辣椒炭疽病病原菌中分泌蛋白的預測及特性分析

收稿日期：2024-06-03

基金項目：天津市農(nóng)業(yè)科學院青年科研人員創(chuàng)新研究與實驗項目（2022011）；云南省“興滇英才支持計劃”青年人才專項（YNWR-QNBJ-2020-188）；天津市科技計劃項目（23ZYCGSN00220）

作者簡介：李明瑾（1992-），女，云南昆明人，碩士研究生，主要從事農(nóng)業(yè)資源利用與植物保護研究。（E-mail）1614950297@qq.com

通訊作者：霍建飛，（E-mail）hjf2203@163.com；韓長志，（E-mail）swfuhcz@163.com

摘要：由辣椒炭疽病病原菌引起的辣椒炭疽病嚴重危害著中國辣椒產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。分泌蛋白作為炭疽病病原菌中重要的致病因子，能幫助病原菌侵入寄主組織、分解寄主細胞壁，為病原菌生存和繁殖提供條件。然而，學術界尚缺乏對辣椒炭疽病病原菌中分泌蛋白的深入解析和研究。本研究基于前期獲得的辣椒炭疽病病原菌強致病菌株TJNH1全基因組序列，充分利用SignalP、ProtComp等生物信息學分泌蛋白預測軟件，對該病菌中13419條蛋白質氨基酸序列進行預測，同時，基于轉錄組測序數(shù)據(jù)，對上述分泌蛋白的功能及特性展開研究。結果表明，辣椒炭疽病病原菌菌株TJNH1中含有388個分泌蛋白，占總蛋白質數(shù)量的2.89%，分泌蛋白氨基酸序列長度介于55aa至730aa，非極性氨基酸丙氨酸（Ala）在分泌蛋白里使用頻率最高，分泌蛋白信號肽長度集中于17aa至21aa，信號肽切割位點為A-X-A型。分泌蛋白均為親水性蛋白，高親水性氨基酸和高疏水性氨基酸數(shù)量最多的分別是天冬酰胺（Asn）和丙氨酸（Ala），分泌蛋白大多為穩(wěn)定、酸性蛋白。同時運用SMART、eggNOG、STRINGV11.5等軟件對上述分泌蛋白的保守結構域、COG功能分類、蛋白質互作關系等進行分析，有152個分泌蛋白具有明顯的保守結構域，163個分泌蛋白獲得了功能注釋，32個分泌蛋白存在互作關系。該研究結果為明確分泌蛋白的功能和辣椒炭疽病病原菌的致病機理提供了理論支撐，也為篩選以分泌蛋白為靶標的新型農(nóng)藥和辣椒炭疽病綠色防控提供了理論依據(jù)。

關鍵詞：辣椒炭疽病病原菌；分泌蛋白；生物信息學分析

中圖分類號：S436.418.1+1文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2025）01-0041-10

Predictionandcharacteristicanalysisofsecretoryproteinsinpepperanthracnosepathogens

LIMingjin^1，2，HUOJianfei²，HANChangzhi¹，YAOYurong²，BENHaiyan²，HAOYongjuan²，WANGWanli²

（1.ForestryCollegeofSouthwestForestryUniversity/YunnanKeyLaboratoryofForestDisasterWarningandControl，Kunming650224，China;2.InstituteofPlantProtection，TianjinAcademyofAgriculturalSciences，Tianjin300384，China）

Abstract：PepperanthracnosecausedbythepathogensofpepperanthracnoseseriouslyendangersthehealthydevelopmentofpepperindustryinChina.Asanimportantpathogenicfactorinanthracnosepathogens，thesecretoryproteincanhelppathogensinvadehosttissues，decomposehostcellwalls，andprovidesurvivalandreproductionconditionsforpathogens.However，thereisstillalackofin-depthanalysisandresearchonthesecretedproteinsinthepathogensofpepperanthracnose.Inthisstudy，basedonthewholegenomesequenceofthestrongpathogenicstrainTJNH1ofpepperanthracnosepathogensobtainedinthepreviousstudy，13419proteinaminoacidsequencesinthepathogenwerepredictedbyusingbioinformaticssecretedproteinpredictionsoftwaresuchasSignalPandProtComp.Meanwhile，basedontranscriptomesequencingdata，thefunctionsandcharacteristicsoftheabove-mentionedsecretedproteinswerestudied.TheresultsshowedthatTJNH1contained388secretoryproteins，accountingfor2.89%ofthetotalproteins.Thelengthofaminoacidsequencesofsecretedproteinsrangedfrom55aato730aa.Thenon-polaraminoacidalanine（Ala）wasthemostfrequentlyusedinsecretedproteins.Thelengthofthesecretedproteinsignalpeptidewasconcentratedfrom17aato21aa，andthesignalpeptidecleavagesitewasA-X-Atype.Thesecretedproteinswereallhydrophilicproteins.Asparagine（Asn）andalanine（Ala）hadthelargestnumberofhighlyhydrophilicaminoacidsandhighlyhydrophobicaminoacids，respectively.Mostofthesecretedproteinswerestableandacidicproteins.Atthesametime，SMART，eggNOG，STRINGV11.5andothersoftwarewereusedtoanalyzetheconserveddomains，COGfunctionalclassificationandproteininteractionoftheabovesecretedproteins.Therewere152secretedproteinswithobviousconserveddomains，163secretedproteinswerefunctionallyannotated，and32secretedproteinshadinteractions.Theresultsofthisstudyprovideatheoreticalsupportforclarifyingthefunctionsofsecretedproteinsandthepathogenicmechanismsofpepperanthracnosepathogens，andalsoprovideatheoreticalbasisforscreeningnewpesticidestargetingsecretedproteinsandgreenpreventionandcontrolofpepperanthracnose.

Keywords：pepperanthracnosepathogens;secretedproteins;bioinformaticsanalysis

辣椒是中國常見的經(jīng)濟作物，也是重要的蔬菜品種，風味多樣、營養(yǎng)豐富，深受消費者喜愛。2020年，中國辣椒種植面積為7.375×10⁵hm²，產(chǎn)量為1.6681×10¹⁰kg，約占全球辣椒產(chǎn)量的46.16%，是全球最大的辣椒生產(chǎn)國^[1]。近年來，中國辣椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，已助力多個地區(qū)實現(xiàn)脫貧致富，然而隨著種植面積的不斷擴大，炭疽病、疫病等病害頻發(fā)，造成其產(chǎn)量和品質下降，嚴重制約了辣椒產(chǎn)業(yè)的高質量發(fā)展^[2]。

辣椒炭疽病是由炭疽菌引起的最具破壞性的真菌性病害之一，主要危害辣椒葉片和果實，引起葉片脫落和果實腐爛，嚴重影響辣椒的品質和產(chǎn)量^[3]。目前已報道的能引發(fā)辣椒炭疽病的炭疽菌有20多種，例如斯高維爾炭疽菌（Colletotrichumscovillei）^[4]、平頭炭疽菌（C.truncatum）^[5]、尖孢炭疽菌（C.acutatum）^[6]、松針炭疽菌（C.fiorinae）^[7]等。應該指出，C.scovillei是引發(fā)辣椒炭疽病的重要病原菌，在中國天津、四川、甘肅等地均有報道，對辣椒產(chǎn)量和品質均造成嚴重影響。前人研究發(fā)現(xiàn)，炭疽菌的致病機理是病原菌通過分泌系統(tǒng)將分泌蛋白傳輸至宿主植物組織中，分泌蛋白可以幫助病原菌在宿主植物組織內(nèi)定殖和侵染，進而引起發(fā)病，可見分泌蛋白是宿主植物與病原菌之間相互作用的關鍵因子，在病原菌入侵和危害寄主植物的過程中起重要作用^[8-9]。Prasanth等^[10]對甘蔗紅腐病病原菌（C.falcatum）的候選分泌蛋白進行比較轉錄組分析發(fā)現(xiàn)，病原菌入侵寄主植物是通過分泌蛋白輔助的，因此該研究把分泌蛋白確定為甘蔗紅腐病病原菌關鍵的致病因素。Inoue等^[11]對黃瓜炭疽病病原菌（C.orbiculare）的分泌蛋白基因進行敲除試驗發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)高表達的無宿主特異性分泌蛋白是病原菌侵染寄主植物的重要毒力因子。臧睿等^[12]基于全基因組數(shù)據(jù)對葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）的分泌蛋白進行預測，得到578個分泌蛋白的功能注釋，并篩選到11個與致病性緊密聯(lián)系的潛在分泌蛋白。邢啟凱等^[13]基于可可毛色二孢菌（L.theobromae）全基因組序列，通過生物信息學預測得到238個候選非經(jīng)典分泌蛋白編碼基因，經(jīng)反轉錄熒光定量PCR分析結果顯示，分泌蛋白參與了病原菌的侵染過程。

分泌蛋白作為植物病原真菌侵染植物的重要致病因子，在危害植物方面發(fā)揮著重要作用，不僅可以作為效應物參與侵染寄主過程以及觸發(fā)寄主防衛(wèi)反應，還可以改變寄主細胞的結構和功能^[14]。近年來，學術界對于分泌蛋白的預測主要采用生物信息學和計算生物學等方法，大多是結合多種生物信息學方法以提高預測的準確性和可靠性。為了明確辣椒炭疽病病原菌中分泌蛋白的特征情況，本研究基于辣椒炭疽病病原菌C.scovillei全基因組序列數(shù)據(jù)，根據(jù)分泌蛋白所具有的特征^[15]，利用生物信息學軟件對辣椒炭疽病病原菌的分泌蛋白進行預測，并對分泌蛋白進行理化性質分析和蛋白質功能分析，以期為揭示該病原菌侵染寄主植物過程中分泌蛋白的致病作用奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1辣椒炭疽病病原菌蛋白質氨基酸序列來源

辣椒炭疽病病原菌菌株TJNH1是從天津市寧河區(qū)感染炭疽病的辣椒果實中分離鑒定出來的^[16]，送至北京百邁客生物科技有限公司基于Nanopore技術進行了全基因組測序，然后通過NovaSeq6000獲得其轉錄組數(shù)據(jù)，并使用EVidenceModeler（EVM）對基因組進行注釋，得到13419個蛋白質編碼基因，其Assembly登錄號為GCA_011075155.1。

1.2辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白預測

植物病原菌分泌蛋白具有在N端含有信號肽、無跨膜結構域、無糖基化磷脂酰肌醇（GPI）錨定位點，且不定位于胞內(nèi)細胞器等典型特征。根據(jù)分泌蛋白的這些特征，利用SignalPv6.0^[17]、ProtCompv9.0、TMHMMv2.0分別預測蛋白質信號肽、亞細胞定位以及跨膜結構域，篩選出含有信號肽、定位于胞外且不具有跨膜結構的蛋白質。再用BIG-PIFungalpredictor和TargetPv2.0網(wǎng)站預測GPI錨定位點和細胞器蛋白質分析，去除具有GPI錨定位點的蛋白質和胞內(nèi)細胞器蛋白質，最終獲得分泌蛋白。

1.3辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白基本理化性質分析

利用TBtools-Ⅱ^[18]軟件的ProteinParamter功能進行蛋白質氨基酸數(shù)量、理論等電點及不穩(wěn)定系數(shù)分析；通過Expasy-ProtScale在線軟件進行蛋白質氨基酸親疏水性和最強親疏水性分析。

1.4辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白保守結構域分析

通過SMART網(wǎng)站在線分析辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白保守結構域。

1.5辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白功能注釋

利用eggNOG數(shù)據(jù)庫預測辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白的功能，并用COG直系同源蛋白質數(shù)據(jù)庫比對其功能進行注釋及分類。

1.6辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白互作分析

利用STRINGv11.5軟件對辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白進行蛋白質互作分析。

2結果與分析

2.1辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白特征預測

2.1.1信號肽預測信號肽是蛋白質氨基酸序列末端的一段疏水性氨基酸序列，用于引導新合成蛋白質向通路轉移。分泌蛋白所具有的典型特征是在N端具有信號肽，根據(jù)信號肽酶的不同，分泌蛋白信號肽類型也不同，SignalP6.0可以區(qū)分Sec/SPⅠ、Sec/SPⅡ、Sec/SPⅢ、Tat/SPⅠ和Tat/SPⅡ5種信號肽類型。在線預測網(wǎng)站對C.scovillei蛋白質氨基酸序列進行預測分析，結果表明C.scovillei的13419條蛋白質氨基酸序列中，有1717條蛋白質氨基酸序列具有典型的信號肽，占總蛋白質氨基酸序列數(shù)的12.8%，信號肽類型均為Sec/SPⅠ型（即由Sec易位子轉運并被信號肽酶Ⅰ切割的“標準”分泌信號肽）。進一步分析可知，信號肽長度多集中在17aa至22aa，占比65.4%，其中以19aa最多，為226個，占比13.2%；組成信號肽的氨基酸主要為丙氨酸、亮氨酸和絲氨酸，占比依次為21.2%、18.2%、10.2%。

2.1.2亞細胞定位預測對含有信號肽的1717個蛋白質進行亞細胞定位預測，結果發(fā)現(xiàn)定位在細胞外的蛋白質數(shù)量為415個，膜結合細胞外受體蛋白為676個，定位到質膜的蛋白質為230個，定位到線粒體的蛋白質為179個，定位到溶酶體的蛋白質為55個，定位到內(nèi)質網(wǎng)的蛋白質為53個，剩余蛋白質定位至細胞質、高爾基體、過氧化物酶體、細胞核、液泡中，分別為49個、29個、15個、9個和7個（表1）。

2.1.3跨膜結構域預測使用TMHMMv2.0網(wǎng)站對415個胞外蛋白質進行跨膜結構域分析，結果發(fā)現(xiàn)，有380個蛋白質沒有跨膜結構域，35個蛋白質有1個跨膜結構域。本研究延用前期課題小組篩選標準，選擇不含跨膜結構域和含有1個跨膜結構域的蛋白質，因此415個蛋白質都具有分泌蛋白特征。

2.1.4GPI錨點預測使用BIG-PIFungalpredictor網(wǎng)站對415條蛋白質氨基酸序列進行GPI錨點定位預測，結果顯示，有23條蛋白質氨基酸序列具有GPI錨點位點，3條蛋白質氨基酸序列由于氨基酸數(shù)量較少未能預測，剩余389條蛋白質氨基酸序列沒有GPI錨點。

2.1.5TargetPv2.0預測使用TargetPv2.0對389個沒有GPI錨定位點的蛋白質信號肽進行驗證分析，結果顯示，388個蛋白質具有信號肽特征，1個蛋白質不含信號肽，不含信號肽的蛋白質氨基酸序列編號為KAF4784779.1。通過上述分析，最終明確了辣椒炭疽病病原菌中具有典型特征的分泌蛋白數(shù)量為388個，占總蛋白質數(shù)量的2.89%（圖1）。薄淑文等^[19]對茶樹炭疽病病原菌、希金斯炭疽病病原菌中分泌蛋白進行研究，得到分泌蛋白數(shù)量占總蛋白質數(shù)量的2.14%和3.76%，本研究得到辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白數(shù)量占總蛋白質數(shù)量的2.89%，與薄淑文等的研究結果相符。

2.2辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白的理化性質

2.2.1辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白的氨基酸組成和數(shù)量運用TBtools-Ⅱ軟件的ProteinParamter對辣椒炭疽病病原菌388個分泌蛋白氨基酸序列進行分析，結果發(fā)現(xiàn)辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白的氨基酸數(shù)量在55aa至730aa之間，平均值為225.34aa，中位數(shù)為190.5aa，分泌蛋白的氨基酸數(shù)量主要分布于55～350aa，占比82.73%。其中位于101～200aa之間的有133條，占比34.27%；201～300aa之間有86條，占比22.16%。同時，對上述分泌蛋白氨基酸組成進行分析，排名前3的氨基酸為丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸，所占比例分別為10.1%、8.8%和7.6%，酸性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸含量為10.0%，堿性氨基酸賴氨酸、精氨酸和組氨酸含量為10.2%（圖2）。

2.2.2辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白的穩(wěn)定性和理論等電點通過對辣椒炭疽病病原菌中388個分泌蛋白的不穩(wěn)定性系數(shù)進行預測分析，結果發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定蛋白有265個，不穩(wěn)定蛋白有123個，穩(wěn)定蛋白占比68.30%。對辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白的理論等電點進行分析發(fā)現(xiàn)，理論等電點位于5.01～6.00的蛋白質數(shù)量最多，有113個，所占比例為29.12%；位于4.01～5.00的蛋白質數(shù)量位居第2，有95個，占比24.48%。理論等電點最低值為3.87，最高值為12.28，小于7.0的蛋白質為酸性蛋白質，數(shù)量為272個，占比70.10%。

2.2.3親疏水性運用ProtScale在線網(wǎng)站對分泌蛋白進行親疏水性分析，結果表明辣椒炭疽病病原菌388個分泌蛋白均為親水性蛋白，高親水性氨基酸殘基排名前3的為天冬酰胺、賴氨酸和天冬氨酸，數(shù)量依次為70個、41個和40個。高疏水性氨基酸殘基排名前3的為丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸，數(shù)量依次為113個、111個和43個（圖3）。

2.3辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白信號肽的特征

對辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白信號肽開展分析，結果發(fā)現(xiàn)辣椒炭疽病病原菌的分泌蛋白信號肽以19aa居多，所占比例為15.21%，信號肽長度多集中于17aa至21aa，所占比例為60.82%，組成信號肽的氨基酸殘基數(shù)量最多的為丙氨酸，占比21.92%，其次為亮氨酸，占比16.85%。此外，在信號肽切割位點的-3位、-2位、-1位、1位、2位和3位，氨基酸殘基數(shù)量最多的分別為丙氨酸、丙氨酸、丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸和蘇氨酸，所占比例為42.78%、18.56%、68.81%、23.45%、23.97%和10.05%（圖4）。由此可見辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白信號肽切割位點屬于A-X-A型，與課題組前期對禾谷炭疽病病原菌^[20]、希金斯炭疽病病原菌^[21]等分泌蛋白具有的信號肽酶切位點類型相同。

2.4辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白的保守結構域

蛋白質具有高度保守的結構域，這些結構域決定了蛋白質的功能，對辣椒炭疽病病原菌中388個分泌蛋白進行保守結構域預測分析，結果發(fā)現(xiàn)有152個蛋白質具有明顯的保守結構域，所占比列為39.18%。在辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白結構域中，有22個蛋白質含有糖苷水解酶（GH）保守結構域，分別是Glyco_hydro_6、Glyco_hydro_7、Glyco_hydro_11、Glyco_hydro_16、Glyco_hydro_20、Glyco_hydro_28、Glyco_hydro_42、Glyco_hydro_43、Glyco_hydro_61、Glyco_hydro_62、Glyco_hydro_20b、Glyco_hydro_20b2、Glyco_hydro_2_C，尤以含有Glyco_hydro_61保守結構域的蛋白質最多，數(shù)量為10個（圖5）。前人研究發(fā)現(xiàn)，碳水化合物活性酶是植物病原真菌分泌蛋白中的一類，而糖苷水解酶作為碳水化合物活性酶中重要的一類蛋白質可以降解植物細胞壁中的各種糖苷鍵，促進真菌進入植物細胞內(nèi)部，從而引發(fā)植物病害，根據(jù)其序列的差異程度進行分類，可分為173個家族^[22]。

有7個分泌蛋白含有PbH1保守結構域，PbH1（平行β-螺旋重復序列）是存在于許多碳水化合物裂解酶中的基序，例如果膠裂解酶和鼠李糖半乳糖醛酸酶，其功能與蛋白質互作相關；有7個分泌蛋白含有NPP1保守結構域，NPP1滲入擬南芥植物葉片會導致發(fā)病相關基因的轉錄、乙烯產(chǎn)生、胼胝質沉淀和HR樣細胞死亡等；有7個分泌蛋白含有Pectate_lyase保守結構域，Pectate_lyase果膠裂解酶是一種胞外酶，由果膠誘導，負責植物組織的浸漬和軟腐，與植物病害有關（圖5）。

有6個分泌蛋白含有CVNH保守結構域，CVNH是一種常見的糖類結合結構域，通常與糖類分子結合，參與許多生物過程，包括細胞附著、信號傳導和免疫反應等；有6個分泌蛋白含有Cutinase保守結構域，Cutinase脂質酶屬于水解酶，在植物病害發(fā)生中發(fā)揮重要作用，能促進真菌滲透植物角質層（圖5B）。辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白還含有纖維素酶、酪氨酸酶、肽酶等結構域，詳見表2。

2.5辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白的COG功能注釋

利用eggNOG-mapperv2在線數(shù)據(jù)庫對辣椒炭疽病病原菌的388條分泌蛋白氨基酸序列進行功能分類，得到注釋信息的有360條。通過COG功能對360條序列分類，去除197條未能分類的序列，剩下的163條蛋白質氨基酸序列被分為8類：S類（功能未知類）72條，G類（碳水化合物轉運代謝類）53條，O類（蛋白質翻譯后修飾和伴侶蛋白類）25條，E類（氨基酸轉運代謝類）4條，Q類（次生代謝物的生物合成、轉運和代謝類）3條，Z類（細胞支架）、M類（細胞壁/膜/包膜生物合成）、P類（無機離子轉運代謝）各1條（圖6）。除此之外，有的分泌蛋白氨基酸序列可以歸屬于兩類功能，如序列KAF4775845.1可歸屬于E類和O類，KAF4775908.1可歸屬于I類和Q類，KAF4779278.1可歸屬于O類和P類。

2.6辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白的互作

通過STRING在線軟件分析，在辣椒炭疽病病原菌388個分泌蛋白中有32個分泌蛋白存在互作關系，其余356個分泌蛋白不存在互作關系。

進一步分析，CFIO01_05008和CFIO01_06209屬于多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶，與CFIO01_03096、CFIO01_10030、CFIO01_04859、CFIO01_08715、CFIO01_05323、CFIO01_07341、CFIO01_03811、CFIO01_10717、CFIO01_00905、CFIO01_01745這10個蛋白質均有互作關系，而CFIO01_05008和CFIO01_06209之間無互作關系，CFIO01_03096、CFIO01_10030等10個蛋白質之間也無互作關系。STRING網(wǎng)站注釋信息顯示，CFIO01_10030、CFIO01_08715、CFIO01_05323、CFIO01_00905為果膠裂解酶，CFIO01_03096為果膠裂解酶C，CFIO01_01745為果膠裂解酶F，CFIO01_04859、CFIO01_07341為多糖裂解酶3家族成員，CFIO01_03811、CFIO01_10717為糖苷水解酶28家族成員。同時，同類別的蛋白質之間也存在互作關系，CFIO01_01717屬于糖苷水解酶7家族成員，與屬于糖苷水解酶6家族成員CFIO01_08570和糖苷水解酶5家族成員CFIO01_08588之間有互作關系，CFIO01_08570與糖苷水解酶61家族成員CFIO01_11829之間也有互作關系（圖7）。

通過分泌蛋白互作關系圖可見，CFIO01_05008和CFIO01_06209注釋信息和互作結果比較相似，本研究使用NCBI蛋白質數(shù)據(jù)庫Blastp比對再次驗證發(fā)現(xiàn)，這兩個蛋白質均為內(nèi)多聚半乳糖醛酸酶。內(nèi)多聚半乳糖醛酸酶是植物病原真菌分泌的一種酶，屬于聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）家族，主要功能包括降解植物細胞壁中的果膠，破壞細胞壁完整性以促進病原菌侵染，并可能參與真菌的營養(yǎng)吸收過程^[23]。

3討論

植物病原菌中分泌蛋白研究已成為植物病理學研究的熱點^[24-25]，植物病原真菌分泌蛋白具有纖維酶、蛋白酶等酶活性，可以分解植物細胞壁的主要成分，如纖維素等，從而破壞植物細胞壁的完整性，有利于病原菌的侵入^[26]。研究分泌蛋白有助于篩選植物病原菌中的關鍵致病基因，揭示病原菌的致病機理，對控制病害具有非常重要的作用。前期本課題組對核桃炭疽病病原菌（C.gloeosporioides）中的18412個蛋白質用生物信息學方法進行預測得到293個分泌蛋白，占總蛋白質數(shù)量的1.59%，核桃炭疽病病原菌分泌蛋白占比低于辣椒炭疽病病原菌的分泌蛋白占比，究其原因，可能是核桃屬于核果類木本植物，而辣椒是草本植物，二者的生長形態(tài)和生長環(huán)境不同，造成病原菌分泌蛋白數(shù)量有差異，后續(xù)將繼續(xù)開展其差異性研究。

本研究參考前期課題組對禾谷炭疽病病原菌等炭疽菌屬真菌采用的ProtComp在線預測軟件，對辣椒炭疽病病原菌1717個含有信號肽的蛋白質進行亞細胞定位預測分析，除了定位到胞外的415個蛋白質和其他細胞器的626個蛋白質外，有676個蛋白質亞細胞定位預測結果為膜結合細胞外受體蛋白。膜結合細胞外受體蛋白主要在細胞膜上起作用，如參與細胞信號傳導等，不同于胞外蛋白，在篩選分泌蛋白時，視為不具有分泌蛋白分泌到胞外的特征。但隨著生物信息學的發(fā)展，源源不斷的生物信息學軟件涌現(xiàn)出來，例如預測蛋白質的亞細胞定位就有ProtComp、WoLFPSORT、Cell-PLoc等十多個分析軟件，本研究并未再用其他亞細胞定位軟件對辣椒炭疽病病原菌的蛋白質進行驗證。

另外，在進行蛋白質結構域和蛋白質互作分析時，得到糖苷水解酶家族蛋白質注釋和蛋白質互作關系信息，前人研究結果表明，糖苷水解酶參與了植物病原菌在寄主植物中營養(yǎng)吸收和組織侵染等重要生物學過程，具體功能如何，有待后續(xù)進一步研究。

4結論

本研究通過對辣椒炭疽病病原菌全基因組序列預測及分析，明確了其分泌蛋白數(shù)量為388個，占總蛋白質數(shù)量的2.89%，分泌蛋白的氨基酸數(shù)量主要分布于55～350aa，大多為小分子蛋白質，組成分泌蛋白的氨基酸主要是丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸。分泌蛋白信號肽長度集中于17aa至21aa，所占比例為60.82%，信號肽切割位點為A-X-A型，組成信號肽的氨基酸殘基數(shù)量最多的是丙氨酸和亮氨酸，占比分別為21.92%和16.85%，疏水性氨基酸占比高能夠幫助信號肽在蛋白質合成過程中與細胞質膜上的信號識別，更利于其穿透質膜，運輸?shù)桨鈱崿F(xiàn)對寄主植物的侵染。辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白大多為穩(wěn)定蛋白，通過理論等電點分析可知，酸性蛋白占總分泌蛋白的70.10%。用ProtScale軟件預測388個分泌蛋白均為親水性蛋白，親、疏水性氨基酸殘基數(shù)量最多的分別為天冬酰胺、丙氨酸。

對分泌蛋白進行保守結構域分析，結果發(fā)現(xiàn)有152個蛋白質具有明顯的保守結構域，預測到GH、PbH1、NPP1、CVNH、Cutinase等結構域。前人研究結果表明，脂質酶、纖維素酶和果膠酶能夠分解植物表面的角質素、纖維素和果膠，從而幫助病原菌侵入寄主組織和細胞，這些保守結構域是辣椒炭疽病病原菌侵染的關鍵因子。利用eggNOG-mapper對分泌蛋白進行COG功能分類，可分為8類，除去功能未知的S類，剩余最多的分類是碳水化合物轉運代謝類（G類），這一類別大多是果膠酸裂解酶、纖維素酶等酶類。分泌蛋白互作關系分析結果顯示，有32個分泌蛋白存在互作關系，有不同類別蛋白質間的互作如多聚半乳糖醛酸酶和多糖裂解酶互作，也有同類蛋白質間的互作如糖苷水解酶7家族成員與糖苷水解酶6家族成員和糖苷水解酶5家族成員互作。以上結果表明，辣椒炭疽病病原菌分泌蛋白中含有大量降解植物細胞壁成分的酶類物質，為后續(xù)辣椒炭疽病病原菌致病機理的研究提供了理論支持。

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（責任編輯：黃克玲）