整合指紋圖譜與多成分含量測(cè)定的益腎固精暖臍貼質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

〔摘要〕 目的 建立益腎固精暖臍貼高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜，并測(cè)定不同批次益腎固精暖臍貼中6種成分（桂皮醛、丁香酚、羥基-ɑ-山椒素、羥基-β-山椒素、母丁香酚、蛇床子素）的含量，為益腎固精暖臍貼質(zhì)量控制提供參考。方法 采用高效液相色譜法建立15批益腎固精暖臍貼指紋圖譜，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）篩選差異性成分，并對(duì)6種指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果 建立益腎固精暖臍貼HPLC指紋圖譜及6種指標(biāo)成分的含量測(cè)定方法，15個(gè)批次相似度范圍為0.874～0.999，標(biāo)定共有峰21個(gè)，指認(rèn)出6個(gè)色譜峰，篩選出12個(gè)差異性成分。15批益腎固精暖臍貼中6種成分含量穩(wěn)定。結(jié)論 建立的益腎固精暖臍貼指紋圖譜及6種成分的含量測(cè)定方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好，可用于益腎固精暖臍貼的質(zhì)量控制。

〔關(guān)鍵詞〕 益腎固精暖臍貼;指紋圖譜;含量測(cè)定;質(zhì)量評(píng)價(jià);相似度評(píng)價(jià);正交偏最小二乘法-判別分析

〔中圖分類號(hào)〕R284.1" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.01.008

Quality evaluation of Yishen Gujing Nuanqi Patch through integration of fingerprinting and multi-component content determination

LIAO Zhuo1，2， BAO Qing1， GAO Yuanhang1， LI Haiying2， WANG Lu2， TANG Lin2， YANG Lei2*

1. The First Clinical School of Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;

2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Abstract〕 Objective To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） fingerprint for Yishen Gujing Nuanqi Patch （YSGJNQP） and to determine the content of six components （cinnamic aldehyde， eugenol， hydroxy-ɑ-sanshool， hydroxy-β-sanshool， parent eugenol， and osthole） in different batches， so as to provide the reference for the quality control of YSGJNQP. Methods Fingerprints of 15 batches of YSGJNQP were established by HPLC. The similarity evaluation and orthogonal partial least square method-discriminant analysis （OPLS-DA） were used to screen out the differential components， and the content of six index components was determined. Results The HPLC fingerprint of YSGJNQP and the content determination method of the six index components were established. The similarity among 15 batches of samples ranged from 0.874 to 0.999， twenty-one common peaks and six chromatographic peaks were identified， and 12 differential components were screened out. The content of the six index components was found to be stable across the 15 batches of YSGJNQP. Conclusion The established HPLC fingerprint of YSGJNQP and the content determination method of its six components are accurate， stable， and reproducible. Consequently， it can be effectively used for the quality control of YSGJNQP.

〔Keywords〕 Yishen Gujing Nuanqi Patch; fingerprint; content determination; quality evaluation; similarity evaluation; orthogonal partial least square method-discriminant analysis

本實(shí)驗(yàn)方劑選自《攝生秘剖》卷四中的固精益腎暖臍膏，處方主要由肉桂、母丁香、蛇床子、花椒、韭菜子、附子、硫黃、麝香組成[1]。具有溫補(bǔ)脾腎、興陽(yáng)起痿、固護(hù)腎精之功效，用于治療男子精寒、陽(yáng)事痿弱、白濁遺精等癥。本課題組前期利用現(xiàn)代制劑技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)制劑進(jìn)行改良，創(chuàng)新性將藥物治療、穴位治療和灸法相結(jié)合，研制了一種新型穴位貼膏劑[2]。

益腎固精暖臍貼由多種中藥材組成中藥復(fù)方制劑，每一味中藥均含多種化學(xué)成分，各類成分之間相互作用從而形成了一個(gè)復(fù)雜的體系。單一或多指標(biāo)性成分含量測(cè)定難以體現(xiàn)中藥多成分整體作用優(yōu)勢(shì)。中藥指紋圖譜結(jié)合多指標(biāo)成分定量可全面反映化學(xué)成分的信息，為中藥質(zhì)量控制的有效分析方法[3-6]?；瘜W(xué)模式識(shí)別技術(shù)可以對(duì)指紋圖譜中的差異標(biāo)志峰進(jìn)行篩選[7-8]。二者結(jié)合能更加系統(tǒng)、全面、準(zhǔn)確地對(duì)益腎固精暖臍貼進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

本研究采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography， HPLC）建立益腎固精暖臍貼指紋圖譜，并結(jié)合相似度評(píng)價(jià)、正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least square method-discriminant analysis， OPLS-DA）對(duì)其進(jìn)行整體性評(píng)價(jià)及差異標(biāo)志物篩選，最后進(jìn)行多指標(biāo)性成分的含量測(cè)定，為益腎固精暖臍貼的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1" 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀、Poroshell 120色譜柱（4 μm，4.6 mm×150 mm）、Agilent TC-C18（5 μm，4.6 mm ×250 mm），均購(gòu)自美國(guó)安捷倫科技有限公司;SK5200H超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）;AUX-220型分析天平（日本SHIMADZU公司）。

1.2" 試劑與試藥

肉桂（批號(hào)：230402，產(chǎn)地：河北）、母丁香（批號(hào)：230403，產(chǎn)地：安徽）、麝香（批號(hào)：2022YR185，產(chǎn)地：四川）、花椒（批號(hào)：230702，產(chǎn)地：湖南）、附子（批號(hào)：230301，產(chǎn)地：甘肅）、蛇床子（批號(hào)：221201，產(chǎn)地：浙江）、硫黃（批號(hào)：230501，產(chǎn)地：云南）、韭菜子（批號(hào)：230603，產(chǎn)地：廣西）均購(gòu)自湖南南國(guó)藥都飲片公司，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院楊磊主任藥師鑒定為正品。

益腎固精暖臍貼（批號(hào)：2023110201，2023110202，2023110301，2023110401，2023110801，2023110901，2023111101，2023111201，2023111301，2023111402，2023111403，2023111701，2023111702，2023111703，2023111801，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心）。桂皮醛對(duì)照品（批號(hào)：110710-202223）、丁香酚對(duì)照品（批號(hào)：110725-201917）、母丁香酚對(duì)照品（批號(hào)：112065-202001）、蛇床子素對(duì)照品（批號(hào)：110822-202111）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;羥基-α-山椒素對(duì)照品（批號(hào)：AFCD2611，成都埃法生物科技有限公司）;羥基-β-山椒素對(duì)照品（批號(hào)：J19GB155243，上海源葉生物科技有限公司）。

色譜乙腈（批號(hào)：W51A1H，霍尼韋爾貿(mào)易有限公司）;磷酸（批號(hào)：20211027，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;其余試劑均為分析純;水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1" 指紋圖譜研究

2.1.1" 色譜條件" Poroshell 120色譜柱（4 μm，4.6 mm×150 mm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序：0～20 min，10%～20%A;20～30 min，20%A;30～40 min，20%～30%A;40～50 min，30%～40%A;50～55 min，40%～50%A;55～65 min，50%A;65～71 min，50%～60%A;柱溫30 ℃;體積流量1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)0～40 min為322 nm，40～60 min為280 nm，60～71 min為322 nm;進(jìn)樣量20 μL。

2.1.2" 溶液制備" 混合對(duì)照品溶液的制備：精密稱定桂皮醛、丁香酚、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、母丁香酚、蛇床子素對(duì)照品適量，用甲醇溶解配置成3.675 mg/mL桂皮醛、0.550 mg/mL丁香酚、0.190 mg/mL羥基-α-山椒素、0.387 mg/mL羥基-β-山椒素、0.021 mg/mL母丁香酚、0.018 mg/mL蛇床子素的混合對(duì)照溶液。

供試品溶液的制備：取10貼益腎固精暖臍貼，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入50 mL的甲醇，超聲提取15 min，靜置12 h，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，混勻提取液，取其上清液，使用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.1.3" 方法學(xué)考察" 精密度考察：選取益腎固精暖臍貼（批號(hào)：20231108），按“2.1.2”方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以18號(hào)峰作為參照峰，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation， RSD）為0.09%～1.43%，相對(duì)峰面積RSD為0.12%～6.61%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性考察：選取益腎固精暖臍貼（批號(hào)：20231108），按“2.1.2”方法制備供試品溶液，按“2.1.1”色譜方法分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，以18號(hào)峰作為參照峰，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.03%～0.91%，相對(duì)峰面積RSD 0.20%～6.10%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性考察：選取益腎固精暖臍貼（批號(hào)：20231108），按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以18號(hào)峰作為基峰，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.07%～0.69%，相對(duì)峰面積RSD為1.51%～8.82%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4" 益腎固精暖臍貼HPLC指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)" 取15批樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，得到15批樣品的HPLC色譜圖（圖1），導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）進(jìn)行分析，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度設(shè)置為0.3 min，經(jīng)多點(diǎn)校正后，進(jìn)行Mark譜匹配，生成益腎固精暖臍貼共有模式的對(duì)照指紋圖譜（圖2），共標(biāo)定益腎固精暖臍貼21個(gè)共有峰。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）進(jìn)行分析，選定S5色譜圖為對(duì)照?qǐng)D譜，計(jì)算相似度。15批樣品指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度為0.874～0.999，表明各批次相似度較高，所建立的指紋圖譜可以較全面地反映益腎固精暖臍貼整體質(zhì)量。

2.2" OPLS-DA

為進(jìn)一步確認(rèn)不同批次益腎固精暖臍貼之間的差異性化學(xué)成分，采用OPLS-DA擬合模型，以變量重要性投影（variable importance projected value， VIP）gt;1.0為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出色譜峰12個(gè)（圖3）。通過(guò)對(duì)照品指認(rèn)出峰14為桂皮醛、峰19為羥基-β-山椒素、峰20為丁香酚、峰18為羥基-α-山椒素（圖2）。

2.3" 益腎固精暖臍貼6種成分含量測(cè)定

2.3.1" 色譜條件nbsp; Agilent TC-C18 （5 μm，4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序：0～20 min，10%～20%A;20～30 min，20%A;30～40 min，20%～30%A;40～50 min，30%～40%A;50～55 min，40%～50%A;55～65 min，50%A;65～71 min，50%～60%A;柱溫30 ℃;流速：1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)0～59 min為280 nm;60 min之后322 nm;進(jìn)樣量20 μL。

2.3.2" 溶液的制備" 混合對(duì)照品溶液和供試品溶液制備同“2.1.2”項(xiàng)方法。陰性樣品溶液制備：制備缺肉桂、缺母丁香、缺花椒、缺蛇床子的貼膏陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液?？瞻讟悠啡芤褐苽洌褐苽洳缓幬锍煞值馁N膏空白樣品，按照供試品溶液制備方法制得空白樣品溶液。

2.3.3" 方法學(xué)考察" 專屬性考察：取“2.3.2”項(xiàng)下制備的溶液，按“2.3.1”的色譜條件進(jìn)樣，由結(jié)果可知，6種成分色譜峰保留時(shí)間一致，分離度良好，且無(wú)陰性干擾。詳見(jiàn)圖4。

線性關(guān)系考察：精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下制備混合對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL置于1 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得到系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析。以各成分進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y），得6種成分的線性回歸方程、R2值及線性范圍，結(jié)果見(jiàn)表1。由結(jié)果可知，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，6種成分線性關(guān)系均良好。

精密度考察：取同一批次貼膏，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示桂皮醛、丁香酚、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、母丁香酚、蛇床子素峰面積RSD分別為0.68%、0.96%、0.97%、0.86%、0.90%、0.82%。表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性考察：取同一批次貼膏，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于 0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示桂皮醛、丁香酚、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、母丁香酚、蛇床子素峰面積RSD分別為0.68%、1.31%、0.40%、0.35%、0.66%、0.44%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性考察：取同一批次的貼膏，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示桂皮醛、丁香酚、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、母丁香酚、蛇床子素含量RSD分別為2.37%、1.80%、0.15%、0.76%、0.65%、0.20%。表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收率考察：取同一批貼膏6份，精密稱定，按照質(zhì)量濃度1∶1的比例加入6種對(duì)照品，依據(jù)“2.3.2”項(xiàng)下操作方法進(jìn)行供試品溶液的制備，再依據(jù)“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示桂皮醛、丁香酚、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、母丁香酚、蛇床子素的平均加樣回收率分別為100.71%、94.73%、99.74%、103.80%、94.01%、97.24%;RSD分別為0.36%、0.24%、2.29%、2.69%、0.52%、0.52%。表明該方法準(zhǔn)確可靠。

2.3.4" 樣品含量測(cè)定" 取15批樣品，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，每批樣品平行測(cè)定3次，記錄峰面積，并計(jì)算每批貼膏中桂皮醛、丁香酚、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、母丁香酚、蛇床子素的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。每1 g本品桂皮醛、丁香酚、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、母丁香酚、蛇床子素的平均含量分別為3.735、0.166、0.152、0.321、0.030、0.022 mg/g。

3 討論

中藥多指標(biāo)成分整體質(zhì)量控制已成為中藥質(zhì)量控制的必然發(fā)展趨勢(shì)，中藥指紋圖譜能夠反應(yīng)方劑所含成分，揭示成分的特征性、溯源性及可測(cè)性，具有整體性與動(dòng)態(tài)性的特點(diǎn)，是一種有效的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。本研究基于15批樣品建立了益腎固精暖臍貼的HPLC指紋圖譜及其6種指標(biāo)成分的含量測(cè)定方法，通過(guò)相似度分析初步評(píng)價(jià)了15批樣品的相似性，標(biāo)定共有峰21個(gè)，結(jié)合OPLS-DA進(jìn)一步篩選出12個(gè)特征峰峰，指認(rèn)其中6個(gè)共有成分。

方中蛇床子的主要有效成分蛇床子素能夠有效地補(bǔ)腎壯陽(yáng)，改善腎陽(yáng)虛證[9];肉桂的主要藥效物質(zhì)為揮發(fā)油類，其中桂皮醛具有改善勃起功能的作用[10-11];母丁香廣泛應(yīng)用于治療腎虛陽(yáng)痿，2020版《中華人民共和國(guó)藥典》[12]對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分主要是丁香酚和母丁香酚[13-14]?；ń返乃幮С煞稚浇匪鼐哂袦刂凶饔茫矣休^高的生物利用度[15]。因此，篩選出桂皮醛、丁香酚、母丁香酚、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、蛇床子素這6種成分可作為益腎固精暖臍質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。

綜上，本研究建立的指紋圖譜和含量測(cè)定方法可對(duì)益腎固精暖臍貼的內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行整體性評(píng)價(jià)，該方法重復(fù)性、穩(wěn)定性好，可為益腎固精暖臍貼的質(zhì)量分析、評(píng)價(jià)與控制提供科學(xué)依據(jù)。

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〔收稿日期〕2024-09-26

〔基金項(xiàng)目〕湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2022JJ80094，2024JJ6362）;湖南省衛(wèi)生健康高層次人才項(xiàng)目（湘衛(wèi)函〔2024〕43號(hào)）。

〔通信作者〕*楊" 磊，女，主任藥師，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：263649560@qq.com。