豬lncRNA5791的表達(dá)模式及互作蛋白質(zhì)分析

收稿日期：2024-06-25

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32172696）；國(guó)創(chuàng)中心先導(dǎo)項(xiàng)目（NCTIP-XD/B01）；黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程重大項(xiàng)目（CX23ZD06）

作者簡(jiǎn)介：張冬杰（1980-），女，黑龍江佳木斯人，博士，研究員，主要從事民豬資源研究。（E-mail）djzhang8109@163.com

通訊作者：劉娣，（E-mail）liudi1963@163.com

摘要：為了揭示冷刺激下lncRNA5791的應(yīng)答模式，本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）、核質(zhì)分離技術(shù)、RNA沉降（Pulldown）技術(shù)全面分析lncRNA5791生物功能。結(jié)果表明，lncRNA5791在冷刺激處理的民豬背部脂肪和腹股溝脂肪中相對(duì)表達(dá)量較高，在臀部脂肪中相對(duì)表達(dá)量較低。冷刺激處理后豬不同部位脂肪中l(wèi)ncRNA5791的相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于常溫對(duì)照（Plt;0.01）。lncRNA5791定位于豬的9號(hào)染色體，其在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布。在脂肪細(xì)胞增殖期，lncRNA5791的表達(dá)持續(xù)受到抑制；在脂肪細(xì)胞分化期，lncRNA5791的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。質(zhì)譜分析結(jié)果表明，lncRNA5791可能與膜聯(lián)蛋白A2（ANXA2）、泛素A52殘留核糖體蛋白融合產(chǎn)物1（UBA52）和組蛋白H4（H4）互作。本研究結(jié)果為揭示lncRNA5791在冷刺激應(yīng)答中的具體調(diào)控機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬；lncRNA5791；相對(duì)表達(dá)量；亞細(xì)胞定位；互作蛋白

中圖分類號(hào)：S828文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2025）01-0112-07

ExpressionpatternsandinteractingproteinanalysisofpiglncRNA5791

ZHANGDongjie，MAShouzheng，WANGLiang，LIUDi

（InstituteofAnimalHusbandry，HeilongjiangAcademyofAgriculturalSciences，Harbin150086，China）

Abstract：InordertorevealtheresponsepatternoflncRNA5791undercoldstimulation，thisstudycomprehensivelyanalyzedthebiologicalfunctionsoflncRNA5791byusingreal-timefluorescencequantitativePCRtechnology（qRT-PCR），nuclear-cytoplasmicseparationtechnologyandRNApull-downtechnology.TheresultsshowedthattherelativeexpressionleveloflncRNA5791wasrelativelyhighinthebackfatandinguinalfatofMinpigstreatedwithcoldstimulation，andrelativelylowintheglutealfat.TherelativeexpressionlevelsoflncRNA5791inthefatsofdifferentpartsofpigstreatedwithcoldstimulationwereallextremelysignificantlyhigherthanthoseofthenormaltemperaturecontrolgroup（Plt;0.01）.lncRNA5791waslocatedonchromosome9ofpigsandwasdistributedinboththenucleusandthecytoplasm.Duringtheproliferationperiodofadipocytes，theexpressionoflncRNA5791wascontinuouslyinhibited.Duringthedifferentiationperiodofadipocytes，therelativeexpressionleveloflncRNA5791showedatrendofincreasingfirstandthendecreasing.TheresultsofmassspectrometryanalysisindicatedthatlncRNA5791mightinteractwithannexinA2（ANXA2），ubiquitinA52residueribosomalproteinfusionproduct1（UBA52）andhistoneH4（H4）.TheresultsofthisstudylayanimportantfoundationforrevealingthespecificregulatorymechanismoflncRNA5791intheresponsetocoldstimulation.

Keywords：pig；lncRNA5791；relativeexpression；subcellularlocalization；interactingprotein

在哺乳動(dòng)物中，僅有1%～2%的DNA被轉(zhuǎn)錄成編碼蛋白質(zhì)的信使RNA（mRNA），而其余的DNA則被轉(zhuǎn)錄成非編碼RNA（Non-codingRNA，ncRNA）^[1]。長(zhǎng)度小于200nt的ncRNA被稱為小ncRNA（SmallncRNA，sncRNA），長(zhǎng)度大于200nt的則被稱為長(zhǎng)ncRNA（lncRNA）。lncRNA廣泛存在于真核生物中，具有較強(qiáng)的時(shí)間和空間特異性以及組織特異性^[2]。lncRNA在物種間保守性較差，參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、組蛋白修飾、DNA甲基化修飾等重要生命活動(dòng)^[3]。

脂肪是重要的代謝和內(nèi)分泌組織，也是機(jī)體主要的能量?jī)?chǔ)存部位。目前，對(duì)人類脂肪組織的研究主要集中在肥胖和糖尿病的治療方面，對(duì)家養(yǎng)動(dòng)物脂肪組織的研究主要集中在背膘厚^[4]、肌內(nèi)脂肪含量^[5]和抗逆性^[6]等方面。研究結(jié)果表明，lncRNA參與許多重要生物過(guò)程，包括脂肪分泌、脂質(zhì)代謝等。如lncRNAU90926可以通過(guò)調(diào)控PPAR信號(hào)通路及過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）調(diào)控脂肪沉積^[7]。lncRNAGm15290可以競(jìng)爭(zhēng)性吸附miR-27b，促進(jìn)脂肪關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）基因表達(dá)，從而調(diào)控脂質(zhì)代謝^[8]。與mRNA相比，lncRNA表達(dá)水平較低，且在物種間保守性較差；與miRNA相比，lncRNA序列較長(zhǎng)，能夠形成更為復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，lncRNA調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制也更復(fù)雜多樣。目前l(fā)ncRNA的作用機(jī)制尚未完全闡明。

民豬是中國(guó)華北型豬的主要代表之一，具有高繁殖力、產(chǎn)仔數(shù)多、抗寒和抗病力強(qiáng)、耐粗飼料、肉質(zhì)優(yōu)良的特點(diǎn)。本課題組利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)冷刺激民豬的脂肪組織中差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行鑒定與篩選，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)表達(dá)量上調(diào)7.8倍的lncRNA，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，將其命名為lncRNA5791^[9]。冷刺激會(huì)促進(jìn)脂肪細(xì)胞的能量代謝，改變其增殖分化模式。本研究擬利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)冷刺激民豬的生物學(xué)特征進(jìn)行分析，為揭示lncRNA5791在豬低溫應(yīng)答中的作用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

6頭6月齡體重相近的雌性民豬購(gòu)自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院民豬保種場(chǎng)。6頭民豬隨機(jī)分為常溫對(duì)照和冷刺激處理，每處理3頭。民豬均在室內(nèi)飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度控制在（18±2）℃，當(dāng)室外平均溫度降至-20℃時(shí)，將冷刺激處理民豬放于室外飼養(yǎng)，對(duì)照豬仍在室內(nèi)飼養(yǎng)。試驗(yàn)期間保證充足的飼糧和飲水，冷刺激3d后，集中屠宰所有民豬，分別取民豬背部脂肪、臀部脂肪、頸部脂肪、胸部脂肪、腹股溝脂肪和腹部脂肪，于-80℃冰箱保存。

1.2試劑

主要試劑有Trizol、SYBRPremixExTaqⅡ（TliRNaseHPlus）、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收純化試劑盒，UniversalDNA純化回收試劑盒、脂肪組織胞質(zhì)胞核分離試劑盒、TranscriptAidT7高產(chǎn)率轉(zhuǎn)錄試劑盒。

1.3RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

使用Trizol試劑提取民豬不同部位脂肪組織的RNA，利用NanoDrop2000amp;8000微量分光光度計(jì)檢測(cè)純度，利用安捷倫生物分析儀2100檢測(cè)RNA的濃度及完整性，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4lncRNA5791在民豬不同部位脂肪組織中的表達(dá)情況

為檢測(cè)冷刺激3d后lncRNA5791在民豬背部脂肪、臀部脂肪、頸部脂肪、腹股溝脂肪及腹部脂肪組織中的表達(dá)水平，本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）進(jìn)行檢測(cè)。依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的lncRNA5791基因序列（GenBank登錄號(hào)：XR_002335791），通過(guò)Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物（lncRNA5791F：5′-GACGCCTTGCTTGTACCTGA-3′；lncRNA5791R：5′-TGTGCCCTTTGACTCTTCCA-3′），引物由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：cDNA模板0.5μL，2×SYBRGreenPCRMixture10.0μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.5μL，滅菌水8.5μL。PCR反應(yīng)程序：95℃10min；95℃15s，60℃30s，72℃30s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，其引物序列為GAPDHF：5′-GGTGAAGGTCGGAGTGAACG-3′；GAPDHR：5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′。通過(guò)2^-△△Ct法計(jì)算lncRNA5791的相對(duì)表達(dá)量，△△Ct=△Ct冷刺激處理-△Ct對(duì)照，其中△Ct=CtlncRNA5791-CtGAPDH。

1.5lncRNA5791的染色體定位

依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的lncRNA5791序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物（lncRNA5791LF：5′-CCGAGGGAACCACCTACCGA-3′，lncRNA5791LR：5′-ACAACGATCATCACAACCCA-3′）。采用PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列后進(jìn)行克隆測(cè)序，并與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)分析，以確認(rèn)lncRNA5791在染色體上的定位。

1.6lncRNA5791的亞細(xì)胞定位

按照脂肪組織胞質(zhì)胞核分離試劑盒（Invent）說(shuō)明書(shū)分離細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。取120～150mg民豬背部脂肪組織，37℃解凍后切成2～3mm³小塊，放入無(wú)RNA酶的1.5mL離心管中，加入600μLN/C緩沖液和15μLRNA抑制劑，研磨2～3min后，全部轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管柱中，-20℃孵育20min，4℃、500g離心5min，棄離心管柱，4℃、100g離心5min，小心吸取上清液，加入1.5mL離心管中（無(wú)RNA酶），30μLPBS溶液重懸細(xì)胞核，完成細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的分離。使用MiniUniversalRNA提取試劑盒分別提取細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)RNA。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)lncRNA5791在脂肪細(xì)胞中的核質(zhì)分布情況，以GAPDH（主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)）和Neat1（主要在細(xì)胞核表達(dá)）作為對(duì)照，引物序列為Neat1F：5′-AGAGTGATGCCTGGTAGATGG-3′；Neat1R：5′-GTGGCTTCCTGTGAGTATTGG-3′。

1.7lncRNA5791在豬脂肪細(xì)胞增殖和分化階段表達(dá)特征分析

取實(shí)驗(yàn)室凍存的民豬前脂肪細(xì)胞，37～39℃溫水復(fù)蘇后接種至完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)12h首次收集細(xì)胞，之后每隔12h收集1次細(xì)胞，直到培養(yǎng)48h，待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%～100%時(shí)，加入脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ（5.0μg/mL胰島素，1.0μmol地塞米松，1.0μmol吲哚美辛，0.5μmol磷酸二酯酶抑制劑），誘導(dǎo)2d后，將脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ更換為脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅱ（5μg/mL胰島素），并于4d、6d、8d同一時(shí)間更換新的脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅱ，在每次更換培養(yǎng)基時(shí)收集細(xì)胞，直至誘導(dǎo)第8d。將所提RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-20℃。以cDNA為模板，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)lncRNA5791在脂肪細(xì)胞增殖期和分化期的表達(dá)情況。

1.8lncRNA5791互作蛋白的篩選與分析

以材料與方法1.5中克隆獲得的lncRNA5791片段為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得含有T7啟動(dòng)子的DNA粗產(chǎn)物，引物序列如下：lncRNA5791-正義鏈-F：5′-taatacgactcactatagggCCGAGGGAACCACC￣T￣A￣C￣C￣G￣A￣C￣C￣C￣A￣G￣C￣G￣G￣C-3′，lncRNA5791-正義鏈-R：5′-CATTTTTTATTTTTATTTTTATTTATTTT-3′（小寫(xiě)字母為T(mén)7啟動(dòng)子序列）。擴(kuò)增反義鏈的引物序列如下：lncRNA5791-反義鏈-F：5′-taatacgactcactatagggCATTTT￣T￣T￣A￣T￣T￣T￣T￣T￣A￣T￣T￣T￣T￣T￣A￣T￣T￣T￣A￣T￣T￣T￣T-3′，lncRNA5791-反義鏈-R：5′-CCGAGGGAACCACCTACCGACCCAGCGGC-3′。擴(kuò)增片段作為RNApulldown試驗(yàn)的陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)體系：10×BufferforKOD-Plus10μL，2mmoldNTPs8μL，25mmolMgSO44μL，100μm上下游引物各2μL，DNA模板2μL，1.0U/μLKOD-Plus2μL，加高純度水（DEPC）補(bǔ)至100μL。使用UniversalDNA純化回收試劑盒回收目的條帶。

以回收的目的條帶為模板，使用高產(chǎn)率轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系：DNA模板1μg，5×TranscriptAidReactionBuffer4μL，10mmolATP2μL，10mmol/LCTP2μL，10mmolGTP2μL，10mmolUTP2μL，T7enzymemix2μL。在37℃下反應(yīng)40min后加入1μLDNaseI，37℃孵育15min以去除殘余DNA，加入28μLDEPC水，5mol醋酸銨5μL混合均勻。加入60μL無(wú)水乙醇和1μLEDTA，于-20℃靜置1h，然后16000g離心10min，棄上清液后用70%乙醇漂洗沉淀，沉淀物晾干后，將沉淀物溶于20μLDEPC水，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA片段的大小。

嚴(yán)格按照Pierce^TMMagneticRNA-ProteinPull-DownKit試劑盒的操作說(shuō)明，獲取lncRNA5791與結(jié)合蛋白的復(fù)合物溶液。配制15mL分離膠（15%）和5mL濃縮膠（5%），進(jìn)行復(fù)合物溶液SDS-PAGE電泳，電泳條件：濃縮膠，80V電壓電泳30min；分離膠，120V電壓電泳60min，電泳結(jié)束后，將膠置于去離子水中清洗5min，棄掉清洗液，加入固定液，室溫下固定30min，隨后棄掉固定液，加入去離子水清洗2次，加入致敏液浸泡30min，棄掉致敏液后，加入去離子水清洗2次，加入染色液，室溫下染色20min，棄掉染色液，加入去離子水清洗2次，加入顯色液，顯色2min左右，溶液變渾濁后棄掉顯色液，加入新的顯色液直至出現(xiàn)清晰的目的條帶，清洗后拍照留存。

切下lncRNA5791正義鏈編碼蛋白質(zhì)與反義鏈編碼蛋白質(zhì)間存在差異的條帶，送到武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

2結(jié)果與分析

2.1lncRNA5791在不同部位脂肪組織中的表達(dá)情況

如圖1所示，lncRNA5791在冷刺激處理的民豬背部脂肪和腹股溝脂肪中相對(duì)表達(dá)量較高，在臀部脂肪中相對(duì)表達(dá)量較低。冷刺激處理豬不同部位脂肪中l(wèi)ncRNA5791的相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于常溫對(duì)照（Plt;0.01），但豬不同部位脂肪中l(wèi)ncRNA5791的相對(duì)表達(dá)量上升幅度存在差異。說(shuō)明冷刺激會(huì)誘導(dǎo)lncRNA5791在脂肪中的表達(dá)。

2.2lncRNA5791的染色體定位

以lncRNA5791LF/lncRNA5791LR為引物，PCR擴(kuò)增后獲得808bp目的片段，通過(guò)BLAST比對(duì)，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得1段與其序列相似度達(dá)99%的非編碼RNA序列，該序列位于9號(hào)染色體，與序列相似家族72成員A（FAM72A）和雙特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶3（DYRK3）等基因相鄰（圖2）。

2.3lncRNA5791的亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，lncRNA在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均有分布（圖3）。

2.4lncRNA5791在脂肪細(xì)胞增殖期和分化期的表達(dá)

由圖4可知，在細(xì)胞增殖期，lncRNA57910h時(shí)相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于12h、24h、36h、48h（Plt;0.05），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)相對(duì)表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。在細(xì)胞分化期，lncRNA5791相對(duì)表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在第4dlncRNA5791相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高，顯著高于0d、2d、6d、8d（Plt;0.05）。

2.5lncRNA5791互作蛋白的篩選

如圖5A所示，通過(guò)RNApulldown試驗(yàn)獲得與lncRNA5791互作的蛋白。質(zhì)譜分析結(jié)果（圖5B）表明，與lncRNA5791和陰性對(duì)照互作的蛋白質(zhì)分別有91個(gè)和92個(gè)，與兩者共同互作的蛋白質(zhì)有59個(gè)。將與lncRNA5791互作的91個(gè)蛋白質(zhì)按照得分高低進(jìn)行排序，排名前10的蛋白質(zhì)如表1所示，從中去掉與陰性對(duì)照共有的蛋白質(zhì)，獲得的3個(gè)特異性蛋白質(zhì)分別為膜聯(lián)蛋白A2（ANXA2）、泛素A52殘留核糖體蛋白融合產(chǎn)物1（UBA52）和組蛋白H4（H4）。

3討論

脂肪組織是一種富含脂肪細(xì)胞的特殊結(jié)締組織，可分為白色脂肪組織（WAT）和棕色脂肪組織（BAT）。脂肪組織不僅是儲(chǔ)存能量的場(chǎng)所，還是調(diào)控多種生理過(guò)程的重要代謝傳感器和內(nèi)分泌器官^[10]。機(jī)體遭受冷刺激后，BAT通過(guò)線粒體內(nèi)膜上的H⁺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白——解偶聯(lián)蛋白1（UCP1），以非顫栗性產(chǎn)熱的形式將儲(chǔ)存的能量轉(zhuǎn)化為熱量，從而維持體溫平衡^[11]。WAT可通過(guò)褐變?cè)鰪?qiáng)動(dòng)物對(duì)寒冷環(huán)境的耐受性。Zhang等^[12]發(fā)現(xiàn)，在寒冷季節(jié)，耐寒的蒙古綿羊肩胛和皮下的白色脂肪細(xì)胞直徑顯著增加，脂肪生成基因相對(duì)表達(dá)量顯著升高，腹膜和腎周的白色脂肪組織（WAT）發(fā)生季節(jié)性褐變。本課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)，冷刺激處理會(huì)改變民豬皮下脂肪組織基因的表達(dá)模式，且同一基因在不同部位脂肪中的表達(dá)存在差異^[13]。由于豬缺失UCP1基因，無(wú)法形成傳統(tǒng)意義上的褐色脂肪^[14]，其脂肪組織在冷刺激下的產(chǎn)熱機(jī)制仍有待進(jìn)一步探究。

本研究進(jìn)一步利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了lncRNA5791在不同部位脂肪的表達(dá)情況，結(jié)果表明其在民豬背部脂肪和腹股溝脂肪中相對(duì)表達(dá)量較高，在臀部脂肪中相對(duì)表達(dá)量較低，這與潘建飛等^[15]對(duì)巴馬豬的研究結(jié)果一致。說(shuō)明背部脂肪和腹股溝脂肪雖同為皮下脂肪，但對(duì)冷刺激的應(yīng)答模式存在差異。李倩文等^[16]研究發(fā)現(xiàn)，低溫誘導(dǎo)冬季藏豬腹股溝和肩胛處脂肪細(xì)胞呈現(xiàn)多腔脂滴形態(tài)，同時(shí)脂肪細(xì)胞褐變基因相對(duì)表達(dá)量顯著提高。Engelhard等^[17]研究發(fā)現(xiàn)，冷刺激處理小鼠肩胛部棕色脂肪（iBAT）中l(wèi)ncRNAGm1555表達(dá)受到抑制，相對(duì)表達(dá)量較低，在肩胛部白色脂肪（iWAT）中相對(duì)表達(dá)量中等；lncRNAGm1555在附睪白色脂肪（eWAT）中相對(duì)表達(dá)量較高。結(jié)合本研究結(jié)果綜合分析，lncRNA對(duì)冷刺激產(chǎn)生了應(yīng)答，但其在不同脂肪組織中的調(diào)控機(jī)制不同，導(dǎo)致其相對(duì)表達(dá)量存在差異。

lncRNA的調(diào)控作用與其亞細(xì)胞定位密切相關(guān)。大多數(shù)lncRNA定位于細(xì)胞核中，作為細(xì)胞核組織和功能的調(diào)節(jié)因子，參與基因轉(zhuǎn)錄、組蛋白修飾等生物過(guò)程；部分lncRNA則被輸出到細(xì)胞質(zhì)中，通過(guò)調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)翻譯效率發(fā)揮作用^[18]。此外，也有一些lncRNA可同時(shí)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)。例如lncRNAPYCARD-AS1是一種靶向促凋亡基因PYCARD的反義lncRNA。在細(xì)胞核中，它將DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（G9a）募集到PYCARD啟動(dòng)子區(qū)，以促進(jìn)DNA甲基化和組蛋白H3第9位賴氨酸殘基的二甲基化（H3K9me2）修飾。在細(xì)胞質(zhì)中，它與PYCARDmRNA相互作用，抑制核糖體的組裝和PYCARD的翻譯^[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA5791同時(shí)定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，但其具體作用機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步探究。

前脂肪細(xì)胞通過(guò)增殖和分化最終形成成熟的脂肪細(xì)胞，這一過(guò)程受到多條信號(hào)通路的調(diào)控，其中包含多種轉(zhuǎn)錄因子^[20]。lncRNA的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步完善了脂肪細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。有研究結(jié)果表明，lncBATE10通過(guò)與CUGBPElav樣家族成員1（Celf1）的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，減少過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（PGC-1α）的釋放，進(jìn)而促進(jìn)脂肪組織褐變^[21]。lncRNAMSTRG4710通過(guò)miR-29b-3p/IGF1軸正向調(diào)控脂肪細(xì)胞增殖和脂肪生成^[22]。在前脂肪細(xì)胞分化期，LncRNAAcart相對(duì)表達(dá)量迅速升高，LncRNAAcart過(guò)表達(dá)可加速脂肪細(xì)胞的增殖并減少細(xì)胞凋亡^[23]。本研究中，在脂肪細(xì)胞增殖期，lncRNA5791表達(dá)持續(xù)受到抑制；在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，lncRNA5791相對(duì)表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在第4d相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高。由此推測(cè)，lncRNA5791可能在抑制脂肪細(xì)胞增殖的同時(shí)，促進(jìn)脂肪細(xì)胞早期分化。

RNApulldown技術(shù)是檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白與其靶向RNA相互作用的主要技術(shù)。對(duì)于已知的互作蛋白，可通過(guò)免疫印記試驗(yàn)（Westernblotting）進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)于未知的互作蛋白，則需采用質(zhì)譜分析方法進(jìn)行鑒定。lncRNA5791是1個(gè)新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，本研究利用其反義鏈探針作為陰性對(duì)照，篩選到3個(gè)可能與其發(fā)生互作的蛋白。其中，ANXA2是一種鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，屬于膜聯(lián)蛋白家族，在細(xì)胞質(zhì)中以游離單體形式存在，參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及鈣調(diào)蛋白調(diào)控的膜相關(guān)生物活動(dòng)^[24]，泛素A52殘留核糖體蛋白融合產(chǎn)物1（UBA52）是一種高度保守的核質(zhì)分布蛋白，具有維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、調(diào)控基因表達(dá)及調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)等多種功能^[25]。組蛋白H4（H4）是染色體中含量最少的組蛋白之一，主要位于染色體的軸心位置，對(duì)染色體的穩(wěn)定性和DNA的包裝具有重要作用，同時(shí)還可結(jié)合特定轉(zhuǎn)錄因子以調(diào)節(jié)基因表達(dá)^[26]。本研究結(jié)果表明，在冷刺激下，lncRNA5791可能通過(guò)與這3種蛋白互作，參與調(diào)控鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)以及維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

4結(jié)論

lncRNA5791在冷刺激處理的民豬背部脂肪和腹股溝脂肪中相對(duì)表達(dá)量較高，在臀部脂肪中相對(duì)表達(dá)量較低。冷刺激處理后豬不同部位脂肪中l(wèi)ncRNA5791的相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于常溫對(duì)照（Plt;0.01）。lncRNA5791定位于豬的9號(hào)染色體，其在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布。在脂肪細(xì)胞增殖期，lncRNA5791的表達(dá)持續(xù)受到抑制；在脂肪細(xì)胞分化期，lncRNA5791的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，在第4d時(shí)相對(duì)表達(dá)量最高。lncRNA5791可能與膜聯(lián)蛋白A2（ANXA2）、泛素A52殘留核糖體蛋白融合產(chǎn)物1（UBA52）和組蛋白H4（H4）互作。

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（責(zé)任編輯：成紓寒）