可栽培黃色羊肚菌品種的鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

摘 " "要：采集栽培馴化基地的黃色羊肚菌子囊果樣品，經(jīng)組織分離獲得了菌絲體培養(yǎng)物，進(jìn)而采用常規(guī)的形態(tài)學(xué)特征結(jié)合多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，包括內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacers，ITS）、延長(zhǎng)因子1α（elongation factor 1-alpha，EF1-α）、RNA聚合酶II大小亞基（RNA polymerase II subunit 1/2，RPB1/ RPB2）4個(gè)DNA片段，對(duì)3個(gè)可栽培黃色羊肚菌品種進(jìn)行分類鑒定。子囊果的宏觀和微觀形態(tài)特征表明，馴化栽培羊肚菌屬于黃色羊肚菌類群物種；基于4個(gè)DNA片段的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，3個(gè)馴化羊肚菌品種序列與10個(gè)黃色羊肚菌參考序列一起被聚類在黃色羊肚菌支系（Esculenta clade）內(nèi)，與Mes-21標(biāo)本被聚類在一個(gè)單系發(fā)育類群（支持率100%），表明其屬于Mes-21系統(tǒng)發(fā)育學(xué)種。這是首次被確認(rèn)的黃色羊肚菌人工栽培種類，將有效地推動(dòng)我國(guó)黃色羊肚菌人工栽培技術(shù)發(fā)展和規(guī)?；耘鄳?yīng)用。

關(guān)鍵詞：羊肚菌；支系；馴化栽培；系統(tǒng)發(fā)育學(xué)種；Mes-21

中圖分類號(hào)：S646.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2025）02-059-07

Identification and phylogenetic analysis of cultivable yellow morel mushrooms

ZHANG Wenchang1， SUN Wenhua2， WANG Haiyan3， YIN Qi1， KONG Weili2， HE Peixin1， LIU Wei4

（1. College of Food and Biological Engineering， Zhengzhou University of Light Industry， Zhengzhou 450001， Henan， China; 2. Institute of Mushroom， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， Henan， China; 3. Luoyang Wilderness Ecological Agriculture Co.， Ltd.， Luoyang 471000， Henan， China; 4. Kunming Institute of Botany， Chinese Academy of Sciences/Yunnan Key Laboratory for Fungal Diversity and Green Development， Kunming 650201， Yunnan， China）

Abstract： The ascocarps of yellow morel samples from a cultivation and domestication base were collected， and mycelial isolates were obtained through tissue separation. Conventional morphological characters combined with the analysis of concatenated sequences of internal transcribed spacers（ITS）， elongation factor 1-alpha（EF1-α）， RNA polymerase II subunit 1/2（RPB1/ RPB2）were used to classify and identify three cultivated yellow morel varieties. The macro- and micro-morphological characteristics of the ascocarps supported their identities of yellow morels. Phylogenetic analysis based on four gene fragments showed that the sequences of the three domesticated morel varieties clustered together with 10 morel reference sequences in the Esculenta clade， and with the Mes-21 in a monophyletic group（support rate 100%）， indicating that they belong to the Mes-21 phylogenetic species.. This is the first confirmed artificial cultivated species of Esculenta clade， which will effectively promote the development of yellow morel artificial cultivation technology and its large-scale cultivation applications in China.

Key words： Morel mushrooms; Esculenta clade; Domestication; Phylogenetic species; Mes-21

羊肚菌（Morel）生物分類學(xué)上隸屬于子囊菌門（Ascomycota）、盤菌綱（Pezizomycetes）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬（Morchella），是一類世界性分布的珍稀食藥兼用真菌，具有益腸胃、消化助食、化痰理氣、補(bǔ)腎納氣、補(bǔ)腦提神之功效，并具有抗氧化、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)肝臟等功能[1-5]。羊肚菌子囊果具有環(huán)境可塑性和微觀結(jié)構(gòu)的保守性，使得傳統(tǒng)的以形態(tài)特征為主的分類困難重重[6]。核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacers，ITS）序列分析被廣泛地應(yīng)用于羊肚菌物種鑒定[6-10]，但其應(yīng)用存在著分辨率低的局限性，基于ITS僅能揭示該屬大約76%的物種多樣性[6，10]。目前，多基因譜系一致性系統(tǒng)發(fā)育學(xué)物種識(shí)別（genealogical concordance phylogenetic species recognition， GCPSR）應(yīng)用于羊肚菌分類鑒定已經(jīng)成為共識(shí)，主要基于ITS、核糖體大亞基（ribosomal large subunit，LSU）、延伸因子1α（elongation factor 1-alpha，EF1-α）和RNA聚合酶II大小亞基（RNA polymerase II subunit 1/2，RPB1/ RPB2）等基因片段，對(duì)羊肚菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和物種鑒定?；贕CPSR，可把羊肚菌分為黃色羊肚菌支系（Esculenta clade）、黑色羊肚菌支系（Elata clade）和變紅羊肚菌支系（Rufobrunnea clade）[6，11-17]。

自2012年以來(lái)，我國(guó)實(shí)現(xiàn)了黑色羊肚菌物種的商業(yè)化栽培[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2021年我國(guó)的羊肚菌總種植面積已達(dá)1.6萬(wàn)hm2，覆蓋了全國(guó)大部分地區(qū)[18]。目前，梯棱羊肚菌（M. importuna）、六妹羊肚菌（M. sextelata）和七妹羊肚菌（M. eximia）是中國(guó)羊肚菌大田栽培中的主要種類。栽培品種的野生資源主要發(fā)生在中國(guó)的西南高海拔地區(qū)，包括四川青川、平武、綿陽(yáng)、涼山州和云南的香格里拉到麗江一帶，經(jīng)過(guò)持續(xù)馴化栽培，逐漸演化為可栽培商業(yè)化品種[1-2，4-5]。實(shí)際上，我國(guó)平原地區(qū)和低海拔山區(qū)，同樣蘊(yùn)藏著非常豐富的黃色羊肚菌資源。然而，黃色羊肚菌的馴化栽培工作一直沒有實(shí)質(zhì)性突破，直到最近，源自河南省洛陽(yáng)市的野生黃色羊肚菌成功實(shí)現(xiàn)了馴化栽培，有望規(guī)?；茝V應(yīng)用。黃色羊肚菌的規(guī)模化栽培，將有助于豐富羊肚菌可栽培種質(zhì)資源的多樣性。筆者采用形態(tài)學(xué)特征結(jié)合GCPSR，對(duì)可栽培羊肚菌進(jìn)行鑒定，確定了其系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位，有利于我國(guó)黃色羊肚菌的人工馴化栽培和規(guī)?；茝V應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 菌株培養(yǎng)

羊肚菌菌株的分離和培養(yǎng)采用CYM培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖20，蛋白胨2，酵母浸粉2，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO4 0.46，K2HPO4 1，瓊脂20，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

1.2 材料

PCR擴(kuò)增試劑盒和DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) （100～2000 bp）由上海生工生物工程有限公司（上海生工）提供，ITS、EF1-α、RPB1和RPB2的擴(kuò)增引物序列[11，14]見表1，由上海生工合成。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本的采集、記錄與組織分離 2024年4月13日，從洛陽(yáng)大荒野生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司上戈鎮(zhèn)生產(chǎn)基地采集馴化栽培出菇的福星2號(hào)、福星3號(hào)和福星5號(hào)羊肚菌子囊果樣品，描述新鮮標(biāo)本的形態(tài)特征，記錄子囊果形態(tài)、菌蓋形態(tài)、顏色，菌蓋表面脊的排列、凹坑的形狀，菌柄的形態(tài)和顏色等形態(tài)特征。隨后將標(biāo)本放在陰涼通風(fēng)處風(fēng)干，進(jìn)行微觀特征測(cè)定與菌株分離。

微觀特征的測(cè)定：對(duì)成熟子囊果的菌蓋徒手切片，用15%的甘油封片后，在A1型倒置生物顯微鏡（德國(guó)徠卡公司，40×物鏡，DIC微分干涉效果）下觀察、拍照，記錄子囊、子囊孢子和支撐細(xì)胞的形態(tài)，并測(cè)量其大小。

組織分離：用解剖刀直接切取干燥子囊果的菌蓋組織塊接種短生長(zhǎng)管（凈長(zhǎng)度20 cm，內(nèi)徑24 mm，管口凸起高度31 mm，管口凸起與生長(zhǎng)管夾角120°）一端，25 ℃避光培養(yǎng)。當(dāng)菌絲生長(zhǎng)至生長(zhǎng)管另一端時(shí)，取菌絲塊轉(zhuǎn)接新的CYM斜面，培養(yǎng)至菌絲滿管后4 ℃保存?zhèn)溆谩８Ｐ?號(hào)、福星3號(hào)和福星5號(hào)3個(gè)品種的菌絲體分離物（菌株）分別編號(hào)為FX-2、FX-3和FX-5。

1.3.2 多基因系統(tǒng)發(fā)育分析 菌絲體加液氮充分研磨，取約0.5 g菌絲粉置1.5 mL離心管中，用700 μL CTAB提取緩沖液懸浮，65 ℃水浴20～30 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，上清液加入700 μL氯仿-異戊醇（體積化24∶1）沉淀蛋白質(zhì)2次，離心后，往上清液中加入等體積的無(wú)水異丙醇沉淀DNA，用70%和100%乙醇洗滌風(fēng)干后重懸于100 μL無(wú)菌雙蒸水，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆肹19]。采用各自的特異性引物（表1）分別擴(kuò)增ITS、EF1-α、RPB1 和RPB2 序列。PCR 擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序見參考文獻(xiàn)[11，20]。將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，送上海生工進(jìn)行雙向測(cè)序，將序列提交基因庫(kù)，獲得基因號(hào)。

使用Geneious R6軟件編輯獲得的DNA序列，使用BLASTN進(jìn)行同源性搜索[21]。下載NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中同源性大于99%的羊肚菌序列，并選取公開發(fā)表的可用于羊肚菌屬物種系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析的序列進(jìn)行分析。對(duì)全部樣本序列和參考序列進(jìn)行拼接處理[22]，采用BioEdit整理樣本和參考物種的單個(gè)基因序列。首先通過(guò)Clustal X 將序列對(duì)齊（采用系統(tǒng)默認(rèn)設(shè)置參數(shù)），選擇保守區(qū)域。將最終序列整合成矩陣，并以fas格式保存。使用BioEdit Sequence Alignment Editor（5.09）在編輯模式下將ITS、EF1-α、RPB1和RPB2序列集合，按照“ITS + EF1-α + RPB1 + RPB2”的順序進(jìn)行拼接，得到的新序列同樣以fas格式保存。最后，將拼接序列輸入MEGA11.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉值設(shè)置為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 子囊果宏觀和微觀形態(tài)

人工栽培的3個(gè)羊肚菌品種子囊果均單生或群生（圖1-A），菌蓋形狀和顏色受環(huán)境影響較大。3個(gè)品種的栽培子囊果顏色和形態(tài)相似，均中等偏小，高3.0～12 cm，近圓形、卵圓形、寶塔狀或近柱狀，高2.0～9.0 cm，最寬處2.0～6.5 cm。菌蓋表面縱脊明顯，縱橫脊交錯(cuò)，成熟子囊果脊的顏色為淺黃色至淺灰色；凹坑形狀和大小不規(guī)則。菌柄基部不膨大、稍膨大至明顯膨大，白色至淺黃色，圓柱狀，中空；長(zhǎng)2.0～3.5 cm，底部寬3.0～4.0 cm，上部寬1.5～2.5 cm。相比而言，F(xiàn)X-2栽培子囊果最小，菌柄基部鮮有膨大（圖1-B）；FX-3與FX-5子囊果大小相近，F(xiàn)X-3菌柄基部明顯膨大（圖1-C），F(xiàn)X-5子囊果菌柄基部稍膨大（圖1-D）。

顯微觀察表明，3份標(biāo)本的微觀特征一致，八孢子囊，子囊長(zhǎng)棒狀至近圓筒狀，基部足狀，大?。?78.18～263.02） μm × （18.13～26.80） μm；子囊孢子橢圓形，透明無(wú)色，表面光滑，大?。?9.82～26.20） μm × （11.95～15.49） μm，長(zhǎng)寬比為1.64±0.14；側(cè)絲棒狀、近圓筒狀，無(wú)色、透明、有隔，大小為（61.96～103.26） μm × （8.75～12.46） μm；不育脊上剛毛棒狀，頂部收縮至細(xì)棒狀，大小在（65.52～115.42） μm × （13.65～31.64） μm（圖1-E～F）；3%的氫氧化鉀不顯色。子囊果的宏觀和微觀形態(tài)特征與黃色羊肚菌類群物種相一致。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2.1 ITS、EF1-α、RPB1和RPB2的測(cè)序序列 3個(gè)菌株（FX-2、FX-3和FX-5）的4個(gè)特異性片段經(jīng)PCR擴(kuò)增后直接進(jìn)行雙向測(cè)序。結(jié)果表明，ITS片段長(zhǎng)度約為1100 bp，EF1-α基因片段長(zhǎng)度為1100 bp左右，RPB1基因片段大小為750 bp左右，RPB2基因片段大小約為800 bp。DNA片段整理后進(jìn)行在線BLASTN比對(duì)，顯示3個(gè)品種均屬于黃色羊肚菌支系。將12條樣本序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，授權(quán)每個(gè)基因的序列登錄號(hào)如表2所示。

2.2.2 多基因系統(tǒng)發(fā)育樹 以變紅羊肚菌（M. rufobrunnea） YAASMVR菌株為外群，對(duì)供試羊肚菌品種和羊肚菌屬的主要分支物種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。所有樣本序列及參考序列經(jīng)過(guò)對(duì)齊處理后，ITS 部分DNA序列保留870 bp，EF1-α、RPB1和RPB2部分基因序列分別保留800、610和650 bp，拼接后的全序列長(zhǎng)度均為 2930 bp，采用MEGA 11構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。從圖2可以看出，3個(gè)馴化羊肚菌品種序列與其他黃色羊肚菌參考序列被聚類在一個(gè)大的分支上。FX-2、FX-3和FX-5與Mes-21 FCNU1082標(biāo)本被聚類在一個(gè)小的分支上，支持率100%。結(jié)合子囊果宏觀和微觀形態(tài)特征，四基因GCPSR進(jìn)一步證實(shí)FX-2、FX-3和FX-5屬于黃色羊肚菌支系的Mes-21系統(tǒng)發(fā)育學(xué)種。

3 討論與結(jié)論

在形態(tài)特征上，黃色羊肚菌支系種類子囊果的脊通常為淺黃褐色或赭黃色，成熟后顏色也不加深；脊的排列一般不規(guī)則。而黑色羊肚菌支系種類成熟時(shí)子囊果的脊通常為深棕色或黑色，脊縱向排列或平行排列，一般較規(guī)則[23]。本研究中3個(gè)品種馴化栽培羊肚菌表現(xiàn)出典型的黃色羊肚菌支系種類特征，表明其屬于黃色羊肚菌類群物種。

羊肚菌屬的多基因GCPSR分析最早由TA?KIN等[11]引進(jìn)開發(fā)，基于核糖體LSU、EF1-α、RPB1和RPB2四個(gè)基因片段的聯(lián)合分析對(duì)地中海及愛琴海區(qū)域的62個(gè)羊肚菌標(biāo)本進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，識(shí)別了15個(gè)新的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)種。隨后，O’DONNELL等[12]進(jìn)一步采用多基因GCPSR對(duì)收集自北美和歐洲羊肚菌屬的177個(gè)標(biāo)本進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，提出羊肚菌屬由黃色羊肚菌支系和黑色羊肚菌支系兩個(gè)姊妹類群以及變紅羊肚菌支系一個(gè)基礎(chǔ)單系分支構(gòu)成，記錄了變紅羊肚菌支系1個(gè)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)種、黃色羊肚菌支系16個(gè)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)種（Mes-1到Mes-16）及黑色羊肚菌支系24個(gè)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)種（Mel-1到 Mel-24）。目前，黑色羊肚菌支系已經(jīng)記錄了至少51個(gè)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)種，對(duì)其中的36個(gè)進(jìn)行了生物學(xué)特征描述[13，17，24-31]；黃色羊肚菌支系共記錄了36個(gè)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)種，對(duì)其中的19個(gè)進(jìn)行了詳細(xì)描述和命名[17，28，32-34]；而變紅羊肚菌支系共記錄和描述了2種羊肚菌：變紅羊肚菌和小紫羊肚菌（M. anatolica）[14，35]。至此，羊肚菌屬共計(jì)記錄了89個(gè)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)種，其中57個(gè)物種被詳細(xì)地進(jìn)行過(guò)形態(tài)描述，并給出了雙名法名稱。

美國(guó)20世紀(jì)末實(shí)現(xiàn)的羊肚菌室內(nèi)栽培所使用的品種屬于變紅羊肚菌[12，36-38]。我國(guó)經(jīng)過(guò)幾十年的持續(xù)探索，并借鑒美國(guó)羊肚菌工廠化栽培經(jīng)驗(yàn)，在發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用可栽培品種和成功實(shí)施外源營(yíng)養(yǎng)袋技術(shù)的前提下，于2012年首先在川渝地區(qū)成功實(shí)施了羊肚菌商業(yè)化大田栽培[2]。我國(guó)羊肚菌大田栽培所使用的品種，主要來(lái)自自然發(fā)生的梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌和七妹羊肚菌的野生馴化。該3個(gè)品種羊肚菌均屬于黑色羊肚菌支系，在生態(tài)上都是典型的火燒地品種[38-39]。除此以外，黑色羊肚菌支系的Mel-9、Mel-13、M. owneri和Mes-21也有報(bào)道可以栽培出菇[28，40-41]。然而，黃色羊肚菌雖有大田、林下和室內(nèi)仿生馴化栽培嘗試[42-44]，但其穩(wěn)定性的人工栽培至今沒被證實(shí)。相對(duì)于黑色羊肚菌主要發(fā)生于海拔1000～4000 m山區(qū)，野生黃色羊肚菌主要發(fā)生于北半球溫帶的平原地區(qū)和海拔1000 m以下山區(qū)，在水溝、堤壩、果園、茶園、地頭、路邊、草地、林地等生境均可發(fā)現(xiàn)它們的蹤跡，在火燒地鮮有發(fā)生[2，45]。筆者測(cè)定的3個(gè)黃色羊肚菌品種均分離自洛陽(yáng)市淺山區(qū)林地發(fā)生的野生子囊果，經(jīng)過(guò)多年持續(xù)人工馴化栽培獲得。3個(gè)品種大致上采取我國(guó)當(dāng)前推廣的黑色羊肚菌大田栽培技術(shù)進(jìn)行人工栽培，具體技術(shù)有待于申報(bào)知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)。黃色羊肚菌人工栽培具有較大的商業(yè)化推廣應(yīng)用潛力，有待于規(guī)模化推廣應(yīng)用。

筆者采集了黃色羊肚菌馴化栽培基地的羊肚菌子囊果，經(jīng)組織分離獲得菌絲體分離物，利用常規(guī)的形態(tài)學(xué)特征結(jié)合ITS、EF1-α、RPB1和RPB2四個(gè)片段的聯(lián)合序列分析，最終確認(rèn)人工栽培的3個(gè)羊肚菌品種均屬于黃色羊肚菌支系，均為Mes-21系統(tǒng)發(fā)育學(xué)種。這是首次科學(xué)確認(rèn)的黃色羊肚菌人工栽培種類，將有效推動(dòng)我國(guó)黃色羊肚菌人工栽培技術(shù)的發(fā)展和規(guī)?；茝V應(yīng)用，有利于我國(guó)羊肚菌產(chǎn)業(yè)的持續(xù)、穩(wěn)定和長(zhǎng)久發(fā)展。

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