紫山藥干腐病的病原鑒定

摘 " "要：為明確2023年在貴州省黔西南州興義市引起當(dāng)?shù)靥厣魑镒仙剿幐筛〉牟≡姆诸惖匚?，采用組織分離法和單孢純化法獲得培養(yǎng)特征一致的15個(gè)菌株。代表菌株SY2-2經(jīng)柯氏驗(yàn)證為病原物，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征觀察及ITS與RPB2基因序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定引起紫山藥干腐病的病原菌為產(chǎn)核青霉菌Penicillium sclerotigenum。該研究結(jié)果為貴州省紫山藥干腐病的科學(xué)防控奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：紫山藥；干腐??；病原鑒定

中圖分類號(hào)：S632.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2025）02-129-05

Pathogen identification of dry rot of purple yam

XU Yuanliu1，2， HUANG Lei3， LIU Min3， YANG Jiawei2， BAI Qingrong1， YANG Chao3

（1. State Key Laboratory of Green Pesticides， Guizhou University， Guiyang 550025， Guizhou， China; 2. Xingyi Agricultural Technology Extension Center， Xingyi 562400， Guizhou， China; 3. Guizhou Jifeng Seed Industry Co.， Ltd， Xingyi 562400， Guizhou， China）

Abstract： To clarify the taxonomic status of the pathogen causing dry rot of purple yam in Xingyi city， Guizhou province in 2023， 15 strains with the same cultural characteristics were obtained by tissue isolation and single spore purification. The representative strain SY2-2 was confirmed as pathogen of the disease by Koch's test. Based on morphological characteristics and ITS and RPB2 sequence analysis， a phylogenetic tree was constructed. Penicillium sclerotigenum was identified as the pathogen causing the dry rot of purple yam. The results lay a theoretical foundation for the scientific control of dry rot of purple yam in Guizhou province.

Key words： Purple yam; Dry rot; Penicillium sclerotigenum; Pathogen identification

紫山藥（Dioscorea alata）又名紫蒔藥、紫淮山和紫參薯等，屬薯蕷科薯蕷屬參薯，屬于山藥的近緣植物，塊莖肉質(zhì)呈紫紅色，富含黏液質(zhì)、多糖、蛋白質(zhì)、淀粉和礦物質(zhì)元素，特別是花色苷含量較高，是山藥中的精品?；ㄉ找彩瞧駷橹顾l(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)效的自由基清除劑，具有抗氧化、抗衰老、抗癌與抗動(dòng)脈硬化等功能，有較高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值[1-2]。紫山藥原產(chǎn)于亞洲熱帶地區(qū)，在我國(guó)主要分布于南方的溫暖地帶，包括浙江、江蘇、廣東、廣西、福建、江西、云南和臺(tái)灣等地，在北方地區(qū)種植較少[3]。

紫山藥是藥食同源的植物，深受廣大消費(fèi)者喜愛，隨著需求量的增多，種植面積不斷擴(kuò)大，該特色產(chǎn)業(yè)對(duì)農(nóng)民增收致富具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。隨著紫山藥種植面積的增加，其病害發(fā)生種類和發(fā)生程度也隨之加重，嚴(yán)重制約著山藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。山藥塊莖病害主要有根腐病（Fusarium chlamydosporum、Fusarium solani、Fusarium avenaceum、Fusarium oxysporum、Humicola fuscoatra、Pythium ultimum var. ultimum）[4-6]、干腐?。≒enicillium sclerotigenum）、黑皮病Monilochaetes infascans、瘡痂?。⊿treptomyces spp.）、山藥細(xì)菌性軟腐?。≒seudomonas dioscoreae、Pantoea agglomerans）、根腐線蟲病（Pratylenchus spp.）和根結(jié)線蟲?。∕eloidogyne spp.）[6]。山藥皮薄，在收獲、運(yùn)輸、貯藏和銷售的過程中，易破皮或折斷造成傷口，大大增加了多種病原菌的侵染概率，干腐病的發(fā)生對(duì)山藥品質(zhì)產(chǎn)生不利影響，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7-8]。

2017年由貴州吉豐種業(yè)有限責(zé)任公司從廣西引進(jìn)種植的紫玉淮山，經(jīng)4 a（年）4代系統(tǒng)選育形成穩(wěn)定品系，定名為紫山藥1號(hào)，2021年將紫山藥1號(hào)擴(kuò)繁，2022年開始小面積種植，田間表現(xiàn)抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)范圍廣、產(chǎn)量高、效益顯著。2023年開始推廣種植，目前紫山藥在黔西南州興義市、晴隆縣、普安縣等地方均有種植。該品種植株蔓生，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，葉片呈闊卵圓形，苗期葉色紫色，后期青綠色，平均葉長(zhǎng)14.2 cm、葉寬8.5 cm；薯形長(zhǎng)棒形，平均單薯長(zhǎng)86 cm、橫徑6.2 cm，平均單薯質(zhì)量1.4 kg；薯皮紫紅色、肉質(zhì)粉紫色。種子呈扁卵圓形、紡錘形等，表皮暗褐色，種子肉質(zhì)深紫色；生育期260～300 d。在紫山藥的種植過程中葉部零星發(fā)生炭疽病，尚未發(fā)現(xiàn)影響生產(chǎn)的地上部病害。2023年1月在貴州省黔西南州興義市紫山藥貯藏期間發(fā)現(xiàn)有5%～10%紫山藥腐爛壞死，罹病部位呈深褐色，部分山藥罹病部位長(zhǎng)有青色霉層，罹病薯塊不能食用，嚴(yán)重影響山藥的品質(zhì)和商品價(jià)值。為明確引起該病害的病原菌的分類地位，筆者對(duì)罹病紫山藥進(jìn)行病原菌的分離與純化、致病性測(cè)定、形態(tài)特征觀察及分子生物學(xué)鑒定，以期為研究該病害的發(fā)生規(guī)律及防治方法奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2023年1月至2024年3月在貴州大學(xué)綠色農(nóng)藥全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。病害來源于貴州省黔西南州興義市送檢的紫山藥干腐病樣品。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 " "病原菌的分離與純化 " "采用組織分離法對(duì)2次送檢的15個(gè)罹病紫山藥發(fā)病組織塊進(jìn)行病原菌分離，先用滅菌刀切去病部外表皮，再用無菌鑷子從發(fā)病變色部位夾取少量組織塊，置于75%乙醇溶液中浸泡消毒60 s，無菌水清洗3次。將消毒的組織塊放到盛有吸水紙的培養(yǎng)皿中，在無菌操作臺(tái)中風(fēng)干2 h后，移至PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)。待組織塊邊緣長(zhǎng)出菌絲后，用無菌接種鏟在菌落邊緣鏟起3 mm×3 mm菌塊，放入PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行純化培養(yǎng)。待培養(yǎng)2～3 d后，將長(zhǎng)出的真菌菌落挑取邊緣菌絲至新的PDA培養(yǎng)基上，待病菌產(chǎn)孢后，挑取單個(gè)孢子進(jìn)行純化[9]，將純化后的純培養(yǎng)物保存?zhèn)溆谩５谝淮嗡蜋z樣品分離得到6個(gè)分離物，記為SY1-1～SY1-6，第二次送檢樣品分離得到9個(gè)分離物，記為SY2-1～SY2-9。

1.2.2 " "分離物致病性測(cè)定 " "選取新鮮健康的紫山藥塊莖，使用75%的乙醇表面消毒，待乙醇自然風(fēng)干后使用無菌刀將山藥切段。代表菌株SY2-2培養(yǎng)7 d后用無菌水制成濃度為1×106 個(gè)·mL-1孢子懸浮液，均勻噴在整個(gè)山藥塊莖表面及兩側(cè)切口。以噴灑無菌水為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，觀察并記錄發(fā)病情況。

待山藥塊莖明顯發(fā)病后采用1.2.1的方法進(jìn)行病原菌的分離，觀察其菌落和分生孢子的形態(tài)與接種菌株是否一致，若一致則證明該接種菌株為紫山藥干腐病的病原菌。

1.2.3 " "病菌形態(tài)特征觀察 " "觀察病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、顏色及生長(zhǎng)狀況。使用BA210-T生物顯微鏡觀察病原菌在PDA培養(yǎng)基上的分生孢子及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征并拍照，使用VHX-7000超景深顯微鏡（KEYENCE）測(cè)量病原菌的100個(gè)分生孢子大小。參照相關(guān)參考文獻(xiàn)[10]，初步確認(rèn)病菌的分類地位。

1.2.4 " "分子生物學(xué)鑒定 " "按照真菌基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取新鮮菌絲的DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。選擇引物ITS1/ITS4對(duì)核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer， rDNA-ITS）[11]和RPB2-5F/RPB2-7cR對(duì)RNA聚合酶II第二大亞基（second largest subunit of RNA polymerase II， RPB2）[12]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μL：Taq mixture 12.5 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，委托生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。

將所得的序列與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中的相關(guān)序列進(jìn)行一致性比較。利用Phylosuite 1.2.2軟件進(jìn)行序列的比對(duì)與拼接，再手動(dòng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正，通過MEGA 7.0軟件對(duì)代表性菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，通過最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)其分類地位進(jìn)行確認(rèn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病癥狀與分離結(jié)果

該病害多從傷口侵入，向內(nèi)擴(kuò)展，患病部位變褐，腐爛壞死，嚴(yán)重部位表面密生綠色霉層。干燥條件下病原菌侵入速度慢，壞死部位呈干腐狀，病斑形狀不規(guī)則，病健交界明顯（圖1）。

通過對(duì)紫山藥根莖發(fā)病組織的病原菌進(jìn)行分離與純化，共獲得15株純培養(yǎng)物，菌落形態(tài)基本一致（圖2）。在PDA培養(yǎng)基上菌落近圓形，正面有綠色霉層，背面白色，散射狀生長(zhǎng)，致密，有輪紋。

2.2 分離物的致病性測(cè)定

隨機(jī)選取代表菌株SY2-2進(jìn)行接種。3 d后在山藥根莖橫切面即可長(zhǎng)出霉?fàn)钗铮? d后病部密生灰綠色霉層，傷口部位變褐壞死，沿著傷口處縱切，山藥表皮下組織腐爛成深褐色（圖3-C～D），對(duì)照組山藥無明顯發(fā)病癥狀（圖3-A～B）。采用組織分離法對(duì)接種山藥發(fā)病部位進(jìn)行再分離，發(fā)現(xiàn)分離物與接種菌株的菌落形態(tài)及孢子形態(tài)一致，確認(rèn)接種菌為紫山藥干腐病的病原菌。

2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

菌株SY2-2于PDA培養(yǎng)基上25 ℃恒溫培養(yǎng)，生長(zhǎng)初期菌絲呈絨毛狀、白色，后期正面菌絲為綠色，邊緣呈黃白色。分生孢子梗經(jīng)過多次分枝，產(chǎn)生幾輪對(duì)稱或不對(duì)稱的小梗，形如掃帚，其上有2～3個(gè)分生孢子，分生孢子橢圓形或球形，長(zhǎng)2.42～4.56 μm，寬2.32～4.01 μm，分生孢子平均大小為3.82 μm×3.11 μm（圖4）。參考《真菌鑒定手冊(cè)》[10]，初步將菌株SY2-2鑒定為青霉菌屬Penicilliumi spp.。

2.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)菌株SY2-2的基因組DNA進(jìn)行ITS和RPB2基因的PCR擴(kuò)增，分別獲得長(zhǎng)度為566 bp和982 bp的序列。以Penicillium herquei為外群通過多基因聯(lián)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）結(jié)果可知，SY2-2與Penicillium sclerotigenum聚在一枝上，且支持率為100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定，將紫山藥干腐病病原菌鑒定為產(chǎn)核青霉菌Penicillium sclerotigenum。

3 討論與結(jié)論

由P. sclerotigenum引起的薯蕷干腐病在尼日利亞、印度、日本等多個(gè)國(guó)家已有報(bào)道，是薯蕷采后病害的病原菌之一[13-15]。晏衛(wèi)紅等[7]于2007年在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道P. sclerotigenum侵染薯蕷引起干腐病在廣西桂平縣金田鎮(zhèn)的發(fā)生和危害。筆者將貴州省興義市送檢的紫山藥病害的病原菌鑒定為產(chǎn)核青霉菌P. sclerotigenum，與姚甜甜[8]報(bào)道的山藥青霉腐爛病及日本報(bào)道的山藥藍(lán)霉病病原中的一種病菌一致[16]。因病害發(fā)生后，癥狀主要表現(xiàn)為干腐，因此筆者確定該病害為紫山藥干腐病。產(chǎn)核青霉菌P. sclerotigenum除了能引起山藥腐爛病外，還能引起栗仁、蘋果和梨等果樹的腐爛病[17-18]。

山藥塊莖表面的外皮具有保護(hù)作用，病原物很難穿透外皮進(jìn)入山藥內(nèi)部，但是山藥塊莖在采收貯運(yùn)的過程中很容易損傷，出現(xiàn)傷口，而產(chǎn)核青霉菌多數(shù)通過傷口進(jìn)行侵染?；艏褮g等[17]通過對(duì)P. sclerotigenum的不同培養(yǎng)條件的研究，結(jié)果表明，產(chǎn)核青霉菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的溫度為25 ℃，建議將山藥置于低溫環(huán)境下貯藏。Plumbley等[19]報(bào)道了用苯菌靈、抑霉唑兩種藥劑處理薯蕷可以抑制或減少貯藏期由P. sclerotigenum引起的塊莖腐爛。姚甜甜[8]研究表明，戊唑醇1000～2000倍液、嘧菌酯200～400倍液、咪鮮胺200～300倍液、氟硅唑2000～4000倍液、抑霉唑硫酸鹽200～500倍液、苯醚甲環(huán)唑200～400倍液、丙環(huán)唑100～400倍液對(duì)防治山藥青霉腐爛病效果最好，其中在室內(nèi)接種測(cè)定和冷庫試驗(yàn)的防治效果均為100%，并建議在山藥種莖貯藏期采用上述藥劑對(duì)該病害進(jìn)行防控；該研究還對(duì)石灰與黏土的9種不同配比對(duì)青霉菌的抑制活性和冷庫貯藏效果進(jìn)行篩選評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)熟石灰和深層黏土按照體積比2∶5 處理山藥切口的效果最好。

筆者通過對(duì)貴州省黔西南州興義市發(fā)生的紫山藥干腐病病菌的分離純化、致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，將該病害的病原菌鑒定為產(chǎn)核青霉菌P. sclerotigenum。

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