甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育的細(xì)胞學(xué)觀察及不育胞質(zhì)類(lèi)型鑒定

收稿日期：2024-03-17

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31860388），甘肅省科技重大專(zhuān)項(xiàng)（22ZD6NA009），甘肅省科技計(jì)劃項(xiàng)目（23CXJA0001）

作者簡(jiǎn)介：翟利佳（1998-），女，河南洛陽(yáng)人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)樽魑镞z傳育種。（E-mail）2779659163@qq.com

通訊作者：方彥，（E-mail）ffyv@163.com

摘要：為明確22N317A、22N195R2A和22LJ56A-22N286R1A3個(gè)細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）系甘藍(lán)型冬油菜花粉敗育機(jī)理及不育胞質(zhì)類(lèi)型，本研究以3組甘藍(lán)型冬油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及保持系為材料，通過(guò)觀察花器形態(tài)和細(xì)胞特征，并根據(jù)油菜育性相關(guān)基因orf138、orf222、orf224設(shè)計(jì)引物對(duì)3份甘藍(lán)型冬油菜不育胞質(zhì)類(lèi)型進(jìn)行多重PCR分子鑒定。結(jié)果表明：3個(gè)不育材料花瓣平展、花藥不可正常散粉、花絲短小、柱頭較長(zhǎng)。不育系花粉的發(fā)育受阻于四分體至單核小孢子期間；不育系常規(guī)壓片細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果顯示四分體之后未觀察到小孢子或者花粉粒；不育系石蠟切片顯微鏡觀察顯示花粉四分體時(shí)期絨氈層異常膨大，擠壓藥室里的四分體，使藥室變形，最終導(dǎo)致雄性不育。3個(gè)不育系的不育胞質(zhì)類(lèi)型均是OguNWSUAFCMS。

關(guān)鍵詞：甘藍(lán)型油菜；細(xì)胞質(zhì)雄性不育；花器形態(tài)；細(xì)胞學(xué)觀察；育性鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：Q343.3⁺4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2025）01-0021-07

CytologicalobservationandsterilecytoplasmtypeidentificationofcytoplasmicmalesterileBrassicanapusL.

ZHAILijia，YANGFurui，LIUZigang，WEIJiaping，CUIJunmei，WUZefeng，F(xiàn)ANGYan

（AgronomyCollege，GansuAgriculturalUniversity/StateKeyLaboratoryofAridlandCropScience/GansuKeyLabofCropImprovementandGermplasmEnhancement，Lanzhou730070，China）

Abstract：Inordertoclarifythepollenabortionmechanismandsterilecytoplasmtypeof22N317A，22N195R2Aand22LJ56A-22N286R1Acytoplasmicmalesterile（CMS）linesofwinteroilseedrape，threecytoplasmicmalesterilelinesandmaintainerlinesofwinteroilseedrapewereusedasmaterialsinthisstudy.Theflowermorphologyandcellcharacteristicswereobserved，andprimersweredesignedaccordingtothefertility-relatedgenesorf138，orf222andorf224ofoilseedrapeformultiplexPCRmolecularidentification.Theresultsshowedthatthepetalsofthethreesterilematerialswereflat，theantherscouldnotdispersepollennormally，thefilamentswereshortandthestigmaswerelong.Thedevelopmentofpollensofsterilelineswasblockedduringtheperiodfromtetradtomononuclearmicrospore.Theresultsofconventionalcytologicalobservationofsterilelinesshowedthatnomicrosporesorpollengrainswereobservedafterthetetrad.Paraffinsectionsofthesterilelineshowedthatthetapetumexpandedabnormallyduringthepollentetradperiod，squeezingthetetradintheantherchamber，causingtheantherchambertodeformandeventuallyleadingtomalesterility.ThesterilecytoplasmtypeofthethreesterilelineswasOguNWSUAFCMS.

Keywords：BrassicanapusL.;cytoplasmicmalesterility;shapeofflowerorgans;cytologicalobservation;fertilityidentification

雜種優(yōu)勢(shì)是生物界普遍存在的現(xiàn)象，利用雜種優(yōu)勢(shì)進(jìn)行新品種選育已經(jīng)成為作物產(chǎn)量和品質(zhì)提高的主要途徑。雄性不育系在作物雜種優(yōu)勢(shì)利用中發(fā)揮著重要作用。雄性不育按基因型可分為細(xì)胞核雄性不育、細(xì)胞質(zhì)雄性不育和核質(zhì)互作雄性不育。其中，細(xì)胞質(zhì)雄性不育（Cytoplasmicmalesterility，CMS）表現(xiàn)為花粉囊和小孢子發(fā)育異常，導(dǎo)致不能產(chǎn)生花粉或花粉敗育，但卵細(xì)胞發(fā)育正常，可接受外來(lái)花粉而正常結(jié)實(shí)，是母性遺傳，即細(xì)胞質(zhì)遺傳^[1]。細(xì)胞質(zhì)雄性不育是植物界普遍存在的現(xiàn)象，揭示作物細(xì)胞質(zhì)雄性不育的敗育機(jī)理、鑒定其不育類(lèi)型對(duì)不育系的利用具有重要意義。

傳統(tǒng)的作物細(xì)胞質(zhì)雄性不育類(lèi)型的培育與鑒定方法是雜交試驗(yàn)，這種方法工作量大、鑒定周期長(zhǎng)。蔡明等^[2]從甘藍(lán)型油菜（BrassicanapusL.）和埃塞俄比亞芥（BrassicacarinataBr）的遠(yuǎn)緣雜交后代中選育出NCa細(xì)胞質(zhì)雄性不育型（NCaCMS）材料。Wan等^[3]通過(guò)對(duì)野生芥菜雄性不育系的不斷連續(xù)回交，然后將該不育的細(xì)胞質(zhì)導(dǎo)入到甘藍(lán)型油菜中，進(jìn)而成功地選育出HauCMS材料。李殿榮^[4]在甘藍(lán)型油菜S74-3×（豐收4號(hào)+7207）的復(fù)交后代中發(fā)現(xiàn)了不育植株，并成功培育出不育系陜2A、保持系陜2B及其恢復(fù)系墾C1、墾C2等。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，根據(jù)特異性基因序列進(jìn)行PCR標(biāo)記成為作物細(xì)胞質(zhì)雄性不育類(lèi)型鑒定新的手段和工具。多重PCR能夠通過(guò)使用多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增許多靶基因^[5]，該技術(shù)已用于鑒定小麥同源糯性位點(diǎn)的突變類(lèi)型^[6]、洋蔥細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型^[7]。Zhao等^[8]利用多重PCR方法在油菜OguNWSUAFCMS不育胞質(zhì)材料中同時(shí)擴(kuò)增出orf138和orf222基因的條帶。舒暢^[9]利用多重PCR方法實(shí)現(xiàn)了NRO4270ACMS、PolCMS、OguCMS、KosCMS和WNJ01ACMS5種細(xì)胞質(zhì)不育材料的分子區(qū)分。

22N317A、22N195R2A和22LJ56A-22N286R1A是甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的3個(gè)甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料。為促進(jìn)上述材料的生產(chǎn)應(yīng)用，本研究以上述3個(gè)材料的不育系和保持系為材料，通過(guò)花器形態(tài)觀察、花粉細(xì)胞常規(guī)壓片和石蠟切片觀察及多重PCR方法，鑒定3個(gè)材料細(xì)胞質(zhì)雄性不育類(lèi)型，明確其敗育時(shí)期和敗育原因，為3個(gè)不育材料的合理利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與方法

本試驗(yàn)所用的雄性不育系材料22N317A、22N195R2A、22LJ56A-22N286R1A及其保持系材料22N317B、22N195R2B、22LJ56A-22N286R1B均由省部共建干旱生境作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室油菜課題組提供。試驗(yàn)材料種植于甘肅省平?jīng)鍪心虾?zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心油菜育種研究基地，每個(gè)材料種植2m²，60株，行距為30cm，株距為15cm，按當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)措施進(jìn)行田間管理。于油菜現(xiàn)蕾期和開(kāi)花期取不育系與保持系材料的油菜花朵各3朵，進(jìn)行花器形態(tài)觀察；根據(jù)花蕾長(zhǎng)度與花粉發(fā)育階段的關(guān)系（表1），于油菜現(xiàn)蕾期取花蕾長(zhǎng)度0～1.0mm、1.1～2.0mm、2.1～3.0mm、3.1～4.0mm、4.1～5.0mm不育系與保持系材料各10個(gè)花蕾新鮮樣品進(jìn)行不育系花粉細(xì)胞學(xué)觀察；于油菜3葉期，隨機(jī)選取不育系與保持系材料各10株取葉片進(jìn)行總DNA（gDNA）和線粒體DNA（mtDNA）提取，并通過(guò)多重PCR鑒定不育系的不育類(lèi)型。

1.2細(xì)胞學(xué)觀察

1.2.1常規(guī)壓片將現(xiàn)蕾期獲得的不育系與保持系不同長(zhǎng)度的花蕾，用鑷子將花蕾剝開(kāi)，取出1～2個(gè)花藥，置于載玻片上，并反復(fù)地輕輕擠壓花藥，使花粉母細(xì)胞溢出。使用吸管吸取1%的醋酸洋紅對(duì)花粉母細(xì)胞進(jìn)行染色2～3min，并去除花藥壁上的殘留雜質(zhì)。然后用蓋玻片蓋好染色花粉母細(xì)胞，使得染色液正好充滿載玻片和蓋玻片之間的間隙，形成一薄層，利用濾紙吸除蓋玻片四周的染料。在RVL-100-G正倒置一體熒光顯微鏡（美國(guó)ECHO公司產(chǎn)品）下進(jìn)行觀察。

1.2.2石蠟切片參照文獻(xiàn)[10]的方法對(duì)現(xiàn)蕾期不育系與保持系不同長(zhǎng)度的花蕾進(jìn)行石蠟切片觀察。切片時(shí)，打開(kāi)展片機(jī)并將其預(yù)熱至恒定的37℃，然后將包埋組織的蠟塊精確地切成4μm厚的均勻蠟片。展片時(shí)，將處理好的載玻片放入37℃的烘箱中過(guò)夜晾干，保存。封片時(shí)，用中性樹(shù)膠滴在封片后將其放入37℃的烘箱中過(guò)夜晾干。使用RVL-100-G正倒置一體的熒光顯微鏡進(jìn)行花蕾石蠟切片觀察。

1.3不育系不育胞質(zhì)類(lèi)型鑒定

采用CTAB法提取3個(gè)不育系3葉期葉片總DNA（gDNA），采用線粒體DNA（mtDNA）提取試劑盒（上海尚寶生物科技有限公司產(chǎn)品）提取線粒體DNA（mtDNA）。以3個(gè)不育系的mtDNA為模板及orf138、orf222、orf224、orf139等基因的引物^[11]（表2）對(duì)不育系不育胞質(zhì)類(lèi)型進(jìn)行鑒定。其中，引物1～3分別用于鑒定OguCMS、PolCMS和NapCMS3種不育胞質(zhì)類(lèi)型，引物4用于檢查總gDNA樣本中是否混有mtDNA。根據(jù)NCBI報(bào)道的油菜核不育基因MS2Bnap和BnMS1分別設(shè)計(jì)引物5和引物6，檢測(cè)mtDNA樣品中是否混有g(shù)DNA。單一引物PCR反應(yīng)體系總體積為11.0μL，包括不育材料mtDNA1.0μL，2×ProTaqMasterMix5.0μL，上下游引物各0.9μL，3.2μLddH2O。多重PCR反應(yīng)體系總體積亦為11.0μL，包括mtDNA1.0μL，2×ProTaqMasterMix5.0μL，OguCMS、PolCMS和NapCMS不育類(lèi)型擴(kuò)增基因orf138、orf222和orf224的上下游引物各0.3μL，3.2μLddH2O。單一引物PCR和多重PCR反應(yīng)程序均為：95℃預(yù)變性3min；94℃變性30s、54℃退火30s、72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取10μLPCR產(chǎn)物在1×TAEbuffer中使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行平板電泳分離。應(yīng)用溴化乙錠對(duì)條帶進(jìn)行染色，并在紫外線下觀察、拍照。

2結(jié)果與分析

2.1花器形態(tài)特征

從圖1可以看出，3組甘藍(lán)型冬油菜不育系與保持系之間花器官形態(tài)差異顯著。保持系和不育系花蕾數(shù)量相差不大，花瓣均較為平展。但保持系花絲較長(zhǎng)，花藥飽滿其中有很多成熟花粉粒，大部分花粉可以正常開(kāi)裂并散出；不育系花絲短小，柱頭高于花藥，花藥干癟弱小，發(fā)育異常，不能正常散粉，導(dǎo)致不育。

2.2花粉細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征

2.2.1常規(guī)壓片觀察的花粉細(xì)胞保持系22N317B和不育系22N317A花粉細(xì)胞常規(guī)壓片如圖2所示。保持系22N317B花粉母細(xì)胞經(jīng)過(guò)2個(gè)減數(shù)分裂周期形成四分體（圖2A），四分體周?chē)錆M了胼胝質(zhì)，胼胝質(zhì)逐漸消解后，四分體進(jìn)入單核早期，四分體釋放出單個(gè)圓形的小孢子，但細(xì)胞核不清晰（圖2B），接著進(jìn)入單核靠邊期，細(xì)胞核在細(xì)胞一側(cè)，細(xì)胞核此時(shí)清晰可見(jiàn)，整個(gè)細(xì)胞呈現(xiàn)三瓣?duì)顦?gòu)造（圖2C），最后細(xì)胞核經(jīng)過(guò)有絲分裂，形成大小不等的2個(gè)核，進(jìn)入雙核期，較大的細(xì)胞核位于細(xì)胞的中心，較小的細(xì)胞核位于細(xì)胞一側(cè)（圖2D），小孢子繼續(xù)生長(zhǎng)進(jìn)入花粉成熟期，花粉粒顏色較深，細(xì)胞核不清晰，形態(tài)趨于圓潤(rùn)充實(shí)（圖2E）。不育系22N317A經(jīng)2輪減數(shù)分裂形成規(guī)整的四分體結(jié)構(gòu)（圖2F），但在四分體之后并沒(méi)有觀察到小孢子或者花粉粒（圖2G），可能是四分體時(shí)期之后發(fā)生了降解，表明花藥很有可能在四分體至單核小孢子期間敗育。另外2組材料的花粉細(xì)胞發(fā)育的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征與其相似。

2.2.2石蠟切片觀察的花粉細(xì)胞保持系22N317B和不育系22N317A花粉細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的石蠟切片如圖3所示?？捎?2N317B花粉母細(xì)胞經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂形成四分體，絨氈層逐漸降解（圖3A），接著進(jìn)入單核小孢子晚期，細(xì)胞核偏移（圖3B），隨著絨氈層的降解花粉進(jìn)入成熟期，絨氈層消失，花粉粒變?yōu)闄E圓形，顏色變深，可以觀察到4個(gè)花粉囊，花粉囊開(kāi)裂，釋放花粉（圖3C）。不育株22N317A在四分體時(shí)期，絨氈層增大，絨氈層細(xì)胞內(nèi)含有大液泡，液泡將細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)擠到細(xì)胞一邊，使得細(xì)胞質(zhì)濃縮（圖3D），隨著進(jìn)一步的發(fā)育，未形成小孢子，且絨氈層進(jìn)一步增大，向內(nèi)擠壓四分體，藥室體積變小（圖3E），最后絨氈層和四分體全部消失，整個(gè)花粉囊萎縮（圖3F）。根據(jù)石蠟切片結(jié)果可知，不育系22N317A花粉細(xì)胞四分體后小孢子不能被釋放出來(lái)，同時(shí)絨氈層異常膨大，向內(nèi)擠壓四分體，致使藥室變形，最終導(dǎo)致敗育。另外2組材料的花粉細(xì)胞發(fā)育的結(jié)果與其類(lèi)似。

2.3mtDNA和gDNA的分離純化

以任一不育系gDNA和3個(gè)不育系mtDNA為模板，利用引物4對(duì)orf139基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的電泳圖譜如圖4A所示，從圖中可以看出，泳道1～4均出現(xiàn)500bp左右的條帶，說(shuō)明orf139的目標(biāo)片段在所有的mtDNA和gDNA樣本中都被擴(kuò)增到，因此說(shuō)明分離的gDNA中含有mtDNA，基因的特異性可以通過(guò)mtDNA模板表達(dá)出來(lái)。利用引物5和引物6分別對(duì)核基因MS2Bnap和核基因BnMS1進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的電泳圖譜如圖4B和圖4C所示，從圖中可以看出，圖4B和4C結(jié)果是相同的，均是泳道1出現(xiàn)1000bp左右的條帶，泳道2～4均沒(méi)有出現(xiàn)條帶，說(shuō)明以mtDNA作為模板沒(méi)有得到PCR產(chǎn)物，分離的mtDNA為gDNA的一部分。

2.4不育胞質(zhì)類(lèi)型

以不育系22N317A、22N195R2A、22LJ56A-22N286R1A的mtDNA為模板，利用引物1、引物2和引物3分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜如圖5所示。從圖中可以看出，利用引物1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，3個(gè)不育系材料擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜均出現(xiàn)465bp的條帶（圖5A）;利用引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，3個(gè)不育系材料擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜中均出現(xiàn)1102bp的條帶（圖5B）;而3個(gè)不育系材料引物3擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜中均沒(méi)有出現(xiàn)條帶（圖5C）。由于465bp、1102bp和747bp條帶分別是OguCMS、NapCMS和PolCMS不育胞質(zhì)類(lèi)型的分子標(biāo)記^[8]，因此單個(gè)引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜無(wú)法判斷3個(gè)不育系材料的不育胞質(zhì)類(lèi)型。

以不育系22N317A、22N195R2A、22LJ56A-22N286R1A的mtDNA作為模板，以引物1、引物2與引物3進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜如圖6所示。由圖可知，3個(gè)不育系材料都出現(xiàn)了465bp和1102bp特定組合的條帶。由于油菜不育胞質(zhì)類(lèi)型與各自PCR產(chǎn)物的特定組合有關(guān)，465bp和500bp條帶組合是OguCMS材料的特異性條帶組合，747bp和500bp條帶組合是PolCMS材料的特異性條帶組合，1102bp和800bp條帶組合是NapCMS材料的特異性條帶組合，465bp和1102bp條帶組合是OguNWSUAFCMS材料的特異性條帶組合^[8]。因此，本研究使用的3個(gè)不育系材料的不育胞質(zhì)類(lèi)型均為OguNWSUAFCMS。

泳道Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ：依次以不育系22N317A、22N195R2A、22LJ56A-22N286R1A的mtDNA為模板；泳道Ⅳ：以ddH2O為模板的陰性對(duì)照。

3討論與結(jié)論

3.13組甘藍(lán)型油菜不育系和保持系的花器官形態(tài)特征

花器作為作物的生殖器官，在不育系和可育系之間存在明顯的差異。王開(kāi)芳等^[12]研究結(jié)果表明，恢復(fù)系1831R植株開(kāi)花時(shí)，花藥較大，正常散粉，柱頭高度與花藥高度幾乎一致；而不育系105A的花藥小且干癟，無(wú)花粉，但雌蕊發(fā)育正常，雄蕊長(zhǎng)度不到花柱的一半。本研究的3個(gè)不育系材料花器官的形態(tài)與王開(kāi)芳等^[12]的研究結(jié)果一致。

3.2不育系花粉敗育發(fā)生的時(shí)期和敗育原因

花粉發(fā)育過(guò)程中，任何時(shí)期出現(xiàn)異常均會(huì)導(dǎo)致雄性不育花粉，花粉敗育發(fā)生的時(shí)期和原因存在較大差異^[13]。王開(kāi)芳等^[12]采用石蠟制片法，對(duì)甘藍(lán)型油菜雜交種青雜5號(hào)的雄性不育系105A及其恢復(fù)系1831R的小孢子發(fā)生和花藥發(fā)育過(guò)程進(jìn)行觀察，研究結(jié)果表明，在不育系105A花粉敗育過(guò)程中，一部分發(fā)生于造孢細(xì)胞時(shí)期；另一部分發(fā)生于單核晚期，其特點(diǎn)為單核晚期絨氈層細(xì)胞膨大向小孢子靠近，并逐步降解，其破裂胞質(zhì)退化殘余物侵入藥室，與小孢子混合粘連在一起，甚至有些絨氈層細(xì)胞整塊脫落，成為染色很深的團(tuán)塊狀物質(zhì)，占據(jù)藥室一部分空間，最終小孢子降解，花粉敗育。劉燕等^[14]通過(guò)石蠟切片顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜雄性不育系212A在孢原細(xì)胞階段遭受發(fā)育阻礙，沒(méi)有出現(xiàn)造孢細(xì)胞和花粉囊的分化。唐鑫等^[15]采用醋酸洋紅染色法和石蠟切片法對(duì)溫敏細(xì)胞核雄性不育系160S花藥進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察，結(jié)果表明160S屬花粉母細(xì)胞敗育型不育系，敗育時(shí)期發(fā)生在減數(shù)分裂期，絨氈層異常降解，絨氈層未向腺質(zhì)型轉(zhuǎn)化，不能提供花粉母細(xì)胞發(fā)育所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，致使花粉母細(xì)胞發(fā)育受阻，無(wú)法形成四分體結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致小孢子無(wú)法形成，花藥形成空的花粉囊，產(chǎn)生雄性不育。本研究通過(guò)常規(guī)壓片及石蠟切片觀察結(jié)果顯示，3個(gè)不育系材料的敗育時(shí)期為四分體至單核花粉粒期間，敗育的原因主要在于四分體時(shí)絨氈層細(xì)胞大液泡化且徑向增大，向內(nèi)擠壓四分體，最終導(dǎo)致藥室變形和花粉敗育。這與胡麗嬌^[16]研究的Ogura型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系大白菜的敗育機(jī)制一致。

3.33個(gè)不育系的不育類(lèi)型鑒定

植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育的機(jī)理與線粒體上特異基因的表達(dá)密切相關(guān)，不同的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系都有其特有的不育基因^[17-18]。線粒體基因組中orf138基因編碼orf138蛋白，引起OguCMS^[19]；而orf222和orf224基因的表達(dá)分別引起NapCMS和PolCMS^[20]。利用不育基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以得到該不育胞質(zhì)類(lèi)型特異性分子標(biāo)記^[21]，但單引物PCR往往不能準(zhǔn)確地確定油菜不育胞質(zhì)類(lèi)型，而通過(guò)多重PCR則可以快速區(qū)分不育胞質(zhì)類(lèi)型^[8]。張德雙^[22]用atp6基因和orf222基因引物組，通過(guò)多重PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了3種大白菜不育系的區(qū)分。李建斌等^[23]在6個(gè)結(jié)球甘藍(lán)CMS植株中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)單株中可以同時(shí)檢測(cè)到orf138基因和orf222基因，這結(jié)果表明該類(lèi)不育系可能是OguraCMS和NapCMS兩種類(lèi)型的雜合體。

本研究利用orf138、orf222、orf224基因的3對(duì)特異性引物，對(duì)22N317A、22N195R2A和22LJ56A-22N286R1A3個(gè)甘藍(lán)型冬油菜不育系mtDNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中都出現(xiàn)465bp和1102bp組合的條帶。因此，22N317A、22N195R2A和22LJ56A-22N286R1A3個(gè)不育系均為OguNWSUAFCMS。

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