一株羊源A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的分子生物學(xué)診斷

摘 要：為查明河南省鄧州市某羊場病死羊病因，盡快控制病情，采集病羊肝臟、肺臟和脾臟等器官組織樣本進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增測序，并利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，PCR鑒定毒素基因分型。結(jié)果表明，在病料中分離鑒定出一株分離菌；對該分離菌株進(jìn)行16S rDNA基因擴(kuò)增，得到1 400 bp陽性條帶，與產(chǎn)氣莢膜梭菌核苷酸同源性均在99.6%以上，進(jìn)行核苷酸同源性比對，與產(chǎn)氣莢膜梭菌參考菌株相似性在99.6%以上，表明為產(chǎn)氣莢膜梭菌；PCR毒素基因分型得到324 bp陽性條帶，符合α毒素基因特征，證實(shí)其為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌，命名為DENGZHOU202409；構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DENGZHOU202409菌株與上海人源218002-301、印度豹源ATCC 13124處于同一小分支，親緣關(guān)系較近。綜上所述，DENGZHOU202409分離菌株為此次羊群感染致病的病原菌，為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

關(guān)鍵詞：羊；產(chǎn)氣莢膜梭菌；16S rDNA；毒素分型

中圖分類號：S826；S855.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號：1674-7909（2025）1-104-4

DOI：10.19345/j.cnki.xckj.1674-7909.2025.01.018

0 引言

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）是一種革蘭氏陽性、厭氧性芽孢桿菌，廣泛分布于土壤、水體和腐爛植物殘?bào)w等環(huán)境中，也存在于人類和動(dòng)物的胃腸道中。作為機(jī)會(huì)性病原菌，該菌能夠在免疫力下降的宿主腸道內(nèi)迅速增殖并產(chǎn)生20多種毒素［1］，可導(dǎo)致宿主食物中毒、氣性壞疽、腸毒血癥及多器官組織損傷，出現(xiàn)不同病理特征［2］，會(huì)給畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康帶來嚴(yán)重危害。

2024年9月初，河南省鄧州市某養(yǎng)羊場部分羊陸續(xù)出現(xiàn)食欲下降、便血、腹瀉和腹部膨脹的癥狀；病羊發(fā)病突然，肌注氨芐西林注射液后未明顯好轉(zhuǎn)，陸續(xù)出現(xiàn)死亡（發(fā)病到死亡的時(shí)間為1～2 d）；共發(fā)病6只，死亡4只。為盡快查明病因，控制病情，采用細(xì)菌培養(yǎng)、16S rDNA核酸PCR擴(kuò)增、測序比對和毒素基因分型等技術(shù)手段，從病死羊組織器官中分離鑒定出1個(gè)菌株。

1 材料與方法

1.1 病料采集和試驗(yàn)動(dòng)物

無菌采集病死羊肺臟、脾臟、肝臟和腸道內(nèi)容物等樣本，將其分別裝入不同采樣袋，記錄編號、樣本名稱和日期等必要信息，并立即送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原學(xué)檢測。

1.2 主要試劑和儀器

TSN瓊脂、綿羊血平板，均購自杭州微生物試劑有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；16S rDNA Bacterial Identification PCR kit試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提取試劑盒（Ver.4.0）、PGM-T產(chǎn)物克隆試劑盒（VT302-02）、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、2×Taq PCR MasterMix及DL 1500 DNA Marker，購自天根生化科技（北京）有限公司；凝膠成像儀（TGel Plus）、梯度PCR儀（OSE-GP-03/05），購自天根生化科技（北京）有限公司；生物顯微鏡（CX23），購自上海倍萊德儀器有限公司；電泳儀（DYCZ-24FN），購自北京六一生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

參考王斌等［3］、劉增祿等［4］和司南等［5］學(xué)者研究方法，利用Primer Premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)7對產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因分型引物，委托華大基因有限公司合成。引物信息見表１。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng)

將病料分別接種于綿羊血平板和TSN瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)菌落制作涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，并鏡檢。同時(shí)，挑取單個(gè)菌落多次在TSN瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種增菌，觀察細(xì)菌在培養(yǎng)基上的表型特征。

1.5 細(xì)菌16S rDNA PCR檢測和遺傳進(jìn)化分析

利用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取分離菌株DNA，以此為模板，采用16S rDNA Bacterial Identification PCR kit試劑盒提供的引物（F：5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′，R：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)展菌種鑒定。反應(yīng)體系：2×Taq PCR MasterMix 25μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板50～100 ng，補(bǔ)足16S-free H2O至總體積50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30ｓ，55 ℃ 30ｓ，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。將擴(kuò)增得到的陽性DNA片段與pGM-T Easy載體進(jìn)行16 ℃過夜連接反應(yīng)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中；轉(zhuǎn)化后，將細(xì)胞復(fù)蘇并涂布于含有氨芐抗性的LB平板上；將涂布好的平板倒置放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。觀察平板上長出的菌落，選擇邊緣清晰、單獨(dú)生長的白色菌落，用無菌牙簽或接種環(huán)挑取單菌落，并轉(zhuǎn)移到新的含有氨芐抗性的LB平板上進(jìn)行放大培養(yǎng)。將培養(yǎng)過的菌液進(jìn)行離心處理，棄上清液，留細(xì)菌沉淀；然后按照質(zhì)粒小提試劑盒說明書操作提取質(zhì)粒，將經(jīng)PCR鑒定正確的陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。在NCBI數(shù)據(jù)庫中選擇參考菌株（見表2），采用 MEGA7. 0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 細(xì)菌毒素基因分型PCR檢測

利用產(chǎn)氣莢膜梭菌7對毒素基因分型引物，分別對分離菌株P(guān)CR檢測攜帶毒素基因情況，以判定分離菌株毒素類型。PCR反應(yīng)體系同1.5章節(jié)中表述，反應(yīng)程序除退火溫度（各引物退火溫度見表1）外，其余程序不變。反應(yīng)結(jié)束后，4 ℃保存，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。陽性產(chǎn)物膠回收、純化，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，并將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST核苷酸同源性比對。

2 結(jié)果分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

細(xì)菌37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，在TSN培養(yǎng)基上形成黑色菌落（如圖1A）、在綿羊血培養(yǎng)基上形成雙層溶血環(huán)（如圖1B）。鏡檢可見，細(xì)菌外觀為短粗桿狀，單個(gè)或成對排列，革蘭氏染色陽性（如圖1C）。此次從肝臟、腸系膜、脾臟和腎臟病料中共分離4株表型一致的細(xì)菌，命名為DENGZHOU202409。

2.2 細(xì)菌16S rDNA基因PCR檢測和遺傳進(jìn)化分析

DENGZHOU202409菌株16S rDNA基因PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在1 400 bp處產(chǎn)生一條明亮清晰條帶（見圖2），符合預(yù)期目的條帶。序列BLAST比對結(jié)果顯示，DENGZHOU202409菌株與產(chǎn)氣莢膜梭菌核苷酸同源性均在99.6%以上，表明為產(chǎn)氣莢膜梭菌。核苷酸同源性比對，DENGZHOU202409菌株與參考株相似性均為99.6%。通過構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹（見圖3）分析，發(fā)現(xiàn)DENGZHOU202409菌株與上海人源218002-301、印度豹源ATCC 13124處于同一小分支，親緣關(guān)系較近，與西藏牦牛源BG01、華東兔源SD14-02、云南奶山羊源KM-1、韓國驢源KSJ-28和北京人源1005-15098親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 細(xì)菌毒素基因分型

利用產(chǎn)氣莢膜梭菌特異性毒素基因引物PCR擴(kuò)增分離菌株，電泳檢測發(fā)現(xiàn)該菌株產(chǎn)生大小為324 bp的條帶（見圖4），初步判斷為編碼α毒素基因（clostridium perfringens alpga，CPA），未檢出其他6種毒素基因片段。測序BLAST比對可知，與CPA基因核苷酸同源性為99.9%，證實(shí)分離菌株為攜帶α毒素的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

3 討論

感染A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的反芻動(dòng)物死亡率為70%～100%［6］。A型產(chǎn)氣莢膜梭菌會(huì)產(chǎn)生幾種毒素，包括腸毒素和β2［7］。關(guān)于反芻動(dòng)物A型腸道感染的發(fā)病機(jī)制，一般認(rèn)為大多數(shù)臨床癥狀和病變是由CPA的影響造成的［8］。CPA是氣性壞疽的主要致病因，位于染色體上，高度保守，因此存在于所有產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株中。α毒素是一種磷脂酶C鞘磷脂酶（卵磷脂酶），它與細(xì)胞膜結(jié)合并導(dǎo)致脂質(zhì)雙層的破壞。這種毒素具有溶血和損害皮膚作用。α毒素水解卵磷脂產(chǎn)生二?；视?，從而刺激真核細(xì)胞磷脂酶和花生四烯酸級聯(lián)反應(yīng)［9-10］。這個(gè)過程可能會(huì)導(dǎo)致血管通透性、血小板聚集和血管收縮的改變。

4 結(jié)論

利用分子生物學(xué)方法對河南省鄧州市某羊場病羊進(jìn)行病原學(xué)檢測，證實(shí)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌是病羊的致病因子，可為今后產(chǎn)氣莢膜梭菌流行病學(xué)研究和防控提供臨床資料參考。

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Molecular Biological Diagnosis of a Strain of Sheep-derived

Clostridium" Perfringens Type A

WANG Kui

Dengzhou Animal Disease Prevention and Control Center， Dengzhou 474150， China

Abstract： In order to determine the cause of dead sheep in a sheep farm in Dengzhou City and control the spread of the disease as soon as possible， the samples of liver， lung， spleen and other organs and tissues of the diseased sheep were collected for bacterial 16S rDNA PCR amplification and sequencing. The phylogenetic tree was constructed using MEGA7.0 software， and the toxin genotyping was identified by PCR. The results showed that a strain of isolated bacteria was isolated and identified in the diseased material. The 16S rDNA gene of the isolated strain was amplified to obtain a 1 400 bp positive band， and the nucleotide sequence homology with Clostridium perfringens was more than 99.6%. The nucleotide homology was compared with the reference strain of Clostridium perfringens， and the similarity was more than 99.6%， indicating that it was Clostridium perfringens. A 324 bp positive band was obtained by PCR toxin genotyping， which was consistent with the characteristics of alpha toxin gene. It was confirmed to be Clostridium perfringens type A and named DENGZHOU202409. By constructing a genetic phylogenetic tree analysis， DENGZHOU202409 strain was in the same small branch with Shanghai human source 218002-301 and Indian leopard source ATCC 13124， and the genetic relationship was close. In summary， the isolated strain of DENGZHOU202409 was the pathogenic bacteria of this sheep infection. This experiment provided a clinical reference data for the diagnosis and treatment of Clostridium perfringens.

Key words： sheep; Clostridium perfringens; 16S rDNA; toxin typing

（欄目編輯：姜春艷）

作者簡介：王奎（1988—），男，碩士，助理獸醫(yī)師，研究方向：動(dòng)物疫病防控。