreedingofwaterlogging-tolerantpepper.

Keywords：CapsicumannuumL.；C2H2-typezincfingerprotein；waterloggingstress；bioinformatics

鋅指蛋白（Zinc-fingerprotein，ZFP）是一類廣泛存在于真核生物中的轉(zhuǎn)錄因子，其多肽鏈通過結(jié)合鋅離子（Zn²⁺）形成穩(wěn)定的三維指狀結(jié)構^[1]，根據(jù)組氨酸（His）和半胱氨酸（Cys）殘基的不同位置和數(shù)量，大致可分為C2H2、C2H5、C3C3、C3HC4、C6、C8等類型^[2-3]。其中C2H2型鋅指蛋白參與植物的細胞分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控代謝、逆境脅迫響應等多種途徑^[4]。

辣椒（CapsicumannuumL.）作為起源于南美洲秘魯?shù)貐^(qū)的重要經(jīng)濟作物，在中國有400多年的種植歷史^[5]。目前，辣椒是中國播種面積和經(jīng)濟產(chǎn)值最大的蔬菜作物之一，貴州辣椒種植面積位列全國第一。辣椒屬于淺根性植物，根系較弱，吸收根數(shù)量較少，雖然其抗旱能力強，但耐澇能力較弱^[6]，貴州地處西南地區(qū)，降雨量多，水澇災害對辣椒種植影響較大，積水會導致辣椒植株死亡，產(chǎn)量降低，造成嚴重經(jīng)濟損失。因此，挖掘辣椒耐澇基因是當前辣椒耐澇育種的重要工作。

目前C2H2型鋅指蛋白已在多種植物中被鑒定，如擬南芥（Arabidopsisthaliana）^[7]、棉花（Gossypiumspp）^[8]、水稻（OryzasativaL.）^[9]、藍莓（Vacciniumspp.）^[10]、大麻（CannabissativaL.）^[11]、核桃（JuglansregiaL.）^[12]等。研究結(jié)果表明，C2H2型鋅指蛋白參與植物生長發(fā)育及響應非生物脅迫。如在擬南芥中，C2H2型轉(zhuǎn)錄因子AtIDD5參與了植物生長發(fā)育和逆境脅迫反應的調(diào)控^[13]，過表達SlCZFP1可增強轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐低溫能力^[14]、OsMSR15參與調(diào)控干旱脅迫下水稻生長發(fā)育相關基因的表達^[15]。在山新楊中，C2H2型鋅指蛋白PdZFP26基因過表達可提高植物耐鹽性^[16]。在蘋果中，C2H2型轉(zhuǎn)錄因子MdZAT10可抑制植物體對活性氧的清除能力，導致活性氧在體內(nèi)積累，從而降低植物的抗旱性^[17]。以上研究結(jié)果表明，在植物應對非生物脅迫的過程中，C2H2型轉(zhuǎn)錄因子既可通過正向調(diào)控發(fā)揮積極作用，也可通過負向調(diào)控降低植物的抗脅迫能力。

目前尚無關于C2H2型鋅指蛋白家族對辣椒澇脅迫響應機制的研究。因此，在辣椒中鑒定C2H2型鋅指蛋白并探究其在辣椒澇脅迫中的響應機制具有重要意義。本研究擬選用2種耐澇性不同的辣椒資源為試驗材料，基于全基因組進行生物信息學分析，并結(jié)合不同時期的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，系統(tǒng)探究辣椒C2H2型鋅指蛋白在辣椒澇脅迫響應中的作用。同時，預測可能參與澇脅迫響應的基因，為培育辣椒耐澇資源提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為耐澇辣椒資源GC41及澇脅迫敏感型辣椒資源GC39^[18]。試驗在貴州省貴陽市農(nóng)業(yè)科學院辣椒研究所貓坡塘大棚內(nèi)進行。2023年3月9日將耐澇辣椒資源GC41及澇脅迫敏感型辣椒資源GC39分別播種于漂盤中，采用漂浮育苗方式培育，待幼苗長至四葉一心時，移栽至營養(yǎng)缽（直徑7.5cm，高9.0cm）中，缽內(nèi)填充土壤和育苗基質(zhì)（2∶1，體積比）。幼苗培育至六葉一心后，選擇長勢一致的植株進行澇脅迫處理。

將植株置于藍色封底大盆（長65cm，寬48cm，高15cm）中，進行持續(xù)淹水處理，每天補水以保持水面始終高于土面2～3cm，水澇脅迫持續(xù)處理9d。9d后，停止水澇脅迫持續(xù)處理，將植株從水中移出，轉(zhuǎn)為常規(guī)管理，繼續(xù)培養(yǎng)3d。分別在水澇脅迫處理前、水澇脅迫處理3d、水澇脅迫處理6d、水澇脅迫處理9d、常規(guī)管理3d采集植株葉片，將葉片用純水清洗干凈后用液氮速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存，用于轉(zhuǎn)錄組測序。每個處理重復3次，每個重復選取10株植株進行檢測。

1.2辣椒C2H2基因的鑒定與理化性質(zhì)分析

從茄科基因組數(shù)據(jù)庫（SolGenomicsNetwork，https：//solgenomics.net/ftp/genomes/Capsicum_annuum/C.annuum_zunla/assemblies/）中下載Zunla-1辣椒基因組與注釋文件。從擬南芥TAIR數(shù)據(jù)庫（http：//www.aranidopsis，org）中下載擬南芥C2H2型鋅指蛋白氨基酸序列，將其作為參考序列構建文庫，在Zunla-1辣椒基因組數(shù)據(jù)庫中進行本地BLASTP比對，獲得辣椒C2H2候選基因。將候選基因提交到美國國家生物技術信息中心（NCBI）中的BatchCDDsearch、Swiss-Prot和InterPro數(shù)據(jù)庫進行比對和功能驗證。將驗證后的蛋白質(zhì)序列提交至ExPasy工具（http：//web.expasy.org/compute_pi），對C2H2型鋅指蛋白家族成員的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進行分析，包括氨基酸數(shù)量、相對分子量、理論等電點、不穩(wěn)定系數(shù)、親水性平均系數(shù)等。利用WOLFPSORT在線網(wǎng)站（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）預測辣椒C2H2型鋅指蛋白家族成員的亞細胞定位，以確定其在細胞內(nèi)的位置分布。

1.3辣椒C2H2型鋅指蛋白家族系統(tǒng)進化樹構建

通過MAFFT軟件對91個辣椒C2H2型鋅指蛋白（CaC2H2）成員的氨基酸序列進行序列比對，利用IQ-tree軟件采用最大似然法（Maximumlikelihood）構建辣椒C2H2型鋅指蛋白家族成員系統(tǒng)進化樹。所用模型為VT+F+R4，進行1000次重復驗證。利用在線工具ITOL對進化樹進行美化。

1.4辣椒C2H2型鋅指蛋白保守基序和基因結(jié)構分析

利用MEME網(wǎng)站（http：//meme-suite.org/meme/tools/meme）分析CaC2H2型鋅指蛋白的保守基序，設定最大基序數(shù)為10。利用軟件TBtools從基因組注釋文件中提取CaC2H2型鋅指蛋白編碼序列（CDS）。利用TBtools繪制CaC2H2型鋅指蛋白家族成員進化樹和分析基因結(jié)構。

1.5辣椒C2H2基因染色體位置分布和串聯(lián)重復鑒定

利用軟件TBtools從基因組文件與基因注釋文件中提取辣椒C2H2基因的染色體位置信息，并構建辣椒C2H2基因（CaC2H2）在染色體上的物理分布圖譜。利用軟件MCScanX計算分析辣椒C2H2在染色體上存在的串聯(lián)重復，定位在同一染色體200kb以內(nèi)共線性被鑒定為串聯(lián)復制。使用MCScanX軟件對CaC2H2基因在染色體上的串聯(lián)重復進行分析。串聯(lián)重復基因是指在同一染色體上多個序列連續(xù)重復出現(xiàn)且物理距離小于200kb的基因。共線性分析進一步揭示基因間的重復模式和進化關系。

1.6物種內(nèi)共線性分析

利用TBtools和MCScanX軟件對辣椒不同染色體間C2H2型鋅指蛋白家族成員的共線性基因?qū)M行計算分析。將分析結(jié)果導入Circos軟件構建辣椒染色體間的共線性關系圖。圖中紅色線條標注CaC2H2型鋅指蛋白家族成員之間的共線性基因?qū)?，直觀展示其在不同染色體上的共線性關系。

1.7物種間共線性分析

利用TBtools和MCScanX軟件對辣椒與擬南芥、水稻的C2H2型鋅指蛋白家族成員的共線性關系進行計算與分析。共線性分析結(jié)果用于繪制物種間共線性關系圖，以直觀展示不同物種間C2H2型鋅指蛋白家族成員基因組的保守性。圖中使用紅色線條標注辣椒與擬南芥、水稻的C2H2共線性基因?qū)Α?/p>

1.8啟動子區(qū)域順式作用元件

利用TBtools提取CaC2H2基因上游2000bp的序列作為啟動子序列，使用在線軟件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htm）進行順式作用元件預測分析。

1.9澇脅迫下辣椒C2H2型鋅指蛋白家族成員基因表達模式分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中辣椒C2H2型鋅指蛋白家族成員的每百萬映射片段的外顯子模型的每千堿基片段數(shù)（FPKM）值，利用TBtools軟件進行熱圖繪制，直觀展示基因在不同處理條件下的表達模式。

1.10澇脅迫下C2H2轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡分析

從前期轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中提取C2H2型鋅指蛋白家族成員在澇脅迫處理下5個時期的表達量。以q值＜0.05為標準篩選差異表達基因（DEG），對同一資源不同處理的差異表達基因取交集，并對2個辣椒資源的差異表達基因取并集。利用Samtools提取篩選出差異表達基因上游2000bp序列，并將其提交至PlantTFDB數(shù)據(jù)庫進行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預測，預測參數(shù)采用默認閾值。利用Gephi0.10.1（https：//gephi.org/）構建C2H2型鋅指蛋白家族基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡，為其調(diào)控機制的研究提供直觀參考。

2結(jié)果與分析

2.1辣椒C2H2型鋅指蛋白家族成員全基因組鑒定及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

如表1所示，在辣椒Zunla-1基因組中鑒定得到C2H2型鋅指蛋白家族成員91個，根據(jù)其在染色體上分布的位置順序命名為CaC2H2-01（Capana00g000052）～CaC2H2-91（Capana12g002763）。91個辣椒C2H2型鋅指蛋白氨基酸的數(shù)量為110～1288個，蛋白質(zhì)相對分子量為12172.36～141600.95，理論等電點為4.53～9.94，不穩(wěn)定系數(shù)為18.71～74.62，脂肪族指數(shù)為45.91～112.36，親水性平均系數(shù)為-1.214～-0.106。亞細胞結(jié)構定位預測結(jié)果表明，CaC2H2蛋白主要分布在細胞核中，僅有6個CaC2H2蛋白定位于其他位置（細胞質(zhì)、葉綠體及線粒體）。

2.2辣椒C2H2型鋅指蛋白家族基因染色體定位

為直觀展示出CaC2H2家族在染色體上的分布，根據(jù)辣椒基因組注釋文件，利用TBtools繪制C2H2型鋅指蛋白家族基因分布圖。如圖1所示，84個辣椒C2H2型鋅指蛋白家族基因分布在辣椒12條染色體上，其中11號染色體上分布的基因最多，共13個CaC2H2基因，10號染色體上分布的基因最少，僅有2個CaC2H2基因。其余7個CaC2H2基因未錨定至染色體。

2.3辣椒與擬南芥C2H2型鋅指蛋白家族基因進化樹分析

為研究辣椒和擬南芥C2H2型鋅指蛋白家族基因之間的進化關系，利用IQ-tree軟件基于最大似然法構建系統(tǒng)進化樹。如圖2所示，系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明，辣椒C2H2型鋅指蛋白家族基因可分為6個亞家族，分別命名為Ⅰ～Ⅵ，其中第Ⅵ亞族C2H2數(shù)量最多，為41個，第Ⅴ亞族C2H2數(shù)量最少，僅有2個。進一步分析結(jié)果表明，辣椒C2H2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥C2H2型鋅指蛋白在進化關系上表現(xiàn)出較近的親緣性。

2.4辣椒C2H2型鋅指蛋白家族基因結(jié)構及保守基序分析

如圖3所示，辣椒C2H2型鋅指蛋白家族基因含有10個不同的保守結(jié)構域，分別命名為Motif1～Motif10，系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明，同一亞族的基因具有相似的結(jié)構。其中，Motif3為C2H2型鋅指蛋白基因家族里分布最廣的結(jié)構域，共有39個CaC2H2基因含有Motif3，14個CaC2H2基因含有Motif3，表明Motif3在辣椒C2H2型鋅指蛋白家族中起關鍵性作用。辣椒C2H2型鋅指蛋白家族大部分成員基因中只含有1個編碼序列（CDS），少部分成員基因中含有多個CDS，其中CaC2H2-85中CDS數(shù)量最多，基因結(jié)構最復雜。

2.5辣椒C2H2型鋅指蛋白家族基因共線性分析

為了解釋C2H2鋅指蛋白的擴展機制，利用MCScanX程序?qū)蛑貜褪录M行分析，共鑒定出6對片段重復基因（圖4），分別為CaC2H2-28/CaC2H2-40（Capana03g003364/Capana06g000126）、CaC2H2-09/CaC2H2-48（Capana01g000620/Capana06g001668）、CaC2H2-30/CaC2H2-61（Capana04g000658/C￣a￣p￣a￣n￣a￣0￣8￣g￣0￣0￣2￣2￣45）、CaC2H2-43/CaC2H2-72（Capana06g000560/Capana11g000176）、CaC2H2-30/CaC2H2-86（Cap￣a￣n￣a￣0￣4￣g000658/Capana12g000772）、CaC2H2-39/CaC2H2-90（Capana05g002528/Capana12g002464）。

為進一步研究C2H2型鋅指蛋白家族的進化關系，本研究對雙子葉代表植物擬南芥和單子葉代表植物水稻與辣椒中C2H2型鋅指蛋白基因的共線性進行了分析（圖5）。在辣椒與擬南芥中發(fā)現(xiàn)了59對同源基因；在辣椒與水稻中發(fā)現(xiàn)了19對同源基因，表明C2H2型鋅指蛋白基因在進化過程中具有一定的保守性，并可能在植物的某些生物學功能中通過相同或相似的遺傳機制發(fā)揮作用。

2.6辣椒C2H2型鋅指蛋白家族基因啟動子區(qū)域順式作用元件分析

對辣椒中的91個C2H2基因上游2000bp片段的啟動子區(qū)域進行分析，分析結(jié)果表明，辣椒C2H2啟動子區(qū)域的順式作用元件可分為生長發(fā)育元件、激素響應元件及生物和非生物脅迫元件3大類（圖6）。大部分的辣椒C2H2基因富含光響應元件，如Box4、G-Box、GT1-motif等，表明辣椒C2H2可能參與光信號途徑調(diào)控，影響植物光形態(tài)建成。所有辣椒C2H2啟動子序列均含有至少一個激素響應相關元件，如ABRE（脫落酸響應元件）、ERE（乙烯響應元件）、CGTCA-motif（茉莉酸甲酯響應元件）、P-box（赤霉素響應元件）等，說明C2H2型鋅指蛋白家族基因可能通過調(diào)節(jié)植物激素響應途徑，參與抵抗逆境脅迫。所有的C2H2型鋅指蛋白家族成員啟動子序列均含有與生物和非生物脅迫響應相關的元件，且多數(shù)成員基因啟動子區(qū)域包含多個MYB、MYC結(jié)合位點，表明這些基因可能在響應干旱、澇害、冷害等非生物脅迫過程中起到積極作用。同時幾乎一半的辣椒C2H2型鋅指蛋白家族成員啟動子序列含有創(chuàng)傷修復響應元件，表明其可能在辣椒遭受外界損傷時參與修復。啟動子順式作用元件分析結(jié)果表明，辣椒C2H2型鋅指蛋白家族成員廣泛參與辣椒的生長發(fā)育過程，并在逆境脅迫響應中發(fā)揮重要作用。

2.7澇脅迫下辣椒C2H2型鋅指蛋白家族成員基因表達分析

為研究澇脅迫下辣椒C2H2型鋅指蛋白家族基因的表達模式，對耐澇辣椒資源GC41和澇脅迫敏感型辣椒資源GC39在澇脅迫下不同時期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析。如圖7所示，隨著澇脅迫處理時間的延長，在GC41和GC39中，CaC2H2-68、CaC2H2-74相對表達量升高，在澇脅迫處理9d時CaC2H2-68、CaC2H2-74相對表達量最高，恢復正常管理后，CaC2H2-68、CaC2H2-74相對表達量下降。在GC41中，CaC2H2-17、CaC2H2-87在澇脅迫處理3d時相對表達量高，CaC2H2-17、CaC2H2-87在GC39中未表達。

2.8辣椒C2H2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因預測

轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控基因的表達，在植物對環(huán)境脅迫的應答過程中發(fā)揮重要作用。為探究辣椒C2H2型鋅指蛋白與澇脅迫下差異表達基因的關系，本研究利用PlantTFDB數(shù)據(jù)庫對澇脅迫下5個時期共有的差異表達基因上游2000bp序列進行了轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的預測分析。根據(jù)預測結(jié)果篩選得到了5個差異表達的C2H2型鋅指蛋白家族基因成員基因，分別為CaC2H2-16（Capana01g003556）、CaC2H2-32（￣C￣a￣p￣a￣n￣a￣0￣4￣g￣001616）、CaC2H2-72（Capana11g000176）、CaC2H2-7￣3￣（￣C￣a￣p￣a￣n￣a￣1￣1g000178）、CaC2H2-87（￣C￣a￣p￣a￣n￣a￣1￣2￣g￣0￣0￣0￣7￣7￣3￣），這5個基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子分別調(diào)控了419個、526個、566個、305個、480個差異表達基因。進一步分析發(fā)現(xiàn)，其中有236個差異表達基因只受1個C2H2轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，307個差異表達基因受2個C2H2轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，275個差異表達基因受3個C2H2轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，123個差異表達基因受4個C2H2轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，26個差異表達基因受5個C2H2轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控（圖8）。

3討論

基因是調(diào)控植物生長、發(fā)育及抵抗逆境脅迫的重要因素，隨著基因組學與測序技術的發(fā)展，基因功能的研究已逐步從單個基因擴展到基因家族。C2H2型鋅指蛋白是植物中最大的核酸結(jié)合蛋白家族之一，其特有的鋅指結(jié)構域能與DNA、RNA、蛋白質(zhì)相結(jié)合，從而調(diào)控靶基因，參與植物脅迫響應、激素響應及生長發(fā)育等多種生物過程^[19-20]。目前，C2H2型鋅指蛋白家族已在擬南芥、水稻、油菜和甘藍等物種中被鑒定，本研究對辣椒C2H2型鋅指蛋白家族進行了鑒定和分析。

本研究基于Zunla-1辣椒基因組數(shù)據(jù)鑒定出91個C2H2型鋅指蛋白，系統(tǒng)進化分析可將其分為6個亞家族，其中第Ⅵ亞族成員最多，有41個。理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，91個成員的蛋白質(zhì)相對分子量、氨基酸數(shù)目、等電點等存在較大差異。亞細胞定位結(jié)果表明，大多數(shù)C2H2型鋅指蛋白定位在細胞核上，這與郭智濱等^[21]對大豆C2H2型鋅指蛋白家族鑒定的結(jié)果一致，與其作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因表達的功能相符。也有少數(shù)C2H2型鋅指蛋白定位在細胞質(zhì)、葉綠體上，表明這些成員可能存在其他特殊的功能，有待進一步研究分析。啟動子順式作用元件分析結(jié)果表明，辣椒C2H2啟動子區(qū)域富含調(diào)控植物生長發(fā)育、激素響應及生物和非生物脅迫的順式作用元件。生長發(fā)育元件包括G-box、GATA-motif、GT1-motif、I-box等；激素響應相關元件包括ABRE、CGTCA-motif、TGACG-motif、ERE等；脅迫響應元件包括ARE、MBS、LTR等。這表明CaC2H2型鋅指蛋白家族廣泛參與植物的生長發(fā)育及逆境脅迫應答過程，具有多種生物功能^[22-23]。

為探究辣椒C2H2型鋅指蛋白家族在澇脅迫下的表達模式，本研究對耐澇辣椒資源GC41和澇脅迫敏感型辣椒資源GC39的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析。分析結(jié)果表明，和澇脅迫處理前相比，大部分C2H2型鋅指蛋白在受到澇脅迫后表達量不同程度的上升。在GC41中，CaC2H2-17、CaC2H2-87在澇脅迫3d時相對表達量上調(diào)；而在GC39中，CaC2H2-17、CaC2H2-87在澇脅迫3d時未表達，推測這2個基因可能參與了辣椒對澇脅迫的正向響應，提高了辣椒的耐澇能力。為探究辣椒C2H2型鋅指蛋白與澇脅迫下差異表達基因的關系，對差異表達基因上游2000bp序列進行了轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的預測分析，篩選出CaC2H2-16（Capana01g003556）、CaC2H2-32（Capana04g001616）、CaC2H2-72（Capana11g000176）、CaC2H2-73（Capana11g000178）、CaC2H2-87（Capana12g000773）5個差異表達基因，這5個轉(zhuǎn)錄因子分別調(diào)控了419個、526個、566個、305個、480個差異表達基因。并且部分基因受多個轉(zhuǎn)錄因子的共同調(diào)控，表明CaC2H2型鋅指蛋白在澇脅迫應答中可能通過復雜的調(diào)控網(wǎng)絡發(fā)揮作用。前人發(fā)現(xiàn)，CaC2H2-72（Capana11g000176）、CaC2H2-87（Capana12g000773）參與了植物熱應激響應過程^[24]，表明其作為重要的熱應激因子可能通過調(diào)控下游基因表達提高植物的抗逆性。結(jié)合本研究的表達模式分析，推測CaC2H2-87可能通過調(diào)控下游基因參與辣椒的澇脅迫響應。

4結(jié)論

本研究通過生物信息學方法鑒定并分析了辣椒C2H2型鋅指蛋白家族成員，同時對其在澇脅迫處理下的表達模式進行了分析。研究結(jié)果表明，從辣椒基因組中共鑒定到91個C2H2型鋅指蛋白家族成員，其氨基酸數(shù)量為110～1288個，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為12172.36～141600.95，理論等電點為4.53～9.94。系統(tǒng)進化分析將其聚類為6個亞族，大部分成員定位于細胞核，少部分定位于細胞質(zhì)、葉綠體和線粒體。辣椒C2H2型鋅指蛋白家族與雙子葉代表性模式植物擬南芥親緣關系較近。C2H2基因啟動子區(qū)域內(nèi)主要的順式作用元件可分為生長發(fā)育元件、激素響應元件及生物和非生物脅迫元件。對耐澇辣椒資源GC41和澇脅迫敏感型辣椒資源GC39的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果表明，2個辣椒資源中C2H2型鋅指蛋白家族成員基因相對表達量存在差異，其中CaC2H2-17、CaC2H2-87在GC41澇脅迫處理3d時相對表達量上調(diào)，而在GC39中該基因未表達。本研究篩選得到CaC2H2-16、CaC2H2-32、CaC2H2-72、CaC2H2-73、CaC2H2-875個轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子分別調(diào)控了多個澇脅迫相關基因。推測這些CaC2H2轉(zhuǎn)錄因子可能通過調(diào)控澇脅迫響應相關基因的表達，在提高辣椒耐澇性方面發(fā)揮重要作用。本研究為辣椒耐澇性相關基因的挖掘奠定了基礎，并為C2H2家族成員的功能解析及耐澇辣椒資源的分子育種提供了重要的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

參考文獻：

[1]MILERJ，MCLACHLANAD，KLUGA.Repetitivezinc-bindingdomainsintheproteintranscriptionfactorIIIAfromXenopusoocytes[J].EMBOJournal，1985，4（6）：1609-1614.

[2]BERGJM，SHIYG.Thegalvanizationofbiology：agrowingappreciationfortherolesofzinc[J].Science，1996，271（5252）：1081.

[3]CUIHY，CHENJQ，LIUMJ，etal.Genome-wideanalysisofC2H2zincfingergenefamilyanditsresponsetocoldanddroughtstressinsorghum[Sorghumbicolor（L.）moench][J].InternationalJournalofMolecularSciences，2022，23（10）：5571.

[4]KAMJ，GRESSHOFFPM，SHORTERR，etal.TheQtypeC2H2zincfingersubfamilyoftranscriptionfactorsinTriticumaestivumispredominantlyexpressedinrootsandenrichedwithmemberscontaininganEARrepressormotifandresponsivetodroughtstress[J].PlantMolecularBiology，2008，67（3）：305-322.

[5]王楠藝，付文婷，吳迪，等.辣椒品質(zhì)研究進展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2022，50（16）：21-27.

[6]OULJ，DAIXZ，ZHANGZQ，etal.Responsesofpeppertowaterloggingstress[J].Photosynthetica，2011，49（3）：339-345.

[7]ENGLBRECHTCC，SCHOOFH，BOHMS.Conservation，diversificationandexpansionofC2H2zincfingerproteinsintheArabidopsisthalianagenome[J].BMCGenomics，2004，5（1）：39.

[8]唐玉萍，彭凡嘉，郭莉莉，等.陸地棉C2H2型鋅指蛋白全基因組鑒定及表達分析[J/OL].分子植物種，2024：1-23[2024-05-04].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20220317.1058.004.html.

[9]AGARWALP，ARORAR，RAYS，etal.Genome-wideidentificationofC2H2zinc-fingergenefamilyinriceandtheirphylogenyandexpressionanalysis[J].PlantMolecularBiology，2007，65（4）：467-485.

[10]李可，申朦曉，潘煒浩，等.藍莓C2H2家族基因在花芽休眠解除中的作用初探[J].園藝學報，2023，50（4）：737-753.

[11]劉美琦，孫偉，孟祥霄，等.藥用植物大麻C2H2基因家族鑒定與表達分析[J].藥學學報，2021，56（5）：1486-1496.

[12]馬乃膺，雒宏佳，李建紅，等.核桃Q型C2H2鋅指蛋白基因家族全基因組鑒定及表達分析[J].果樹學報，2022，39（6）：920-934.

[13]徐曉東，張國斌，李林倩，等.擬南芥C2H2型轉(zhuǎn)錄因子AtIDD5結(jié)構和功能的生物信息學分析[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2023，36（11）：2319-2328.

[14]ZHANGX，GUOXP，LEICL，etal.OverexpressionofSlCZFP1，anovelTFIIIA-typezincfingerproteinfromtomato，confersenhancedcoldtoleranceintransgenicArabidopsisandrice[J].PlantMolecularBiologyReporter，2011，29（1）：185-196.

[15]ZHANGX，ZHANGB，LIMJ，etal.OsMSR15encodingariceC2H2typezincfingerproteinconfersenhanceddroughttoleranceintransgenicArabidopsis[J].JournalofPlantBiology，2016，59（3）：271-281.

[16]馬姍姍，楊靜靜，曲德輝，等.過表達C2H2型鋅指蛋白基因PdbZFP26提高山新楊耐鹽性[J].林業(yè)科學，2023，59（1）：110-118.

[17]楊闊.蘋果C2H2型鋅指蛋白MdZAT10調(diào)控葉片衰老和干旱脅迫的機理研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2021.

[18]范高領，梁鄲娜，詹永發(fā)，等.辣椒種質(zhì)資源耐澇性評價體系構建與鑒定[J].辣椒雜志，2022，20（3）：1-8.

[19]李琳，丁峰，潘介春，等.植物鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族研究進展[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學，2020，40（2）：65-75.

[20]SOMMERRJ，RETZLAFFM，GOERLICHK，etal.Evolutionaryconservationpatternofzinc-fingerdomainsofDrosophilasegmentationgenes[J].PNAS，1992，89（22）：10782-10786.

[21]郭智濱，張亞坤，賀紫航，等.大豆C2H2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族全基因組鑒定及表達分析[J].大豆科學，2024，43（2）：139-150.

[22]WENGL，ZHAOFF，LIR，etal.ThezincfingertranscriptionfactorSlZFP2negativelyregulatesabscisicacidbiosynthesisandfruitripeningintomato[J].PlantPhysiology，2015，167（3）：931-949.

[23]CUIX，LUFL，QIUQ，etal.REF6recognizesaspecificDNAsequencetodemethylateH3K27me3andregulateorganboundaryformationinArabidopsis[J].NatureGenetics，2016，48（6）：694-699.

[24]王靜.辣椒種質(zhì)資源耐熱性評價及其對高溫脅迫響應機制的研究[D].長沙：湖南大學，2021.

（責任編輯：成紓寒）