雞Fnip1基因克隆、組織表達及生物信息學分析

收稿日期：2024-07-10

基金項目：現代農業(yè)產業(yè)技術體系肉雞體系項目（CARS-41-Z21）；江蘇省種業(yè)振興揭榜掛帥項目[JBGS（2021）109）]；揚州市現代農業(yè)項目（YZ2023054）

作者簡介：黃正洋（1987-），男，河南信陽人，博士，副研究員，主要從事家禽遺傳育種研究。（E-mail）zyhuang@qq.com?？琢盍諡楣餐谝蛔髡?。

通訊作者：趙振華，（E-mail）zzh0514@163.com

摘要：為了明確雞卵泡素相互作用蛋白1基因（Fnip1）特征及其表達規(guī)律，本研究選擇蘇禽3號黃羽肉雞為試驗材料，運用分子克隆技術擴增了雞Fnip1基因CDS區(qū)序列全長，對其序列特性進行了生物信息學分析，構建了系統(tǒng)進化樹；利用RT-qPCR方法檢測了Fnip1基因在雞不同組織中的表達。結果獲得雞Fnip1基因CDS區(qū)，序列開放閱讀框為3474bp，位于第13號染色體16191415bp至16251731bp之間，編碼1157個氨基酸。生物信息學分析結果顯示，Fnip1基因有20個外顯子，FNIP1蛋白含有FNIP_N、FNIP_M和FNIP_C等3個結構域；進化樹顯示，雞先與鳥類聚為一類，再與哺乳動物聚為一支，在禽類上序列保守。FNIP1蛋白為親水性蛋白，相對分子量為128310，理論等電點為5.25。蛋白質二級結構由α-螺旋（34.40%）、β-折疊（4.06%）、延伸鏈（13.74%）、無規(guī)則卷曲（47.80%）組成。表達分析結果顯示，Fnip1基因在雞的胸肌和腿肌中表達量顯著高于其他組織。綜上所述，本研究獲得了雞Fnip1基因CDS區(qū)序列全長，發(fā)現其在雞肌肉組織中有較高表達。本研究結果可為進一步研究Fnip1基因在雞肌肉生長發(fā)育中的分子機制研究奠定數據支撐。

關鍵詞：雞；Fnip1；基因克?。槐磉_分析；生物信息學分析

中圖分類號：S831.2文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2025）01-0119-07

Cloning，tissueexpressionandbioinformaticsanalysisofchickenFnip1gene

HUANGZhengyang，KONGLinglin，WANGQianbao，LIChunmiao，WUZhaolin，HUANGHuayun，ZHAOZhenhua

（JiangsuInstituteofPoultryScience，Yangzhou225125，China）

Abstract：Toclarifythecharacteristicsandexpressionpatternsofchickenfollistatin-interactingprotein1gene（Fnip1），SuqinNo.3yellow-featheredbroilerswereselectedasexperimentalmaterialsinthisstudy，andthefull-lengthsequenceofchickenFnip1geneCDSregionwasamplifiedbymolecularcloningtechnology.Moreover，thebioinformaticsanalysisofitssequencecharacteristicswascarriedout，andthephylogenetictreewasconstructed.TheexpressionofFnip1geneindifferenttissuesofchickenswasdetectedbyRT-qPCR.TheresultsshowedthattheCDSregionofchickenFnip1genewasobtained.Theopenreadingframeofthesequencewas3474bp，whichwaslocatedbetween16191415bpand16251731bponchromosome13，encoding1157aminoacids.BioinformaticsanalysisindicatedthatFnip1genehad20exons，andFNIP1proteincontainedthreedomains：FNIP_N，FNIP_MandFNIP_C.Thephylogenetictreeshowedthatchickenswerefirstclusteredwithbirds，andthenclusteredwithmammals，andthesequencewasconservedinbirds.FNIP1proteinwasahydrophilicproteinwithasizeof128310andatheoreticalisoelectricpointof5.25.Thesecondarystructureoftheproteinwascomposedofα-helix（34.40%），β-sheet（4.06%），extendedchains（13.74%）andrandomcoils（47.80%）.TheexpressionanalysisshowedthattheexpressionofFnip1geneinchickenbreastmuscleandlegmusclewassignificantlyhigherthanthatinothertissues.Insummary，thisstudyobtainedthefull-lengthsequenceofthechickenFnip1geneCDSregionandfoundthatitwashighlyexpressedinchickenmuscletissue.TheresultsofthisstudycanprovidedatasupportforfurtherstudiesonthemolecularmechanismofFnip1geneinchickenmusclegrowthanddevelopment.

Keywords：chicken;Fnip1;genecloning;expressionanalysis;bioinformaticsanalysis

卵泡素相互作用蛋白1基因（Fnip1）是一種與腫瘤抑制蛋白卵泡蛋白和磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）結合的蛋白質編碼基因^[1-3]。有研究發(fā)現AMPK信號通路在機體肌肉纖維類型轉化以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過程中起著重要作用，對調控生物生長發(fā)育至關重要^[4-6]。FNIP1作為深度參與該信號通路的核心蛋白質，通過調節(jié)雷帕霉素信號通路（Targetofrapamycin，TOR）中的AMPK和靶標參與細胞代謝及營養(yǎng)傳感過程^[7]。FNIP1及其相關蛋白質與熱休克蛋白90結合，負向調節(jié)其ATP酶活性并促進其與卵泡素結合^[8]。FNIP1還與許多疾病的發(fā)生密切相關，包括免疫力缺陷、肥厚性心肌病等疾病^[9-10]。

Fnip1基因有多種功能，目前的研究主要集中在其能夠調控哺乳動物骨骼肌纖維類型轉換、機體器官癌癥的發(fā)生以及脂肪沉積導致的肥胖等^[11-13]。周啟程研究發(fā)現，通過選擇小鼠和C2C12細胞系作為試驗對象，分別建立肥胖誘導試驗模型，發(fā)現FNIP1蛋白在慢肌纖維比例降低過程中起著重要的作用，同時也發(fā)現使用二氫楊梅素可通過FNIP1抑制肥胖誘導的骨骼肌纖維類型轉換^[14]。付亮亮采用iTRAQ技術對飼料效率高低不同的豬骨骼肌差異表達蛋白進行篩選，發(fā)現miR-208b在肌肉中呈特異性表達，促進慢肌纖維的生成，調控肌肉纖維類型的轉換，其中Fnip1是miR-208b發(fā)揮功能的關鍵靶基因^[15]。劉靜^[16]通過小鼠和細胞試驗發(fā)現，Fnip1是miR-499靶基因，并且發(fā)現了miR-499/Fnip1在AMPK通路中調控能量代謝和肌纖維類型轉換。這些研究結果均表明，Fnip1基因在動物骨骼肌生長發(fā)育過程中，特別是骨骼肌纖維類型轉化以及能量代謝過程中發(fā)揮重要作用。另外，Fnip1基因在畜禽肌肉纖維類型轉換中也有重要作用，因此，在黃羽肉雞育種工作中研究Fnip1基因功能，可針對該基因的特性，充分利用其遺傳標記特點，縮短育種周期，提高育種效率。

目前，Fnip1基因已經在人以及豬、綿羊和火雞等動物中被克隆，本研究也運用克隆技術，成功克隆了雞Fnip1基因CDS序列全長，并對其核苷酸序列和其編碼的蛋白質氨基酸序列進行分析。為進一步研究Fnip1基因在雞肌纖維生長發(fā)育、纖維類型轉換及其在脂肪沉積中的功能等提供數據支持，為肉雞肌肉品質選育提供新路徑。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗以蘇禽3號肉雞為材料，在均一穩(wěn)定的環(huán)境下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)至10周齡時，隨機挑選5只屠宰采樣，采集胸肌、腿肌、心、肝、脾和肺等組織樣品，樣品于-70℃液氮中凍存?zhèn)溆?。主要試劑有TRIzolPlusRNAPurificationKit（美國英杰生命技術有限公司產品）、FastKing-RTSuperMix[天根生化科技（北京）有限公司產品]、PCR產物切膠回收試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司產品]、SYBRPremixExTaw及DNAMarkerDL5K（日本TAKARA公司產品）。

1.2引物設計與合成

根據NCBI數據庫中雞Fnip1基因的預測序列信息（登錄號：NM_001398212.1），并參考雞Fnip1基因DNA序列信息（登錄號：NC_052585.1），利用Oligo7.3軟件設計Fnip1基因CDS區(qū)克隆引物和qRT-PCR引物，如表1所示。

1.3總RNA抽提與cDNA合成

采用Trizol法提取各個組織總RNA，加入DNA酶去除基因組DNA雜質，測定RNA純度和完整性后進行反轉錄試驗。取2μg總RNA，根據試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。

1.4雞Fnip1基因CDS區(qū)克隆與測序

以反轉錄合成的cDNA為模板進行PCR反應，RT-PCR擴增雞Fnip1基因CDS區(qū)，反應總體系為50.0μL，其中cDNA模板2.0μL，10μmol/LFnip1-F1.0μL，10μmol/LFnip1-R1.0μL，PlatinumPCRSuperMix，HighFidelity45.0μL，ddH2O1.0μL。反應程序如下：94℃預變性2.0min；94℃變性30s，62℃退火30s，68℃延伸3.5min，38個循環(huán)；1.5%瓊脂糖電泳檢測PCR產物。對PCR產物的特異性條帶切膠回收，連接T載體，轉化到DH5α后克隆測序。

1.5Fnip1基因序列生物信息學分析

從NCBI數據庫下載常見畜禽Fnip1基因序列，分別為火雞（Meleagrisgallopavo：XP_010717557）、斑胸草雀（Taeniopygiaguttata：XP_030140124）、巖鴿（Columbalivia：XP_005503553）、朱鹮（Nipponianippon：XP_009462610）、黑天鵝（Cygnusatratus：XP_035416655）、家鵝（Ansercygnoides：XP_013031284）、牛（Bostaurus：XP_024850819）、山羊（Caprahircus：XP_017906211）、馬（Equuscaballus：XP_023473512），綿羊（Ovisaries：XP_027825758），藏獒（Canislupusfamiliaris：XP_038537369），家豬（Susscrofa：XP_020941073）、兔子（Oryctolaguscuniculus：XP_008253207）以及人（Homosapiens：NP_588613.2）。使用DNASTAR軟件進行序列分析。利用UCSC基因組瀏覽器分析雞Fnip1基因結構及在基因組中的定位。使用EMBL的序列比對工具ClustalOmega^[17]進行多序列比對分析。利用MEGA11.0軟件基于距離參數的鄰接法（NJ）^[18]構建系統(tǒng)進化樹。利用在線軟件ExPASy服務器上的ProtParam、ProtScale等程序對氨基酸序列的理化特性進行預測。利用SOPMA在線軟件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma_f.pl）^[17]對FNIP1蛋白二級結構進行分析。

1.6Fnip1基因組織表達分析

分別對各組織中的Fnip1基因和管家基因GAPDH進行qRT-PCR，引物見表1。qRT-PCR擴增體系：反應體系總體積為20.0μL：SYBRPremixExTap^TMⅡ（×2）10.0μL，PCRForwardPrimer（10μmol/L）0.8μL，PCRReversePrimer（濃度為10μmol/L）0.8μL，ROXReferenceDyeⅡ（×50）0.4μL，cDNA2.0μL，RNase-freedH2O6.0μL。反應程序如下：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火34s，72℃延伸20s，共40個循環(huán)。

1.7數據統(tǒng)計與處理

采用2^-△△Ct法進行組織表達分析。試驗結果用平均值±標準差來表示?；蛳鄬Ρ磉_差異量用SPSS28.0軟件進行顯著性檢驗，以P＜0.05作為差異顯著標準。

2結果與分析

2.1雞Fnip1基因CDS區(qū)克隆

雞Fnip1基因PCR結束后進行電泳分析，結果如圖1所示，獲得的PCR產物條帶大小約4000bp左右。切膠回收連接T載體，轉化DH5α培養(yǎng)，擴增后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

測序結果表明，Fnip1基因編碼區(qū)全長3474bp，將其上傳至GenBank（登錄號：MW770872），比對基因組序列后發(fā)現，雞Fnip1基因位于第13號染色體16191415bp至16251731bp之間。由20個外顯子剪切而成，編碼1157個氨基酸殘基。對雞Fnip1基因序列進行比對后發(fā)現，Fnip1基因至少有4個可變剪接體。

2.2雞FNIP1氨基酸序列分析及系統(tǒng)進化樹的構建

選取Fnip1基因序列進行標準翻譯后，進行多序列比對分析，結果顯示雞FNIP1蛋白氨基酸序列與火雞和鵝的同源性更高，分別為98.56%和95.17%，與其他哺乳動物的同源性較低。對雞FNIP1蛋白保守結構域進行預測，發(fā)現不存在信號肽序列，且存在3個結構域，分別是41～162氨基酸區(qū)間的FNIP_N結構域，291～538氨基酸區(qū)間的FNIP_M結構域，967～1153氨基酸區(qū)間的FNIP_C結構域，FNIP1蛋白擁有FNIP家族明顯特征。選擇15種脊椎動物代表性物種，使用EMBL多序列比對工具進行多序列比對分析。系統(tǒng)進化樹分析結果如圖2所示，雞與火雞先聚為一類，然后再與其他鳥類聚為一支，哺乳動物則聚為另外一支。

利用ExPASy的ProtParam軟件對雞FNIP1蛋白進行理化分析，結果如表2所示，雞FNIP1蛋白含有20個基本氨基酸，其中含量最高的是絲氨酸（11.93%），其次是亮氨酸（9.16%）；FNIP1蛋白分子式為C5578H8818N1554O1788S64，相對分子量為128310，理論等電點為5.25；利用ExPASy中ProtScale程序對蘇禽3號FNIP1蛋白的親疏水性進行分析，結果如圖3所示，第354位的異亮氨酸疏水性最強，為3.633分（最高分值為4.500），第221位的精氨酸親水性最強，為-3.422分（最低分值為-4.500），總平均親水性GRAVY值為-0.422，即FNIP1為親水型蛋白質。

對FNIP1蛋白二級結構進行預測，結果如圖4所示，FNIP1蛋白主要由α-螺旋（398個氨基酸殘基）、β-折疊（47個氨基酸殘基），延伸鏈（159個氨基酸殘基）和無規(guī)則卷曲（553個氨基酸殘基）組成，所占比例分別為34.40%、4.06%、13.74%和47.80%。

2.3雞Fnip1基因在不同組織中的表達

采用RT-qPCR方法檢測Fnip1基因在蘇禽3號肉雞不同組織中的表達，結果如圖5所示，Fnip1基因在腿肌和胸肌中的表達量顯著高于在心、肝、脾和肺等組織中的表達量（P＜0.05）。

3討論

家禽肌纖維類型與肌肉品質及生長速度密切相關，Fnip1基因在其他物種和細胞系上的功能已有較多研究。其主要功能是：FNIP1蛋白抑制熱休克蛋白-90（Hsp90）的三磷酸腺苷酶（ATP酶）活性，FNIP1連續(xù)磷酸化導致Hsp90ATP酶活性提高^[8，13]，FNIP1的磷酸化可阻止其與Hsp90的相互作用，從而促進FNIP1泛素化。Siggs等^[19]發(fā)現FNIP1的隱性功能喪失突變體會導致純合子小鼠具有嚴重的B細胞缺陷，該缺陷可通過抗凋亡蛋白Bcl2的過表達而部分恢復。Liu等^[20]以哺乳動物小鼠為試驗材料，研究發(fā)現內含子miR-499靶向作用于Fnip1基因，可能參與調控骨骼肌線粒體功能與肌纖維結構。通過在Fnip1基因敲除小鼠中特異性回補肌肉中的FNIP1蛋白，發(fā)現FNIP1協(xié)同調控了骨骼肌線粒體功能和肌纖維類型。該研究結果揭示了FNIP1是肌肉功能關鍵調節(jié)蛋白質，調控肌纖維類型轉換，決定骨骼肌健康，為增強肌肉健康以對抗各種代謝和肌肉疾病提供了新的線索。Baba等^[21]的研究結果表明，FLCN的C末端和FNIP1的300至1166位氨基酸是FLCN-FNIP1結合所必需的。本研究也發(fā)現雞FNIP1蛋白氨基酸序列包含3個保守結構域，分別為FNIP_N、FNIP_M和FNIP_C。FLCN和FNIP1可能通過AMPK和mTOR信號通路參與能量和/或營養(yǎng)感知。Hasumi等^[22]使用HEK293細胞的免疫共沉淀分析在FNIP1、FLCN和AMPK蛋白復合物中檢測到FNIP2。FNIP1和FNIP2形成同源和異源二聚體，進而發(fā)揮作用。

本研究聚焦Fnip1基因在蘇禽3號黃羽肉雞中的功能，了解其基因序列結構，分析其編碼蛋白質特征，研究其組織表達規(guī)律，發(fā)現Fnip1基因在雞肌肉組織（腿肌和胸肌）中的表達顯著高于心、肝、脾、肺等組織，且在鳥類中基因序列具有保守性，這在一定程度上表明，該基因在肌肉中發(fā)揮重要功能。結合Fnip1基因在其他哺乳動物中的研究結果，其功能與骨骼肌纖維類型轉換深度綁定，故而可推測其在雞骨骼肌類型轉換中同樣起著重要作用。

本研究以蘇禽3號肉雞為試驗材料，通過基因克隆方法獲得了雞Fnip1基因全長序列，并對其進行了生物信息學分析，構建了進化樹，發(fā)現雞Fnip1基因首先與鳥類聚為一類，再與哺乳動物聚為一支，在禽類上序列保守，這與傳統(tǒng)的生物進化認知是一致的。對Fnip1基因在不同組織中的表達進行分析，結果表明，Fnip1基因可能特異性地在雞肌肉生長發(fā)育中發(fā)揮關鍵作用，可作為育種中選擇不同生長類型品種或品系的標志物。在序列比對過程中發(fā)現，Fnip1基因至少存在4種可變剪接體，這說明該基因在雞的生長發(fā)育過程中發(fā)揮多種重要功能。下一步將繼續(xù)研究Fnip1基因在中國地方黃羽肉雞肌肉纖維類型轉換中的功能，建立Fnip1基因標記輔助選擇的方法，為優(yōu)質肉雞育種提供數據和方法支撐。

4結論

本研究通過基因克隆獲得雞Fnip1基因CDS區(qū)序列，序列全長3474bp，編碼1157個氨基酸殘基。構建進化樹后發(fā)現，雞Fnip1基因與鳥類的聚在一起。組織表達分析結果表明，Fnip1基因在腿肌和胸肌中有較高表達量。本研究結果為進一步研究Fnip1基因在雞肌肉生長中的機制提供了基礎數據支持。

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（責任編輯：黃克玲）