番茄葉面積的遺傳分析和BSA-QTL定位

摘 " "要：葉面積是番茄的重要農(nóng)藝性狀之一，直接影響光合效率和干物質(zhì)的積累，從而對(duì)植株的生長(zhǎng)發(fā)育和生產(chǎn)力產(chǎn)生重大影響。研究番茄葉面積遺傳規(guī)律，并通過(guò)BSA-seq進(jìn)行基因定位，可以為研究番茄葉面積的遺傳與分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。以葉面積差異明顯的21GA04（P1）和19GA13（P2）作為親本，構(gòu)建了P1、P2、F1、F2、BCP1和BCP2六世代群體。利用ImageJ軟件測(cè)定番茄六世代群體葉面積。采用主基因與多基因混合遺傳模型對(duì)番茄葉面積進(jìn)行遺傳分析；同時(shí)，通過(guò)集群分離分析法（BSA）檢測(cè)極端材料及親本基因型，并結(jié)合QTL-seq（SNP-index關(guān)聯(lián)分析法）對(duì)葉面積進(jìn)行關(guān)聯(lián)基因的初步定位。在F2、BCP1和BCP2 3個(gè)分離群體中，番茄葉面積均呈現(xiàn)偏正態(tài)分布。番茄葉面積的最適遺傳模型為MX2-ADI-AD，表明該性狀受2對(duì)加性-顯性-上位性主基因和加性-顯性多基因控制。采用SNP-index關(guān)聯(lián)分析法共檢測(cè)到3個(gè)QTL區(qū)間，分別位于番茄1號(hào)染色體的89.0～89.8 Mb、8號(hào)染色體的2.1～4.5 Mb和9號(hào)染色體的63.9～64.8 Mb。結(jié)果表明，番茄的葉面積受主基因和多基因的共同調(diào)控，且與葉面積性狀相關(guān)的區(qū)間位于1號(hào)、8號(hào)和9號(hào)染色體上，推測(cè)其中SlSAUR20和SlSAUR21基因?yàn)殛P(guān)聯(lián)葉面積性狀的候選基因。

關(guān)鍵詞：番茄；葉面積；遺傳分析；QTL定位

中圖分類(lèi)號(hào)：S641.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2025）02-040-10

Genetic analysis and BSA-QTL mapping of tomato leaf area

LI Shanshan1， LIANG Pan1， MENG Fanyi1， MA Mengqiu1， HU Tixu1， LIANG Yan1， CAI Yiyong2， ZHAN Xiangqiang1

（1. College of Horticulture， Northwest A amp; F University， Yangling 712100， Shaanxi， China; 2. Shaanxi Jinpeng Seedling Co.， Ltd.， Yangling 712100， Shaanxi， China）

Abstract： Leaf area is one of the important agronomic traits in tomato that directly influences photosynthetic efficiency and material accumulation， thus significantly affecting plant growth and productivity. Studying the inheritance patterns of tomato leaf area and performing gene mapping through BSA-seq can provide a theoretical foundation for understanding the genetic and molecular mechanisms of leaf area in tomato. In this study， two parental lines with significant differences in leaf area， 21GA04（P1） and 19GA13（P2）， were selected to construct a population comprising six generations： P1， P2， F1， F2， BCP1 and BCP2. ImageJ software was used to measure the leaf area across these six generations. Genetic analysis of tomato leaf area was performed using a mixed genetic model combining major genes and polygenes. Additionally， bulked segregation analysis （BSA） was employed to assess the genotypes of extreme materials and parents， while QTL-seq （SNP-index association analysis） was used for preliminary localization of leaf area associated genes. The leaf area in the F2， BCP1 and BCP2 populations showed a skewed normal distribution. The most suitable genetic model for tomato leaf area is MX2-ADI-AD， indicating that this trait is controlled by two pairs of additive-dominant epistatic major genes and additive-dominant polygenes. SNP-index association analysis identified three QTL intervals， located on chromosome 1（89.0-89.8 Mb） ，chromosome 8（2.1-4.5 Mb）， and chromosome 9（63.9-64.8 Mb）. These results suggest that tomato leaf area is governed by both major genes and polygenes， with three associated regions located on chromosomes 1， 8 and 9， and SlSAUR20 and SlSAUR21 are proposed as candidate genes associated with leaf area trait.

Key words： Tomato; Leaf area; Genetic analysis; QTL mapping

番茄是茄科茄屬的一年生或多年生草本植物，是全球范圍內(nèi)消費(fèi)量最大的蔬菜作物之一。葉片是植物地上部最重要的器官之一，負(fù)責(zé)與外界環(huán)境進(jìn)行交換，是進(jìn)行光合作用、蒸騰作用和呼吸作用的重要場(chǎng)所，也是干物質(zhì)積累的重要器官[1-2]。葉面積是番茄重要的農(nóng)藝性狀之一，對(duì)光合效率和干物質(zhì)積累有直接影響，從而影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育和生產(chǎn)力，在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起著關(guān)鍵作用[3]。葉面積是一項(xiàng)判斷作物長(zhǎng)勢(shì)和養(yǎng)分吸收利用情況的重要指標(biāo)，廣泛應(yīng)用于生理生化、遺傳育種和作物栽培等領(lǐng)域。在一定范圍內(nèi)，增加葉面積可以提高葉面積指數(shù)，從而提高光合產(chǎn)量。但葉面積過(guò)大，可能會(huì)在植物生長(zhǎng)中后期導(dǎo)致葉片間相互遮擋，影響通風(fēng)透光、光合效率以及作物產(chǎn)量[4]。葉面積不僅受外在環(huán)境條件影響，也受內(nèi)在遺傳規(guī)律調(diào)控。因此，明確番茄葉面積的遺傳規(guī)律，獲得控制葉面積性狀的QTL位點(diǎn)，對(duì)創(chuàng)制番茄優(yōu)異種質(zhì)資源、選育優(yōu)質(zhì)番茄新品種有重要意義。

目前，常用的測(cè)量葉面積的方法主要有稱(chēng)重法、方格法、排水法、剪紙法、圖像處理法、葉面積儀法與系數(shù)回歸法等[1，3，5]，各有優(yōu)缺點(diǎn)。其中，圖像處理法是近年來(lái)廣泛應(yīng)用的一種葉面積測(cè)量方法，結(jié)合了數(shù)碼照相、掃描儀和圖像處理軟件，該方法操作簡(jiǎn)單，受葉片形狀、顏色、厚度以及人為因素影響較小[1，6]。ImageJ是一個(gè)開(kāi)源圖像處理軟件，主要用于科學(xué)圖像分析和處理，使用更為簡(jiǎn)單，可批量處理大量樣品并顯著提升效率[7]。使用掃描儀成像和ImageJ軟件能夠準(zhǔn)確地測(cè)量番茄葉面積[1-2]，但仍受限于掃描儀成像較慢，而數(shù)碼相機(jī)能夠在一定時(shí)間內(nèi)獲取大量圖像數(shù)據(jù)。使用數(shù)碼相機(jī)獲取大量葉片圖像后，將葉片圖像上傳至ImageJ軟件。ImageJ軟件可以將圖像轉(zhuǎn)換成灰度圖像，使葉片區(qū)域的灰度值與背景區(qū)域有明顯的差別。通過(guò)調(diào)整閾值，使圖像中所有葉片被選中，從而計(jì)算得到整體的葉面積。

許多數(shù)量性狀不僅受環(huán)境因素影響，還受基因的復(fù)雜作用機(jī)制調(diào)控。為了更好地解析這些復(fù)雜性狀的遺傳基礎(chǔ)，采用主基因+多基因混合遺傳模型的分析方法[8-9]，可以快速對(duì)植物農(nóng)藝性狀的遺傳規(guī)律做出初步判斷，還可以計(jì)算基因互作、上位性效應(yīng)以及基因與環(huán)境間互作的數(shù)值[10]。葉面積是一個(gè)典型的數(shù)量遺傳性狀，且受到環(huán)境因素影響。葉面積遺傳已經(jīng)在大麥[11]、小麥[12]、苜蓿[13]等多種作物中得到了廣泛的研究。番茄作為模式植物，已經(jīng)在花序[14-15]、果實(shí)顏色及形狀[16]等性狀中進(jìn)行了遺傳規(guī)律研究，但葉面積相關(guān)研究較少。

集團(tuán)分離分析法（bulked-segregant analysis，BSA）是一種有效且簡(jiǎn)便的基因定位方法，在數(shù)量性狀的研究中具有顯著優(yōu)勢(shì)。與傳統(tǒng)的QTL定位方法相比，BSA不需要全基因組的標(biāo)記圖譜，只需比較具有極端表型的個(gè)體群體之間的遺傳差異，快速識(shí)別與目標(biāo)性狀相關(guān)的基因或基因區(qū)域，極大地節(jié)省了時(shí)間和資源[17-18]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)快速發(fā)展，測(cè)序準(zhǔn)確度不斷提升以及測(cè)序成本大幅降低，BSA與二代測(cè)序結(jié)合形成的BSA-seq技術(shù)成為一種快速高效、低成本研究復(fù)雜數(shù)量性狀的有力工具[19]，相較于傳統(tǒng)分子標(biāo)記圖位克隆，降低了對(duì)分子標(biāo)記的依賴程度，大大提高了QTL定位效率。Takagi等[20]提出了一種結(jié)合BSA和全基因組重測(cè)序技術(shù)（whole-genome resequencing）的QTL定位方法——QTL-seq，此方法可以高效、快速地識(shí)別QTL，并使用該方法成功定位了水稻抗稻瘟病和幼苗活力的QTL。目前，該技術(shù)已在黃瓜抗白粉病[21]、水稻矮化主要基因定位[22]、番茄抗葉霉病[23]、番茄抗晚疫病[24]、大豆高蛋白質(zhì)含量候選基因定位[25]等研究中成功應(yīng)用。

目前，對(duì)于番茄遺傳規(guī)律分析和基因定位的研究多集中在花和果實(shí)相關(guān)性狀方面，對(duì)于控制番茄葉面積的相關(guān)研究較少。筆者以葉面積大小差異明顯的番茄品種為親本，構(gòu)建六世代群體。利用數(shù)碼相機(jī)和ImageJ軟件，快速、批量處理番茄六世代群體的葉面積。采用主基因+多基因混合遺傳模型分析法對(duì)數(shù)量性狀進(jìn)行遺傳規(guī)律分析，以明確番茄葉面積的遺傳規(guī)律。選取F2中極端表型個(gè)體進(jìn)行混池測(cè)序和基因定位，獲得初步定位區(qū)間，進(jìn)而為進(jìn)一步挖掘控制番茄葉面積的基因奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為培育番茄優(yōu)良新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院蔬菜逆境生物學(xué)課題組提供。以葉面積較小的番茄品種21GA04作為母本（P1），葉面積較大的番茄品種19GA13作為父本（P2）（圖 1）。二者雜交獲得F1，F(xiàn)1自交獲得F2，F(xiàn)1與母本回交獲得BCP1，與父本回交獲得BCP2，由此構(gòu)成六世代群體（P1、P2、F1、F2、BCP1和BCP2）。供試材料于2024年1月播種育苗，3月于陜西省楊陵區(qū)曹辛莊試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)定植，株距40 cm，行距50 cm，按常規(guī)番茄種植方法進(jìn)行田間管理。P1和P2各種植9株，F(xiàn)1種植12株，F(xiàn)2群體336株，BCP1群體153株，BCP2群體135株。定植后30 d收集六世代群體的嫩葉，用于BSA-seq和基因定位。所有樣品液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 葉面積測(cè)定 待番茄植株第3穗花完全開(kāi)放時(shí)，選取第8片完整的葉片，將葉片從葉柄基部完整剪下。將剪下的葉片拆分平整地貼在白色不干膠貼紙（A3或A4幅面）上，若葉片過(guò)大則拆分粘于多張貼紙上，寫(xiě)明編號(hào)，放置比例尺，使用數(shù)碼相機(jī)（尼康D5300）拍照。用ImageJ v2.1.0軟件批量處理測(cè)量葉面積，每個(gè)葉片重復(fù)測(cè)量3次，取平均值[1]。

ImageJ軟件測(cè)定單個(gè)葉片面積步驟如下：打開(kāi)ImageJ軟件，F(xiàn)ile/Open打開(kāi)目標(biāo)文件；Analyze/Set Scale設(shè)置比例尺；Plugins/Macros/Record，設(shè)定操作代碼記錄框；Image/color/split channels，采用Blue通道進(jìn)行下一步；Image/Type/32-bit，調(diào)整圖片；Image/Duplicate，截取合適的圖片大??；Image/Adjust/Threshold，紅色自動(dòng)填充；Analyze/Measure，打開(kāi)結(jié)果框并記錄結(jié)果；Process/Batch/Macro，批量處理。若單個(gè)葉片拆分后超過(guò)一張貼紙，則合并測(cè)量結(jié)果。上述步驟3次重復(fù)，對(duì)同一葉片測(cè)量所得結(jié)果取平均值。

1.2.2 六世代遺傳分析 將ImageJ軟件所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Microsoft Excel 2010軟件中進(jìn)行整理，采用Windows軟件包SEA-G4F6[26]，對(duì)本試驗(yàn)中六世代群體葉面積進(jìn)行聯(lián)合分析，利用極大似然估計(jì)法（maximum likelihood method，MLV）和迭代最大期望算法（iterated expectation and conditional maximization，IECM）對(duì)各世代的相應(yīng)參數(shù)進(jìn)行估計(jì)[27]。根據(jù)赤池信息準(zhǔn)則（Akaike’s Information Criterion，AIC）最小原則及模型適合性檢驗(yàn)選出最優(yōu)模型，并通過(guò)最小二乘法估算其一階遺傳參數(shù)和二階遺傳參數(shù)[10]。

1.2.3 DNA提取和混池構(gòu)建 在F2分離群體中，選擇30株葉面積極端大的植株和30株葉面積極端小的植株，以及2個(gè)親本材料的幼嫩植株葉片，利用CTAB法提取DNA。提取DNA后，利用NanoDrop微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，將30個(gè)葉面積極端大的植株和30個(gè)葉面積極端小的植株DNA分別等量混合，構(gòu)建極端混池，分別命名為葉面積-H和葉面積-L。2個(gè)親本及2個(gè)極端混池由武漢貝納公司進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建和測(cè)序。親本池與2個(gè)極端混池測(cè)序深度均為30X。使用FastQC軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，去除原始序列的接頭并過(guò)濾掉低質(zhì)量的序列。使用QTL-seq軟件包[20]，以番茄參考基因組（SL4.0 版本）作為參考基因組，選擇21GA04作為參考親本，分別計(jì)算2個(gè)極端混池的SNP-index（即SNP指數(shù)），過(guò)濾掉SNP指數(shù)小于0.3和SNP深度小于8的位點(diǎn)，高池（葉面積-H）SNP-index與低池（葉面積-L）SNP-index作差得到ΔSNP-index。以2000 bp為窗口、100 bp為步長(zhǎng)，繪制ΔSNP-index在各個(gè)染色體上的分布圖，選取95%置信度作為篩選閾值，超過(guò)篩選閾值的窗口作為候選區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄葉面積的表型變異分析

供試番茄雙親21GA04和19GA13的葉片具有明顯差異，21GA04表現(xiàn)為葉片顏色深，葉面積為543.24 cm2；而19GA13葉片顏色淺，葉面積為701.66 cm2（圖 1，表 1）。

21GA04×19GA13的六世代群體中，F(xiàn)1的葉面積均值為676.83 cm2，處于雙親之間且接近葉面積大的親本P2。F2分離群體葉面積最大值為1 548.06 cm2，最小值為212.23 cm2，平均值為646.13 cm2，介于雙親之間；BCP1的葉面積均值為531.88 cm2，小于雙親且偏向于P1；BCP2的葉面積均值為743.18 cm2，大于雙親且偏向于P2（表 1）。F2、BCP1和BCP2 3個(gè)分離世代的變異系數(shù)為30.13%～34.83%，均大于P1、P2和F1 3個(gè)非分離世代的變異系數(shù)，表明分離群體離散程度高，變異范圍廣，具有較高的遺傳多樣性。

對(duì)F2、BCP1和BCP2 3個(gè)分離世代的葉面積頻率分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)各分離世代頻率分布均呈連續(xù)的偏正態(tài)分布（圖2）。對(duì)分離群體葉面積進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果表明，偏度為0.258～0.795，峰度為-0.056～0.780，偏度和峰度均接近于0，即表現(xiàn)為近似正態(tài)分布。表明番茄葉面積是數(shù)量性狀，可以進(jìn)行主基因+多基因遺傳分析。

2.2 葉面積遺傳模型分析

采用植物數(shù)量性狀主基因+多基因混合遺傳模型的多世代聯(lián)合分析法，對(duì)番茄六世代群體葉面積進(jìn)行遺傳分析，得到24種遺傳模型的MLV值和AIC值。根據(jù)AIC值最小原則選出3個(gè)遺傳模型作為最優(yōu)模型的備選模型，發(fā)現(xiàn)2MG-ADI、MX1-AD-ADI、MX2-ADI-AD這3個(gè)模型的AIC值最小，分別為9 516.095、9 519.752、9 516.459，可作為葉面積的備選模型（表2）。

對(duì)六世代群體的3個(gè)備選模型進(jìn)行適合性檢驗(yàn)，以進(jìn)一步得到控制葉面積的最優(yōu)遺傳模型。根據(jù)適合性檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量達(dá)到顯著水平個(gè)數(shù)最少的原則，對(duì)3個(gè)備選模型進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)2MG-ADI模型有2個(gè)統(tǒng)計(jì)量達(dá)到了顯著水平，MX1-AD-ADI和MX2-ADI-AD模型都只有1個(gè)統(tǒng)計(jì)量達(dá)到了顯著水平（表3）。結(jié)合AIC值最小原則，最終將MX2-ADI-AD確定為番茄葉面積的最適遺傳模型，即2對(duì)加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因混合模型（表2，表3）。

通過(guò)SEA軟件計(jì)算得出番茄葉面積的最優(yōu)遺傳模型MX2-ADI-AD的一階遺傳參數(shù)和二階遺傳參數(shù)估計(jì)值（表4）。番茄葉面積的2對(duì)主基因加性效應(yīng)（da、db）均為-66.942 4，表明2對(duì)主基因的加性效應(yīng)為負(fù)向加性效應(yīng)，且效應(yīng)相同。2對(duì)主基因的顯性效應(yīng)（ha、hb）分別為141.298 6和242.726 0，表明2對(duì)主基因的顯性效應(yīng)均為正向顯性效應(yīng)，且第2對(duì)主基因的顯性效應(yīng)大于第1對(duì)主基因。2對(duì)主基因的加性效應(yīng)的絕對(duì)值均小于顯性效應(yīng)，表明番茄葉面積遺傳主要受2對(duì)主基因顯性效應(yīng)控制。在上位性效應(yīng)中，2對(duì)主基因的加性×加性（i）、顯性×顯性（l）、加性×顯性（jab）、顯性×加性（jba）互作效應(yīng)分別為-83.645 0、-333.833 0、-163.900 0、-62.472 2，均表現(xiàn)為負(fù)向效應(yīng)。多基因的加性效應(yīng)[d]和顯性效應(yīng)[h]分別為83.375 3和225.431 7，表明多基因的顯性效應(yīng)更強(qiáng)且為正向。由二階遺傳參數(shù)可知，BCP1、BCP2和F2 3個(gè)分離世代的主基因遺傳率h2mg分別為20.82%、30.18%、55.17%，多基因遺傳率h2pg分別為0.98%、24.51%、0。表明在BCP1群體中番茄葉面積的遺傳以主基因貢獻(xiàn)為主，多基因貢獻(xiàn)較?。辉贐CP2群體中葉面積主基因遺傳效應(yīng)略大于多基因遺傳效應(yīng)；在F2群體中葉面積只受主基因控制。BCP1、BCP2和F2 3個(gè)分離世代的主基因+多基因遺傳率分別為21.80%、54.69%、55.17%。說(shuō)明3個(gè)分離世代均受到環(huán)境影響，其中BCP1群體受環(huán)境影響最大，占78.20%，BCP2與F2群體環(huán)境因素占44.83%～45.31%。

2.3 番茄葉面積基因定位

2.3.1 原始測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量 以21GA04為母本、19GA13為父本構(gòu)建六世代群體，在F2中篩選出葉面積小的和葉面積大的植株各30株，分別提取DNA構(gòu)建2個(gè)極端混池，與2個(gè)親本材料進(jìn)行BSA-seq測(cè)序，共獲得堿基數(shù)為188.38 Gb。為了保證測(cè)序的質(zhì)量，對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾處理，從而獲得Clean reads進(jìn)行后續(xù)分析。過(guò)濾后共得到Clean bases 186.19 Gb，Q30為95.29%～96.28%，GC含量為35.57%～35.95%（表5）。表明BSA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量高，可以繼續(xù)后續(xù)基因定位分析。

2.3.2 基于SNP位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析 以親本21GA04作為參考數(shù)據(jù)，分別計(jì)算2個(gè)混池的SNP-index值，進(jìn)行性狀定位。利用LOESS回歸擬合方法分析2個(gè)極端混池的ΔSNP-index值在番茄各染色體上的分布（圖 3），選擇超過(guò)95%閾值的區(qū)域作為與番茄葉面積性狀相關(guān)的關(guān)聯(lián)區(qū)間。在番茄1號(hào)染色體的89.0～89.8 Mb區(qū)間內(nèi)定位到1個(gè)控制葉面積性狀的位點(diǎn)，該區(qū)域大小為0.8 Mb，該區(qū)間包括120個(gè)基因。在8號(hào)染色體的2.1～4.5 Mb區(qū)間內(nèi)定位到1個(gè)控制葉面積性狀的位點(diǎn)，該區(qū)域大小2.4 Mb，該區(qū)間包括191個(gè)基因。在9號(hào)染色體的63.9～64.8 Mb區(qū)間內(nèi)定位到1個(gè)控制葉面積性狀的位點(diǎn)，該區(qū)域大小0.9 Mb，該區(qū)間包括102個(gè)基因（表6）。

2.3.3 候選區(qū)域的基因功能注釋 通過(guò)KEGG、GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)候選區(qū)間內(nèi)的基因進(jìn)行注釋?zhuān)焖儆行У睾Y選出與目標(biāo)性狀相關(guān)的基因。把候選區(qū)域內(nèi)的413個(gè)基因進(jìn)行KEGG代謝途徑分析（圖4），共獲得了7個(gè)途徑，分別是植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、環(huán)境信息處理、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、氨基酸代謝、丙酮酸代謝和泛素系統(tǒng)。利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)候選區(qū)間內(nèi)的413個(gè)基因進(jìn)行功能注釋?zhuān)Y(jié)果顯示（圖5），在分子功能部分，富集到注釋基因較多的種類(lèi)是維生素B6結(jié)合、磷酸吡哆醛結(jié)合、維生素結(jié)合和衰老蛋白質(zhì)自締合等。在細(xì)胞成分部分，注釋基因在微管相關(guān)復(fù)合物和微管細(xì)胞骨架等富集較多。在生物學(xué)過(guò)程部分，注釋基因主要在亞麻酸代謝途徑、L-氨基酸生物合成過(guò)程、蛋白質(zhì)氨基酸生物合成過(guò)程、蛋白質(zhì)氨基酸代謝過(guò)程和L-氨基酸代謝過(guò)程等富集較多。在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中富集到了SlSAUR20和SlSAUR21基因。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，SAUR19-24作為生長(zhǎng)素反應(yīng)因子下游基因，可促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)增，調(diào)控葉片器官發(fā)育，其可能作為與葉片發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因[28]。

3 討論與結(jié)論

番茄是我國(guó)種植面積最廣、產(chǎn)量最大的蔬菜作物之一，其葉片是進(jìn)行光合作用的主要器官，葉面積是作物栽培、遺傳育種、植物營(yíng)養(yǎng)、植物生理生態(tài)以及生理生化等研究領(lǐng)域的重要指標(biāo)[29]，葉面積過(guò)大或過(guò)小都會(huì)影響番茄光合效率和產(chǎn)量。因此，準(zhǔn)確地測(cè)定葉面積十分重要。傳統(tǒng)的葉面積測(cè)量方法包括稱(chēng)重法、方格法、剪紙法、排水法、圖像處理法、葉面積儀法與系數(shù)回歸法等，各方法都存在明顯的缺點(diǎn)[1-3]。隨著數(shù)碼相機(jī)技術(shù)和計(jì)算機(jī)圖像處理軟件的開(kāi)發(fā)利用，研究者建立了利用數(shù)碼相機(jī)和掃描儀獲取葉片圖像、結(jié)合Photoshop軟件測(cè)定葉面積的方法[6]，此方法適用范圍廣，受葉片顏色、厚度以及人為因素影響小。隨后有研究者建立了一種用掃描儀獲得葉片圖像并結(jié)合ImageJ軟件快速處理大量番茄葉面積的方法[1]。筆者在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，由于番茄葉片完全生長(zhǎng)伸展后容易卷曲，小葉之間有部分區(qū)域重疊覆蓋，采用平壓拍照或葉面積儀獲取時(shí)會(huì)產(chǎn)生誤差，影響測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，部分番茄品種第8片葉停止伸展時(shí)，整體大小超出一般掃描儀或葉面積儀平臺(tái)面積范圍。因此，筆者對(duì)所有葉片進(jìn)行拆分，完全展開(kāi)并粘于貼紙上，從而獲得完整的葉面積，有效地解決了上述問(wèn)題。同時(shí)，利用數(shù)碼相機(jī)和ImageJ軟件，批量處理番茄葉面積，同時(shí)可以自動(dòng)記錄輸出結(jié)果，方便快捷。

蓋鈞鎰等[9]提出了一種基于主基因+多基因混合遺傳模型的植物數(shù)量性狀分析方法，此方法既可以檢測(cè)數(shù)量性狀主基因和多基因的存在，還可以估算基因遺傳效應(yīng)、方差等遺傳參數(shù)。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的進(jìn)步，曹錫文等[26]研發(fā)出適用于Windows界面的植物數(shù)量性狀分離分析（segregation analysis，SEA）軟件包，在遺傳研究中被廣泛應(yīng)用。該方法已經(jīng)在番茄萼片形態(tài)[30]、番茄苗期耐低溫性[31]、辣椒果皮顏色[32]、辣椒果實(shí)性狀[33]、黃瓜葉面積[34]、辣椒株高[35]等園藝作物主要性狀遺傳分析中應(yīng)用。筆者利用主基因+多基因混合遺傳模型，對(duì)葉面積較小的21GA04和葉面積較大的19GA13構(gòu)建的六世代群體的葉面積遺傳規(guī)律進(jìn)行初步分析。有研究表明，黃瓜葉面積是由2對(duì)加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性-上位性多基因控制[33]。而本研究結(jié)果顯示，番茄葉面積符合MX2-ADI-AD模型，是由2對(duì)加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因控制。研究結(jié)果的差異可能是作物類(lèi)型不同導(dǎo)致的。

QTL-seq是一種將BSA與全基因組測(cè)序進(jìn)行結(jié)合，融合了傳統(tǒng)QTL定位和BSA-seq的優(yōu)勢(shì)，快速識(shí)別與目標(biāo)性狀相關(guān)聯(lián)的數(shù)量性狀位點(diǎn)的技術(shù)。目前，QTL-seq在水稻、大豆、大麥和黃瓜等作物的主要農(nóng)藝性狀定位上均有廣泛應(yīng)用[20，36-38]，也已經(jīng)成功應(yīng)用于有關(guān)番茄果型相關(guān)性狀、風(fēng)味、檸檬酸含量等性狀的QTL定位[39-41]。筆者使用QTL-seq分析方法，快速將番茄葉面積基因候選區(qū)域定位于1號(hào)染色體89.0～89.8 Mb區(qū)域，8號(hào)染色體2.1～4.5 Mb區(qū)域，9號(hào)染色體63.9～64.8 Mb區(qū)域。在1號(hào)染色體的候選區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)了SlSAUR20和SlSAUR21基因。研究表明，生長(zhǎng)素誘導(dǎo)最迅速和最強(qiáng)的基因是SAURs基因家族的一些成員[42]，廣泛地調(diào)節(jié)細(xì)胞、生理和發(fā)育過(guò)程，其啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)還包含1個(gè)或多個(gè)生長(zhǎng)素反應(yīng)元件[43]。在擬南芥中，SAUR19通過(guò)促進(jìn)H+-ATPases蛋白序列中947號(hào)位Thr磷酸化，使H+-ATPases轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿峄幕钚誀顟B(tài)，從而導(dǎo)致質(zhì)外體酸化和細(xì)胞擴(kuò)增增加[43]。因此，推測(cè)這2個(gè)基因最有可能是影響葉面積大小的候選基因，后續(xù)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。目前的研究進(jìn)展表明，SAURs基因家族對(duì)植物器官發(fā)育具有非常重要的作用，如根系發(fā)育[44]，增加作物產(chǎn)量[45]，還有研究表明，SAUR基因參與植物的逆境適應(yīng)過(guò)程[46]。生長(zhǎng)素如何促進(jìn)葉器官的發(fā)育，其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，應(yīng)用主基因+多基因聯(lián)合遺傳分析法獲得了番茄葉面積最適遺傳模型MX2-ADI-AD，由2對(duì)主基因+多基因控制?；赒TL-seq 分析法鑒定到3個(gè)區(qū)域與番茄葉面積性狀顯著關(guān)聯(lián)，分別位于番茄1號(hào)染色體的89.0～89.8 Mb（該區(qū)間包含120個(gè)基因）、8號(hào)染色體的2.1～4.5 Mb（包含191個(gè)基因）和9號(hào)染色體的63.9～64.8 Mb（包含102個(gè)基因）。通過(guò)KEGG和GO富集分析在1號(hào)染色體上篩選到SlSAUR20和SlSAUR21基因?yàn)殛P(guān)聯(lián)葉面積性狀的候選基因。

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