桿狀病毒-昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)（IBEVS）表達(dá)的動(dòng)物病毒樣顆粒及疫苗研究進(jìn)展

收稿日期：2024-07-23

基金項(xiàng)目：蘭州市人才創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新項(xiàng)目（2020-RC-85）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31860696）；西北民族大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（31920190003）

作者簡(jiǎn)介：王炎（1998-），女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物病毒基因工程疫苗。（E-mail）wysakura616@163.com

通訊作者：柏家林，（E-mail）jlbai@xbmu.edu.cn

摘要：桿狀病毒-昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)（IBEVS）是一種高效的外源蛋白表達(dá)平臺(tái)，具有可以容納較大的外源基因片段、蛋白質(zhì)表達(dá)量較高、支持蛋白質(zhì)翻譯后修飾、操作簡(jiǎn)便且安全性較高等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛用于獸用疫苗生產(chǎn)。病毒樣顆粒（VLP）是一種由病毒蛋白自組裝形成的納米顆粒，由于缺乏病毒遺傳物質(zhì)，其安全性較高。VLP表面抗原排列高度有序，可有效誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，是一種新型的亞單位疫苗。本文綜述了IBEVS在動(dòng)物VLP疫苗中的應(yīng)用現(xiàn)狀，分析了當(dāng)前IBEVS存在的問(wèn)題及其解決策略，為動(dòng)物VLP疫苗的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供參考。

關(guān)鍵詞：病毒樣顆粒；桿狀病毒-昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)（IBEVS）；動(dòng)物病毒樣顆粒疫苗

中圖分類(lèi)號(hào)：Q939.47文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2025）01-0203-06

Researchprogressonanimalvirus-likeparticlesexpressedbyinsectcell-baculovirusexpressionvectorsystem（IBEVS）andvaccines

WANGYan^1，2，GAOWanning^1，2，F(xiàn)ANYiyang¹，YUMei²，ZHANGDerong¹，BAIJialin¹

（1.EngineeringResearchCenterforKeyTechnologyandIndustrializationofCell-basedVaccine，MinistryofEducation/BiomedicalResearchCenter，NorthwestMinzuUniversity/GansuTechInnovationCenterforAnimalCell，Lanzhou730030，China;2.SchoolofLifeSciencesandEngineering，NorthwestMinzuUniversity，Lanzhou730030，China）

Abstract：Theinsectcell-baculovirusexpressionvectorsystem（IBEVS）isahighlyefficientexpressionplatformforexogenousproteins.Ithasseveraladvantages，includingthecapabilitytoaccommodaterelativelylargeexogenousgenefragments，highlevelsofproteinexpression，supportforpost-translationalmodificationsofproteins，easeofoperation，andhighsafety.Duetotheseadvantages，ithasbeenwidelyusedintheproductionofveterinaryvaccines.Virus-likeparticles（VLPs）arenanoscaleparticlesthatareself-assembledfromviralproteins.Sincetheylackviralgeneticmaterial，theyexhibitahighdegreeofsafety.ThesurfaceantigensofVLPsarearrangedinahighlyorderedmanner，whichcaneffectivelyinduceanimmuneresponse.VLPsareanoveltypeofsubunitvaccine.ThisarticleprovidesacomprehensivereviewofthecurrentapplicationstatusofIBEVSinanimalVLPvaccines，analyzestheexistingproblemsofIBEVSandthecorrespondingstrategiesforsolvingthem，andoffersareferenceforthefurtherdevelopmentofanimalVLPvaccines.

Keywords：virus-likeparticles；insectcell-baculovirusespressionvectorsystem（IBEVS）；animalvirus-likeparticlevaccines

病毒樣顆粒（Virus-likeparticle，VLP）是由病毒的一種或多種結(jié)構(gòu)蛋白通過(guò)自組裝形成，具有類(lèi)似天然病毒結(jié)構(gòu)和大小的空心顆粒。由于其不具有遺傳物質(zhì)，不能在宿主體內(nèi)復(fù)制和增殖，因此不存在病原體感染和擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)，具有較高的安全性^[1]。與傳統(tǒng)滅活疫苗和減毒疫苗相比，VLP表面具有高度重復(fù)排列的抗原表位，因此免疫原性較強(qiáng)，能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)^[2]。作為一種亞單位疫苗，VLP表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。研究結(jié)果表明，在不同溫度儲(chǔ)存條件下，VLP仍能長(zhǎng)期保持較好的免疫效果^[3]。因此，針對(duì)動(dòng)物病原性病毒的VLP疫苗正被廣泛開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，成為預(yù)防動(dòng)物疫病的新方向，而合適的表達(dá)系統(tǒng)是確保VLP結(jié)構(gòu)完整性及高免疫原性的關(guān)鍵因素。

桿狀病毒-昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)（Insectcell-baculovirusexpressionvectorsystem，IBEVS）是一種成熟的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，它以桿狀病毒作為載體，通過(guò)感染昆蟲(chóng)細(xì)胞或幼蟲(chóng)表達(dá)外源蛋白。由于桿狀病毒只感染昆蟲(chóng)，具有較強(qiáng)的宿主特異性，因此用于制作哺乳動(dòng)物病毒樣顆粒疫苗時(shí)具有較好的安全性。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能容納相對(duì)分子量大的外源基因，甚至允許多個(gè)外源基因同時(shí)插入；昆蟲(chóng)細(xì)胞能夠在懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)，并能夠適應(yīng)無(wú)血清的培養(yǎng)條件，并且其蛋白質(zhì)翻譯后修飾和折疊特性與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相似，有助于保證蛋白質(zhì)功能的正確發(fā)揮^[4-5]?；谝陨咸攸c(diǎn)，IBEVS不僅適用于生產(chǎn)僅需表達(dá)衣殼蛋白即可完成自組裝的VLP，還可用于表達(dá)需多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白共同完成組裝的VLP。在應(yīng)對(duì)多種病原體血清型時(shí)，IBEVS能夠同時(shí)表達(dá)多個(gè)抗原表位以實(shí)現(xiàn)免疫保護(hù)^[6-8]。與傳統(tǒng)疫苗生產(chǎn)方式相比，IBEVS具有快速且大規(guī)模生產(chǎn)外源蛋白的優(yōu)勢(shì)，可迅速響應(yīng)疫情。目前，利用IBEVS成功生產(chǎn)的動(dòng)物病毒樣顆粒疫苗，如豬瘟疫苗和豬圓環(huán)病毒疫苗已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)^[4]。隨著IBEVS技術(shù)的發(fā)展，Bac-to-Bac系統(tǒng)具有操作便捷和能夠快速表達(dá)重組蛋白的優(yōu)勢(shì)，被廣泛用于實(shí)驗(yàn)室研究。為了提高IBEVS的外源蛋白表達(dá)效率，科學(xué)家不斷改進(jìn)桿狀病毒載體，相繼開(kāi)發(fā)出多種高表達(dá)系統(tǒng)。

1病毒樣顆粒的免疫機(jī)制

病毒樣顆粒（VLP）除了不含遺傳物質(zhì)外，其大小、結(jié)構(gòu)和形態(tài)特征都與天然病毒相似。VLP的大小為20～200nm，其幾何表面具有高度重復(fù)排列的抗原序列，能夠被抗原提呈細(xì)胞（Antigen-presentingcells，APC）識(shí)別并攝取，在組織相容性復(fù)合體Ⅱ類(lèi)（MajorhistocompatibilitycomplexesⅡ，MHCⅡ）的協(xié)助下，VLP被呈遞給CD4⁺T細(xì)胞，隨后CD4⁺T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子激活B細(xì)胞，被激活的B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞和記憶細(xì)胞，其中部分漿細(xì)胞分泌抗體，與VLP表面的抗原結(jié)合，產(chǎn)生中和作用^[9]。樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendriticcell，DC）作為APC的重要成員之一，可以識(shí)別并吞噬VLP，促進(jìn)自身成熟，同時(shí)刺激TNF-α和IL-1β等促炎因子的分泌。促炎因子進(jìn)一步募集更多APC參與免疫反應(yīng)。此外，DC表面還會(huì)表達(dá)淋巴細(xì)胞共刺激分子如CD80和CD86等，從而激活T細(xì)胞和B細(xì)胞，啟動(dòng)體內(nèi)的免疫程序^[1，10]。MCHⅠ類(lèi)分子可以通過(guò)交叉呈遞的方式將外源VLP提呈給CD8⁺T細(xì)胞，從而激活由CD8⁺T細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。總而言之，VLP疫苗會(huì)被體內(nèi)免疫細(xì)胞識(shí)別，從而激活先天免疫和適應(yīng)性免疫。作為新型亞單位疫苗，VLP疫苗強(qiáng)大而有效的免疫機(jī)制能保護(hù)機(jī)體免受病毒的感染和侵害^[11]。

2桿狀病毒-昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的動(dòng)物病毒樣顆粒及疫苗

2.1兔病毒性出血癥疫苗

兔病毒性出血癥（Rabbithemorrhagicdisease，RHD），俗稱(chēng)兔瘟，是由兔病毒性出血癥病毒（Rabbithemorrhagicdiseasevirus，RHDV）引起的一種急性、出血性且高致死性的傳染病^[12]。RHDV屬于杯狀病毒科兔病毒屬，其基因組是由7437個(gè)核苷酸組成的單鏈RNA病毒，病毒的核衣殼僅由結(jié)構(gòu)蛋白VP60構(gòu)成^[13]。目前，中國(guó)預(yù)防RHDV的疫苗多為組織滅活疫苗。然而組織滅活疫苗制作成本高且存在諸多缺點(diǎn)，如果病原體滅活不徹底，可能導(dǎo)致大范圍疫情爆發(fā)?；诖?，RHDVVLP成為新型亞單位疫苗的研發(fā)方向^[14]。由于RHDV僅有1個(gè)衣殼蛋白VP60，且該蛋白質(zhì)可在體外自聚合形成核衣殼，因此VP60是形成RHDVVLP的核心。

RHDVVLP最早在釀酒酵母中被成功表達(dá)，其產(chǎn)生的重組VP60蛋白大小和結(jié)構(gòu)與天然病毒相似，使用該重組蛋白免疫家兔，能夠有效預(yù)防RHDV感染。除了酵母系統(tǒng)，IBEVS也是被廣泛應(yīng)用的表達(dá)系統(tǒng)。具體操作：將RHDVVP60基因和RHDV2VP60基因插入pFastBacDaul載體，通過(guò)Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建桿狀病毒重組穿梭質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染懸浮昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9，利用桿狀病毒啟動(dòng)子pH和p10同時(shí)表達(dá)2種VP60蛋白，構(gòu)成RHDVVLP。但由于其表達(dá)量偏低，后續(xù)采用qBac系統(tǒng)（購(gòu)自陜西桿粒生物科技有限公司），將線性化桿粒qBac-ⅢG和pQBDual質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，通過(guò)桿粒自帶的綠色熒光基因觀察轉(zhuǎn)染效果，同時(shí)采用抗凋亡策略延長(zhǎng)蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)間。在未進(jìn)行密碼子優(yōu)化的條件下，qBac系統(tǒng)RHDVVP60蛋白表達(dá)量顯著高于Bac-to-Bac系統(tǒng)。將RHDVVLP制成疫苗后，可用于免疫家兔，誘導(dǎo)家兔體內(nèi)產(chǎn)生具有中和能力的抗體，有效抵御RHDV感染。除了作為新型基因工程疫苗外，RHDVVLP還可作為遞送載體，用于開(kāi)發(fā)癌癥治療性疫苗。

2.2犬細(xì)小病毒疫苗

犬細(xì)小病毒（Canineparvovirus，CPV）屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，是一種無(wú)包膜的線性單鏈DNA病毒，其基因組全長(zhǎng)5.2kb，可引起犬類(lèi)病毒性腹瀉，該病毒具有高度傳染性和致命性^[15]。目前，接種疫苗是預(yù)防CPV傳播的主要手段。由于滅活CPV疫苗免疫原性較低，弱毒活疫苗被廣泛使用。弱毒活疫苗能夠提供有效的免疫保護(hù)，但也存在較高的感染風(fēng)險(xiǎn)以及潛在的免疫失敗的問(wèn)題^[16]。

早期，犬細(xì)小病毒2型（CPV-2）是感染犬類(lèi)的主要亞型毒株，其核衣殼由VP1和VP2兩個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白組成，由于抗原基因的變異，CPV-2衍生出3種新毒株，分別是CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c，其中CPV-2c已成為主要流行毒株^[17]。VP2蛋白含有B細(xì)胞抗原表位，在CPV感染過(guò)程中，VP2蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體方面的作用。并且CPV-2的變異毒株（CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c）均因VP2蛋白基因突變而產(chǎn)生，所以VP2是開(kāi)發(fā)CPV病毒樣顆粒疫苗的最佳抗原^[18-19]。已有研究結(jié)果表明，將CPV的VP2基因插入Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)載體，利用重組桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，可形成與野生型CPV病毒相似的VLP。將該VLP制成疫苗后用于免疫小鼠，能夠誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高水平的中和抗體，從而提供免疫保護(hù)^[20-21]。

2.3口蹄疫疫苗

口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus，F(xiàn)MDV）是一種高度傳染性的病原體，可以引起豬、牛、羊等偶蹄動(dòng)物的口腔黏膜和蹄部等部位發(fā)生水泡性病變?？谔阋邔?duì)動(dòng)物健康和畜牧業(yè)發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅，常導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。FMDV基因組全長(zhǎng)8.3kb，是一種無(wú)囊膜的單股正鏈RNA病毒，其二十面體核衣殼由VP1、VP2、VP3和VP4這4種結(jié)構(gòu)蛋白組成^[22]。FMDV共有7種血清型，包括A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3和亞洲1型。這些血清型之間無(wú)交叉免疫保護(hù)，且在宿主與病毒長(zhǎng)期的共同選擇和進(jìn)化過(guò)程中，F(xiàn)MDV的受體位點(diǎn)發(fā)生突變，導(dǎo)致其感染能力和侵染方式發(fā)生改變。因此，在應(yīng)對(duì)口蹄疫大規(guī)模爆發(fā)時(shí)，急需一種比傳統(tǒng)疫苗更高效、更經(jīng)濟(jì)、更安全的新型亞單位疫苗，以滿(mǎn)足快速防治的需求^[23]。

最初研究結(jié)果表明，F(xiàn)MDVVLP可在重組桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)，但由于獲得的抗原量較少，所以免疫效果不如全病毒滅活疫苗^[24]。隨著研究的不斷深入，Li等^[25]利用家蠶桿狀病毒（Bm-P12A3C）作為載體，成功在家蠶細(xì)胞中表達(dá)了口蹄疫病毒（FMDV）的核衣殼蛋白前體P1-2A和3C蛋白酶，將其制成疫苗接種到牛體內(nèi)，能夠有效誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。Ruiz等^[26]等使用含有雙啟動(dòng)子的桿狀病毒載體表達(dá)FMDV核衣殼蛋白前體P1-2A和3C蛋白酶，從而提高FMDVVLP的表達(dá)水平。近年來(lái)，Chang等^[27]將O型FMDV的關(guān)鍵抗原表位8E8插入到牛乳頭瘤病毒（BPV）VP2VLP的可變區(qū)Ⅷ，并利用昆蟲(chóng)細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（IBEVS）表達(dá)出嵌合型病毒樣顆粒。這些嵌合型VLP用于免疫小鼠后，成功誘導(dǎo)了小鼠體內(nèi)強(qiáng)效的中和抗體反應(yīng)，能夠有效對(duì)抗口蹄疫病毒感染。

2.4豬圓環(huán)病毒2型疫苗

豬圓環(huán)病毒2型（Porcinecircovirustype2，PCV2）屬于圓環(huán)病毒屬圓環(huán)病毒科，是一種閉合環(huán)狀單鏈DNA病毒^[28]。PCV2是引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病的主要病原體，能夠在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞中復(fù)制增殖，具備對(duì)抗宿主先天免疫反應(yīng)的能力^[29]。PCV2的ORF2基因是編碼衣殼蛋白的關(guān)鍵基因，它存在多種變異。同時(shí)ORF2基因編碼的衣殼蛋白包含抗原表位，能夠被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別并誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，是目前商業(yè)化亞單位疫苗的首選蛋白^[30]。

已有研究結(jié)果表明，利用IBEVS表達(dá)PCV2的ORF2基因，形成的VLP可誘導(dǎo)產(chǎn)生PCV2特異性中和抗體，有效防止PCV2病毒血癥的發(fā)展^[31]。He等^[32]利用攜帶PCV2衣殼蛋白基因的重組桿狀病毒（IBEVS）感染Sf9細(xì)胞，隨后將Sf9細(xì)胞產(chǎn)生的病毒液注射到家蠶體內(nèi)，純化后觀察到自組裝形成的VLP，通過(guò)ELISA檢測(cè)，證明這些VLP具有免疫原性。相比之下，用原核表達(dá)系統(tǒng)未能形成PCV2VLP，進(jìn)一步說(shuō)明IBEVS是獲取PCV2VLP的最佳載體。隨著PCV2d亞型毒株取代PCV2b成為主要流行毒株，劉兆祿等^[33]利用IBEVS成功表達(dá)出PCV2d的衣殼蛋白，并且其能夠自聚形成與天然病毒粒子大小、形態(tài)一致的VLP，但其免疫原性還有待驗(yàn)證。Kang等^[34]將PCV2d的ORF2基因重組到桿狀病毒載體并感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，成功獲得PCV2dVLP。用該VLP免疫豬后，未發(fā)現(xiàn)任何臨床癥狀，同時(shí)豬體內(nèi)的免疫血清能有效中和其他PCV2亞型毒株，顯著降低病毒載量。

2.5雞傳染性法氏囊病疫苗

傳染性法氏囊病病毒（Infectiousbursaldisesevirus，IBDV）是一種對(duì)雞具有高度傳染性且引起免疫抑制的病原體，屬于雙股RNA病毒科雙股RNA病毒屬，是一種無(wú)囊膜RNA病毒。IBDV基因組一共編碼5種蛋白質(zhì)，VP1、VP2、VP3、VP4和VP5，其中VP2是病毒顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，可以引起宿主產(chǎn)生中和抗體，誘發(fā)先天免疫^[35]。IBDV具有很強(qiáng)的抗原變異性，變異主要集中的VP2區(qū)域，盡管傳統(tǒng)滅活疫苗和減毒疫苗在防治IBDV方面具有一定作用，但難以應(yīng)對(duì)重組變異毒株，所以IBDV仍然在全球范圍內(nèi)頻繁爆發(fā)^[36]。因此，急需開(kāi)發(fā)更有效的亞單位基因工程疫苗，而IBDV的VP2蛋白因其重要的抗原特性，被認(rèn)為是新型疫苗研發(fā)的最佳蛋白質(zhì)。

以前大多數(shù)研究者利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)IBDV的VP2VLP，并用于免疫家禽，而邵亞男^[37]利用IBEVS成功表達(dá)出IBDV的VP2VLP，并通過(guò)基因工程技術(shù)將新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NDV）的抗原表位基因與VP2基因融合，制備出IBDV-NDV嵌合型二聯(lián)病毒樣顆粒疫苗。免疫雞后，該疫苗不僅成功誘導(dǎo)了體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，還能夠有效抵抗IBDV和NDV的感染。嵌合型病毒樣顆粒疫苗的開(kāi)發(fā)也為禽類(lèi)傳染病的預(yù)防開(kāi)辟了新方向。

2.6鴨坦布蘇病毒疫苗

鴨坦布蘇病毒（Ducktembusuvirus，DTMUV）于2010年4月在中國(guó)首次爆發(fā)，造成蛋鴨和種鴨的大面積死亡，給鴨養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。DTMUV屬于黃病毒科黃病毒屬，是一種有包膜的單鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約為11kb，共編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白，其中囊膜蛋白E具有良好的免疫原性，是基因工程疫苗的首選蛋白質(zhì)。此外，將病毒前體膜蛋白prM基因與囊膜蛋白E基因串聯(lián)表達(dá)，不僅能夠增強(qiáng)囊膜蛋白E的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，還能提高其對(duì)DTMUV的免疫原性^[38-39]。

鄧雪霞^[39]將DTMUV的前體膜蛋白prM基因和囊膜蛋白E基因重組到pFastBac1桿狀病毒載體，轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲得DTMUVVLP。將該DTMUVVLP免疫櫻桃谷鴨和產(chǎn)蛋麻鴨，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)囊膜蛋白E抗原的特異性抗體，有效預(yù)防DTMUV的感染。為了解決養(yǎng)鴨業(yè)中鴨圓環(huán)病毒（Duckcircovirus，DuCV）和DTMUV的混合感染問(wèn)題，王也玨^[40]將DuCV的衣殼蛋白基因和DTMUV的prME基因共同插入pFastBacDual桿狀病毒載體，成功制備出可同時(shí)抵抗2種病毒感染的二聯(lián)疫苗。

3IBEVS在疫苗制備中存在的問(wèn)題及解決策略

IBEVS因其諸多優(yōu)點(diǎn)已被廣泛用于實(shí)驗(yàn)室VLP生產(chǎn)，但在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，IBEVS仍存在著一些不足，如蛋白質(zhì)表達(dá)量低、難以表達(dá)某些大分子蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)易降解。為了克服這些缺陷，多年來(lái)科學(xué)家們不斷改進(jìn)IBEVS的生產(chǎn)工藝，包括優(yōu)化表達(dá)載體、基因工程改造桿狀病毒基因組、改造宿主細(xì)胞，旨在提高外源蛋白的表達(dá)水平，從而降低生產(chǎn)成本。

3.1宿主系統(tǒng)的選擇

Sf9細(xì)胞來(lái)源于草地貪夜蛾蛹的卵巢組織，High-Five細(xì)胞來(lái)源于粉紋夜蛾卵巢組織，這2種細(xì)胞可以貼壁培養(yǎng)或者懸浮培養(yǎng)，已被廣泛用于病毒擴(kuò)增和蛋白質(zhì)表達(dá)。Sf9細(xì)胞通常用于桿狀病毒的擴(kuò)增，而High-Five細(xì)胞具有更高的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，以及更復(fù)雜的翻譯后修飾能力，如糖基化修飾、末端唾液酸化。在實(shí)際應(yīng)用中，可以在不同階段選擇適合的細(xì)胞系，以提高外源重組蛋白質(zhì)的表達(dá)效率。ExpiSf9^TM細(xì)胞是一種經(jīng)過(guò)優(yōu)化的昆蟲(chóng)細(xì)胞，在生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)時(shí)表現(xiàn)出高效性和穩(wěn)定性。高密度懸浮培養(yǎng)的ExpiSf9^TM細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)量是其他昆蟲(chóng)細(xì)胞的3倍。除了選擇高表達(dá)量的細(xì)胞外，抗凋亡策略也是提升蛋白質(zhì)表達(dá)效率的重要手段。昆蟲(chóng)細(xì)胞在凋亡時(shí)，胱天蛋白酶的活性會(huì)顯著增加。研究結(jié)果表明，通過(guò)RNA干擾（RNAi）降低胱天蛋白酶-1的表達(dá)量，可直接抑制胱天蛋白酶-1的活性，顯著提高重組蛋白的表達(dá)量^[41]。

3.2優(yōu)化桿狀病毒表達(dá)載體

目前，桿狀病毒表達(dá)載體的改造仍是IBEVS發(fā)展的主要方面。大多數(shù)桿狀病毒載體的啟動(dòng)子為晚期啟動(dòng)子或是極晚期啟動(dòng)子，如pFastBacDaul載體的pH啟動(dòng)子和p10啟動(dòng)子，pQB3的p6.3h啟動(dòng)子和polh啟動(dòng)子。由于昆蟲(chóng)細(xì)胞被桿狀病毒感染后很快死亡，而外源基因受到晚期啟動(dòng)子的調(diào)控，只能表達(dá)少量蛋白質(zhì)，所以使用桿狀病毒早期啟動(dòng)子有助于提高外源蛋白的表達(dá)量。研究發(fā)現(xiàn)，在pFastBacDaul載體相應(yīng)位置插入調(diào)控元件Hr1、Hr3、CAG、WPRE、SV40基因和Melt信號(hào)肽基因中的一種或幾種，能不同程度提高外源蛋白表達(dá)量^[42]。Orf46、Hr5、BSS和VP39等元件都可以增強(qiáng)pH啟動(dòng)子的激活能力。在桿狀病毒載體中引入抗凋亡基因p35可提高宿主的抗凋亡能力，刪除p10或p24等非必須基因都可以提高蛋白質(zhì)的表達(dá)量^[4，41]。FlashBac^TM、OmniBac表達(dá)系統(tǒng)被相繼研發(fā)出來(lái)，使原本難以表達(dá)的復(fù)雜蛋白質(zhì)得以高效生產(chǎn)。在Bac-to-Bac系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，Bac-2-the-Future系統(tǒng)通過(guò)載體改造提高了外源基因重組效率和外源蛋白表達(dá)能力^[43]。隨后，BIGBac、SmartBac和MultiBac系統(tǒng)相繼問(wèn)世并應(yīng)用于表達(dá)蛋白質(zhì)，為基礎(chǔ)研究和商業(yè)化生產(chǎn)提供了更高效的平臺(tái)。

3.3優(yōu)化培養(yǎng)工藝

感染復(fù)數(shù)、感染細(xì)胞的密度和收獲時(shí)間是IBEVS重要的參數(shù)。通常，選擇低劑量桿狀病毒感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的昆蟲(chóng)細(xì)胞，桿狀病毒會(huì)先感染少量細(xì)胞，隨后逐步感染剩余細(xì)胞，較長(zhǎng)的生物反應(yīng)時(shí)間有助于更充分地表達(dá)目標(biāo)蛋白^[14]。在蛋白質(zhì)生產(chǎn)過(guò)程中，蛋白酶的存在是導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)量降低的主要因素之一，適量添加蛋白酶抑制劑，可以有效減少重組蛋白的降解。此外，昆蟲(chóng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件比較特殊，探索昆蟲(chóng)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)代謝狀況，適時(shí)向反應(yīng)體系中補(bǔ)充昆蟲(chóng)細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是提升外源蛋白表達(dá)水平的有效策略。

4展望

近40年來(lái)，IBEVS不斷發(fā)展，已成為外源蛋白表達(dá)的重要平臺(tái)，并已用于疫苗生產(chǎn)?？茖W(xué)家仍在不斷優(yōu)化動(dòng)物VLP疫苗技術(shù)和后續(xù)疫苗制作工藝，具體方法包括，通過(guò)礦化技術(shù)改變VLP的表面特性，使疫苗產(chǎn)生交叉保護(hù)作用；利用SpyCatcher/SpyTag技術(shù)，將病毒的抗原蛋白固定在VLP表面，以高度密集的方式排列，從而增強(qiáng)抗原的免疫原性，激發(fā)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。這些技術(shù)進(jìn)一步提高了病毒樣顆粒疫苗的免疫原性、安全性和穩(wěn)定性，同時(shí)降低生產(chǎn)成本。，IBEVS有望成為高效防治動(dòng)物疫病的重要手段，為畜牧業(yè)的生產(chǎn)與發(fā)展提供強(qiáng)有力的支持。

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（責(zé)任編輯：成紓寒）