大別山五針?biāo)筛H微生物和內(nèi)生菌群落特征及功能多樣性

摘 要： "為探明大別山五針?biāo)筛H微生物和內(nèi)生菌群落特征及功能多樣性，該文以大別山五針?biāo)筛H土壤和根部組織為研究對象，利用高通量測序技術(shù)分析根際微生物和根部內(nèi)生菌群落特征，并利用PICRUSt和FUNGuild軟件分別對細(xì)菌群落和真菌群落進行功能預(yù)測。結(jié)果表明：（1）根際微生物總操作分類單元（OTUs）數(shù)目和α-多樣性指數(shù)均明顯大于根部內(nèi)生菌。（2）根際微生物主要由厚壁菌門（如李斯特氏菌屬）、變形菌門（如醋桿菌屬）、子囊菌門（如鐮刀菌屬和毛殼屬）等菌群構(gòu)成，而根部內(nèi)生菌則以厚壁菌門（如乳桿菌屬和芽孢菌屬）、子囊菌門（如枝孢菌屬）、擔(dān)子菌門（如須腹菌屬和針菌屬）菌群為主。（3）功能預(yù)測結(jié)果顯示，根際細(xì)菌群落在細(xì)胞運動性、環(huán)境適應(yīng)性、氨基酸代謝等功能方面較為突出，而根部內(nèi)生細(xì)菌功能主要體現(xiàn)在酶家族、消化系統(tǒng)、能量代謝等方面；根際真菌群落和根部內(nèi)生真菌均含有共生營養(yǎng)型、腐生營養(yǎng)型、病理營養(yǎng)型，以及多種交叉營養(yǎng)型的真菌類群，并且外生菌根更多富集在根部組織中。該研究認(rèn)為，大別山五針?biāo)筛H微生物與根部內(nèi)生菌在菌群豐富度、群落結(jié)構(gòu)組成及功能多樣性上均存在差異。該研究結(jié)果為認(rèn)識大別山五針?biāo)筛H微生物和內(nèi)生菌的結(jié)構(gòu)與功能提供了依據(jù)，也為后期開發(fā)促進大別山五針?biāo)缮L、防治其病害的菌劑提供了一定的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 大別山五針?biāo)桑?根際微生物， 內(nèi)生菌， 高通量測序， 多樣性

中圖分類號： "Q948

文獻標(biāo)識碼： "A

文章編號： "1000-3142（2025）01-0031-13

基金項目： "安徽省自然科學(xué)基金（2108085QH374）； 安慶師范大學(xué)科研項目（100001195）； 皖西南生物多樣性研究與生態(tài)保護安徽省重點實驗室開放基金（Wxn202303）； 中藥研究與開發(fā)安徽省重點實驗室開放基金（AKLPDCM202310）。

第一作者： 項小燕（1981—），博士，教授，主要從事瀕危物種資源保護與利用研究，（E-mail）xiaoyanxiang@aqnu.edu.cn。

*通信作者： "徐偉芳，博士，副教授，研究方向為環(huán)境微生物多樣性分析，（E-mail）xuweifang@ahtcm.edu.cn。

Community characteristics and functional diversity

of the rhizosphere microorganism and endophyte

from Pinus dabeshanensis

XIANG Xiaoyan"RUAN Sirui"ZHANG Ying²， ZHAO Feifei²， XU Weifang^2*

（ 1. Key Laboratory of Biodiversity and Ecology Conservation in Southwest Anhui， College of Life Sciences， Anqing Normal University，

Anqing 24613 Anhui， China; 2. Anhui Province Key Laboratory of Research ＆ Development of Chinese Medicine，

College of Pharmacy， Anhui University of Traditional Chinese Medicine， Hefei 230012， China ）

Abstract： "Pinus dabeshanensis is an endangered plant. In order to explore the community characteristics and functional diversity of plant-associated microbes， the compositions of rhizosphere microbiota and root endophyte from P. dabeshanensis were analyzed based on the high-throughput sequencing technology. And the functions of bacterial and fungal communities were predicted by using PICRUSt and FUNGuild software， respectively. The results were as follows： （1） The rhizosphere soil samples exhibited higher operational taxonomic units （OTUs） and α-diversity indices than those of the root endophyte. （2） Rhizosphere microbiota were mainly composed of microflora such as Firmicutes （genus： Listeria）， Proteobacteria （genus： Acetobacter）， Ascomycetes （genus： Fusarium and Chaetomium） and so on， while root endophyte were mainly composed of Firmicutes （genus： Lactobacillus and Bacillus）， Ascomycetes （genus： Cladosporium）， and Basidiomycetes （genus： Pleurotus and Chaetomium）. （3） The functional annotation results showed that the rhizosphere microbial community was prominent in cell mobility， environmental adaptability， and amino acid metabolism， etc.， while the root endophyte community was prominent in enzyme family， digestive system， and energy metabolism， etc. Both rhizosphere fungal community and root endophytes contained symbiotic， saprophytic， pathophytic and cross-trophic fungal groups， and ectomycorrhiza were more abundant in root tissue. Collectively， there were differences in flora richness， community structure and functional diversity between rhizosphere microorganism and root endophyte of P. dabeshanensis. The study contributes to knowledge of the structure and function of rhizosphere microorganism and endophyte of P. dabeshanensis， and "provides a theoretical basis for the later development of potential microbial agents for use in promoting plant growth and controlling plant diseases.

Key words： Pinus dabeshanensis， rhizosphere microorganism， endophyte， high-throughput sequencing， diversity

大別山五針?biāo)桑≒inus dabeshanensis）是中國特有物種，主要分布于安徽省的岳西縣和金寨縣，以及湖北省的英山縣（吳甘霖， 2016）。目前，該物種僅存200余株且處于逐漸衰退趨勢，被列為國家一級珍稀瀕危保護植物（王雷宏等，2014）。有關(guān)大別山五針?biāo)傻难芯恐饕性谖锓N競爭（王雷宏等，2014；項小燕等，2015）、種群結(jié)構(gòu)（項小燕等， 2016a）、種子萌發(fā)特性（韓建偉等，2014）、花粉活力（項小燕等， 2016b）等方面，而有關(guān)其微生物菌群的研究鮮有報道。

植物體在自然界的實際生存狀態(tài)被認(rèn)為是微生物和植物相互依存的狀態(tài)（石晶盈等， 2006）。植物內(nèi)生菌是指廣泛存在于健康植物組織中，與宿主植物共生且不引起宿主植物病害的微生物（黃雪珍和趙龍飛， 2023）。有研究推測，植物內(nèi)生菌來自土壤，土壤微生物通過侵入宿主植物，并與宿主植物共同進化逐漸成為植物內(nèi)生菌（Compant et al.， 2010; Afzal et al.， 2019） 。內(nèi)生菌種群組成和數(shù)量可能與種植地土壤微生物及植物根際微生物的種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量有關(guān)（趙娟等， 2015）。也有研究表明，植物內(nèi)生菌與根際微生物種類多樣性存在一定的相關(guān)性，一些內(nèi)生細(xì)菌源于土壤（Mcinroy amp; Kloepper， 1994）。近年來，科技工作者在桑樹（Xie et al.， 2021）、三七（Tan et al.， 2017）、大豆（Pérez-Jaramillo et al.， 2019）等植物根際-土壤-微生物之間的相互作用方面做了大量的探索工作。大別山五針?biāo)墒蔷窒薹植荚谖覈髣e山區(qū)域的五針?biāo)山M唯一的一種植物，是松類樹種地理分布的特殊現(xiàn)象。然而，人們對這種特定生境下的大別山五針?biāo)筛滴⑸锶郝涮卣魅狈ο到y(tǒng)的認(rèn)知，根系微生物群落結(jié)構(gòu)與功能之間如何聯(lián)系尚不清楚。隨著分子生物學(xué)和測序技術(shù)的不斷發(fā)展，基于高通量測序技術(shù)研究環(huán)境微生物多樣性特征的報道日益增多（秦宇蒙等， 2021）。探明大別山五針?biāo)筛迪嚓P(guān)微生物的種群分布特征，并預(yù)測其功能，對解析大別山五針?biāo)傻纳鷳B(tài)生存機制具有重要意義。

Reinhold-Hurek等（2015）研究表明，根際微生物與植物內(nèi)生菌是促進宿主植物生長、增強宿主植物抗逆性的兩大類群。有益根際微生物通過多種機制促進植物生長，并維持植物健康，包括促進植物營養(yǎng)吸收、增強植物抗逆性、調(diào)節(jié)植物生理，并抵御土傳病害等（Gopal amp; Gupta， 2016）。植物根系會向根際分泌大量化合物，主要包含水、離子、酶、氧氣、黏液等初級代謝和次級代謝產(chǎn)物。其中，有許多被認(rèn)為可以介導(dǎo)根際中植物－微生物間的相互作用，對植物的生長和適應(yīng)性起著至關(guān)重要的作用。此外，內(nèi)生菌不僅通過分泌一些代謝產(chǎn)物如生長素、細(xì)胞分裂素等，促進植物細(xì)胞分裂、根系發(fā)育、幼苗生長，而且還通過促進植物對土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)吸收而對宿主的生長發(fā)育產(chǎn)生積極影響（劉麗輝等， 2020）。盡管越來越多的研究表明根系相關(guān)微生物為其宿主植物提供了許多有益的功能，但是大別山五針?biāo)筛H土壤菌群結(jié)構(gòu)和根部內(nèi)生菌群落分布特征如何？有哪些微生物類群可能成為促進大別山五針?biāo)缮L發(fā)育的重要資源？這是本研究旨在解決的兩大科學(xué)問題。

因此，本研究采集大別山五針?biāo)傻母H土壤和根部組織樣品，利用高通量測序技術(shù)，對根際土壤和根內(nèi)部中的細(xì)菌和真菌群落組成進行系統(tǒng)鑒定，分析定殖在大別山五針?biāo)筛抵械膬?yōu)勢微生物類群，并對其生物功能進行探討，以期揭示大別山五針?biāo)筛肯嚓P(guān)微生物的群落分布特征，為解析大別山五針?biāo)傻沫h(huán)境適應(yīng)性以及人工復(fù)壯大別山五針?biāo)煞N群提供重要理論支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年11月上旬，于大別山五針?biāo)勺匀环N群（115°24′ E、30°44′ N）分布地安徽省岳西縣大王溝海拔1 050～1 100 m范圍內(nèi)，采集陰坡健康植株樣品。采集樣品時，隨機選取3個3 m × 3 m的樣方，在每個樣方中選取1株健康植株。去除土壤表面落葉和雜草后，在植株根部一側(cè)小心挖掘，待根系露出后，挖掘部分健康根系（長度約為10 cm），采用“抖根法”（王香生等，2022），收集大別山五針?biāo)筛H東南西北4個不同方向土壤混合樣本，編號為CT，作為根際土壤DNA樣本；取同一植株東南西北4個不同方向的混合根樣為根部DNA樣本，編號為CR。待所有樣本收集完畢，立即放入冰盒帶回實驗室。

1.2 基因組DNA的提取

對根際土壤樣品，依據(jù)PowerSoil"DNA Isolation kit（MoBio， U.S.）試劑盒說明書中的方法提取總DNA。根部樣品經(jīng)75%酒精表面消毒后，利用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）方法（宮強等，2005）提取總DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng·μL^-1。

1.3 PCR擴增

以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物和New England Biolabs公司的Phusion"High-Fidelity PCR Master Mix with GCBuffer以及高效高保真酶進行PCR擴增。其中，細(xì)菌采用16S rDNA V4區(qū)基因（515F： 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′和806R： 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），真菌采用ITS1區(qū)基因（ITS5-1737F： 5′-GGAAGTAAAAGTCGT

AACAAGG-3′和ITS2-2043R： 5′-GCTGCGTTCTTCAT

CGATGC-3′）進行擴增。PCR反應(yīng)體系：Phusion Master Mix（2×）15 μL，Primer（2 μmol·^-1）3 μL，gDNA（1 ng·μL^-1）1 μL，H2O 11 μL。反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性1 min，30個循環(huán)（98 ℃， 10 s；50 ℃， 30 s；72 ℃，30 s）；72 ℃，5 min。采用Bio-rad T100梯度PCR儀，PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等濃度混樣，充分混勻后使用1×TAE濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR產(chǎn)物。其中，產(chǎn)物純化試劑盒使用Thermo Scientific公司GeneJET膠回收試劑盒。選擇主帶大小在400～450 bp之間的序列，割膠回收目標(biāo)條帶。

1.4 文庫構(gòu)建和上機測序

使用TruSeq"DNAPCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用Nova Seq6000進行上機測序。所得樣品DNA委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成測序。

1.5 測序數(shù)據(jù)處理分析

根據(jù)Barcode序列和PCR擴增引物序列，從下機數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后，使用FLAS軟件進行拼接，得到原始序列數(shù)據(jù)。經(jīng)過嚴(yán)格的過濾處理（Bokulich et al.， 2013）后，參照Qiime（Caporaso et al.， 2010）的序列質(zhì)量控制流程，通過與物種注釋數(shù)據(jù)庫進行比對（Rognes et al.， 2016），檢測且去除嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)。利用Uparse軟件對所有樣本的全部有效數(shù)據(jù)進行聚類，以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic unit， OTU），同時選取出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。通過對OTUs進行Venn圖分析和α-多樣性計算，得到不同樣本共有和特有OTUs信息以及物種豐富度和均勻度信息。利用獨立樣本t檢驗分析不同樣本的差異顯著性。此外，還對OTUs序列進行物種注釋，細(xì)菌用Mothur方法與SILVA138（Edgar， 2013）的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫（Wang et al.， 2007）進行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8～1）；真菌用Qiime軟件（Version 1.9.1）中的Blast方法（Altschul et al.， 1990）與Unit（v8.2）數(shù)據(jù)庫（Kljalg et al.， 2013）進行物種注釋分析，得到對應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況。通過R軟件（Version 3.0.3）繪制PCoA圖，探究不同樣本群落結(jié)構(gòu)的差異。物種組成分析能夠反映樣品在分類學(xué)水平的群落結(jié)構(gòu)，本研究在門水平上選取了豐度排名前5的物種，在屬水平上選取豐度前20的物種進行詳細(xì)的物種群落結(jié)構(gòu)組成分析。此外，本研究還利用PICRUSt軟件（KEGG數(shù)據(jù)庫）和FUNGuild軟件對大別山五針?biāo)筛H微生物總豐度前35的物種進行了功能預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序概況分析

經(jīng)細(xì)菌16S rRNA基因測序分析，細(xì)菌共獲得380 377條有效序列，其中3份根際土壤樣品的平均有效序列為62 202條，平均序列長度為416 bp；3份根部組織樣品的平均有效序列為64 591條，平均序列長度為409 bp。經(jīng)真菌ITS測序分析，真菌共獲得389 661條有效序列，其中3份根際土壤樣品的平均有效序列為66 142條，平均序列長度為261 bp；3份根部組織樣品的平均有效序列為63 745條，平均序列長度為268 bp。獨立樣本t檢驗分析結(jié)果顯示，根際土壤樣品和根部組織樣品有效序列數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。

由圖1可知，細(xì)菌和真菌的稀釋曲線上升到一定高度后趨于平穩(wěn)，說明測序的深度已足夠代表樣品中大多數(shù)細(xì)菌和真菌的種類，并且樣本測序數(shù)量也已足夠，可用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。

2.2 大別山五針?biāo)筛H微生物和內(nèi)生菌OTU分析

依據(jù)97%相似度對所得序列進行OTU聚類，從根際土壤樣品中共獲得1 843個細(xì)菌OTU數(shù)目和821個真菌OTU數(shù)目，從根部組織中獲得1 073個內(nèi)生細(xì)菌OTU數(shù)目和750個真菌OTU數(shù)目。因此，無論是根際菌群還是根部內(nèi)生菌，其細(xì)菌OTU數(shù)目均大于真菌OTU數(shù)目。同時，我們還發(fā)現(xiàn)，根際土壤OTU數(shù)目高于根部內(nèi)生菌OTU數(shù)目：（1）對于細(xì)菌來說，CT的總OTU數(shù)目（1 843）和特有的OTU數(shù)目（1 492）均大于CR的總OTU數(shù)目（1 073）和特有的OTU數(shù)目（722）（圖2： A）；（2）對于真菌來說，CT的總OTU數(shù)目（821）和特有的OTU數(shù)目（738）亦均大于CR的總OTU數(shù)目（750）和特有的OTU數(shù)目（667）（圖2： B）。

2.3 大別山五針?biāo)筛H菌和內(nèi)生菌α-多樣性分析

由綜合分析細(xì)菌、真菌的α-多樣性指數(shù)可知，根際土壤樣品中的微生物在細(xì)菌和真菌方面的多樣性和物種豐富度均高于根部組織樣品，但差異不顯著。根際土壤樣品細(xì)菌的Observed-species指數(shù)、Chao指數(shù)、ACE指數(shù)分別為1 964.67、2 071.78、2 082.44，均大于根部組織樣品（1 068.67、1 209.03、1 230.83），但無顯著性差異（P＞0.05）；而Shannon指數(shù)為7.80，大于根部組織樣品（3.20），并且有顯著性差異（P＜0.05），根際土壤樣品真菌的Observed-species指數(shù)、Chao指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)分別為381.67、406.95、406.49和4.82，亦均大于根部組織樣品的310.67、329.04、329.75和3.72，并且均無顯著性差異（P＞0.05）（表1）。這說明大別山五針?biāo)筛H土壤真菌的物種豐富度和多樣性高于根部內(nèi)生真菌，但兩者無顯著性差異。

2.4 大別山五針?biāo)筛H微生物和內(nèi)生菌β-多樣性分析

PCoA分析（主坐標(biāo)分析），即通過樣品間的空間距離來反映樣品組間群落結(jié)構(gòu)的差異性。其中，組間的空間距離越遠(yuǎn)，說明樣品間群落結(jié)構(gòu)差異越大（高嵩等，2021）。本文基于Unweichted Unitrac 距離進行PCoA分析，結(jié)果顯示無論是細(xì)菌還是真菌，大別山五針?biāo)筛H土壤微生物菌群和根部內(nèi)生菌菌群坐標(biāo)點的空間距離都較遠(yuǎn)，說明兩組樣品間群落結(jié)構(gòu)存在差異。由圖3可知，根際土壤樣品與根部組織樣品同組間的距離較近，表明組間群落結(jié)構(gòu)組成相似，而根際土壤樣品與根部組織樣品不同組間距離較遠(yuǎn)，表明兩組樣品的群落結(jié)構(gòu)相似性較低。

2.5 大別山五針?biāo)筛H微生物和內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

2.5.1 細(xì)菌 從大別山五針?biāo)筛H土壤樣品中獲得的細(xì)菌分布于174綱88門342目437科671屬，根部組織樣品中獲得的細(xì)菌分布于91綱40門195目255科318屬。在門分類水平上，厚壁菌門（Firmicutes）、unidentified-Bacteria和變形菌門（Proteobacteria）為兩組樣品的共有菌門。其中，前兩者在根際土壤樣品中相對豐度高于根部組織樣品（厚壁菌門： 31.31%gt;5.48%；unidentified-Bacteria： 17.70%gt;2.35%），而后者在根際土壤樣品中相對豐度低于根部組織樣品（變形菌門： 9.50%lt;23.23%）。藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）作為根部組織樣品特有的菌門，其相對豐度為61.82% （圖4）。在屬分類水平上，根際土壤樣品乳桿菌屬（Lactobacillus，0.73%）與根部組織樣品（2.60%）有顯著差異（P＜0.05），并且相對豐度低于根部組織樣品。根際土壤樣品的優(yōu)勢菌屬為李斯特氏菌屬（Planococcus， 14.46%），其次為unidentified-Actinomarinales（5.71%）、芽孢桿菌屬（Bacillus， 3.90%）和擬桿菌屬（Bacteroides， 2.85%）；而根部組織樣品的優(yōu)勢菌屬為unidentified-Chloroplast（61.46%），其次為unidentified-Mitochondria（14.10%）、乳桿菌屬（Lactobacillus，2.60%）和孿生菌屬（Macrococcus，2.44%）（表2）。

2.5.2真菌 從大別山五針?biāo)筛H土壤樣品中獲得的真菌分布于11門187屬，從根部組織樣品中獲得的真菌分布于9門262屬。在門分類水平上，子囊菌門（Ascomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、羅茲菌門（Rozellomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）為兩組樣品的共有菌門。其中，前四者在根際土壤樣品中相對豐度均高于根部組織樣品（子囊菌門： 50.56%＞47.74%; 球囊菌門： 6.75%＞0.18%；壺菌門： 5.99%＞0.07%; 羅茲菌門： 5.48%＞0.08%）；而擔(dān)子菌門相對豐度明顯低于根部組織樣品（擔(dān)子菌門： 1.40%＜40.69%）（圖4）。在屬分類水平上，籃狀菌屬（Talaromyces）、Aspergil和鐮刀菌屬（Fusarium）為兩組樣品所共有，相對豐度不同，并且不存在顯著性差異（P＞0.05）。在屬分類水平上，根際土壤樣品中的優(yōu)勢菌屬為Melanocarpus和Pithoascus，其相對豐度分別為14.92%和3.22%；而根部組織樣品中的優(yōu)勢菌屬為unidentified_Helotiales_sp、須腹菌屬（Rhizopogon）和Thozetella，其相對豐度分別為25.67%、25.37%和10.00% （表2）。

2.6 大別山五針?biāo)筛H微生物和內(nèi)生菌的功能預(yù)測

本研究利用PICRUSt軟件分析大別山五針?biāo)傻母H細(xì)菌和根部內(nèi)生細(xì)菌功能預(yù)測，并比較其代謝功能通路差異。結(jié)果如圖5所示，除了不可分類通路（Unclassified， None）以外，兩組樣品在一級功能層上共有6個代謝通路，分別為新陳代謝（Metabolism）、遺傳信息處理（Genetic_Information_Processing）、環(huán)境信息處理（Environmental_Information_Processing）、細(xì)胞進程（Cellular_Processes）、人類疾?。℉uman_Diseases）和有機系統(tǒng)（Organismal_Systems）。其中，新陳代謝通路由兩組樣品的主要功能組成，在根際細(xì)菌的占比為50.25%，在根部內(nèi)生細(xì)菌的占比為49.66%。同時，對大別山五針?biāo)筛H細(xì)菌和根部內(nèi)生細(xì)菌基因二級功能層進行預(yù)測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組樣品的二級功能層主要由膜運輸（Membrane_Transport）、氨基酸代謝（Amino_Acid_Metabolism）、碳水化合物代謝（Carbohydrate_Metabolism）、能量代謝（Energy_Metabolism）和輔助因子和維生素的代謝（Metabolism_of_Cofactors_and_Vitamins）等41個子功能組成，并且功能豐富。對二級代謝通路預(yù)測基因相對豐度較高的子功能進行分析，結(jié)果表明這些子功能基因的相對豐度在兩組樣品中存在差異。其中，根際細(xì)菌在膜運輸、氨基酸代謝、碳水化合物代謝方面特征不明顯，脂質(zhì)代謝和異生物質(zhì)生物降解代謝方面高于根部內(nèi)生細(xì)菌。在能量代謝、復(fù)制和修復(fù)、輔因子和維生素的代謝和翻譯等子功能上，根際細(xì)菌樣品低于根部內(nèi)生細(xì)菌。細(xì)胞運動性、環(huán)境適應(yīng)性等功能主要富集于根際細(xì)菌群落，而根部內(nèi)生細(xì)菌功能主要體現(xiàn)在酶家族、消化系統(tǒng)等方面。

基于FUNGuild對大別山五針?biāo)筛H真菌和根部內(nèi)生真菌的功能進行預(yù)測，并按照真菌營養(yǎng)模式進行分類。結(jié)果顯示CR和CT樣品中均富集到共生營養(yǎng)型、腐生營養(yǎng)型、病理營養(yǎng)型及多種交叉營養(yǎng)型的真菌類群，并且以前兩者為主要響應(yīng)功能群，具體包括未知腐生營養(yǎng)模式（Undefined_Saprotroph）、外生菌根（Ectomycorrhizal）、植物病原體土壤腐生物木材腐生物（Plant_Pathogen-Soil_Saprotroph-Wood_Saprotroph）、動物病原體內(nèi)生菌真菌寄生物植物病原體木材腐生物（Animal_Pathogen-Endophyte-Fungal_Parasite-Plant_Pathogen-Wood_Saprotroph）、動物病原體內(nèi)生菌植物病原體木材腐生物（Animal_Pathogen-Endophyte-Plant_Pathogen-Wood_Saprotroph）等（圖6： A）。其中，進一步對被分類的真菌營養(yǎng)模式進行差異性分析后發(fā)現(xiàn)，僅外生菌根、動物病原體內(nèi)生菌真菌寄生物植物病原體木材腐生物、動物病原體內(nèi)生菌植物病原體木材腐生物3種營養(yǎng)模式的真菌在兩者樣品中存在顯著性差異（Plt;0.05）。其中，外生菌根在CR樣品中所占比例為25.99%，顯著大于其在CT樣品中所占豐度比例（0.44%） （P=0.048）（圖6： B）。

3 討論與結(jié)論

3.1 根際微生物與根部內(nèi)生菌群落組成分析

Observed-species指數(shù)、Chao指數(shù)和ACE指數(shù)用于反映微生物的物種豐富度，而Shannon指數(shù)則用于反映物種的多樣性（武亞婷等， 2019）。本研究中，根際微生物的總OTUs數(shù)目、Observed-species指數(shù)、Chao指數(shù)和ACE指數(shù)均明顯大于根部內(nèi)生菌群。大量研究結(jié)果也證實，根際微生物的群落豐富度與多樣性均高于根部內(nèi)生菌。有關(guān)韭菜、黔中金蕎麥不同生態(tài)位群落組成的研究發(fā)現(xiàn)，韭菜和金蕎麥根際土壤微生物的OTUs數(shù)目、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson even指數(shù)均大于根部內(nèi)生菌（付靜等， 2018；張濤等， 2022；孫楠等， 2023）。肖健等（2024）的研究表明，甘蔗根際土壤樣品中真菌的Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)均大于根系內(nèi)生真菌。

本研究對于細(xì)菌來說， 厚壁菌門和變形菌門為兩個樣品的共有菌門，而與根部組織樣品相比，根際土壤樣品中還含有少量的脫硫桿菌門和擬桿菌門。其中，乳桿菌屬為兩組樣品的共有菌屬，根際土壤樣品主要菌屬為李斯特氏菌屬、芽孢桿菌屬、醋桿菌屬和擬桿菌屬，根部組織樣品主要菌屬為伯克氏菌屬、不動桿菌屬、腸桿菌屬和慢生根瘤菌屬。對于真菌來說，子囊菌門和擔(dān)子菌門為兩個樣品所共有，而與根部組織樣品相比，根際土壤樣品中還含有少量的壺菌門和羅茲菌門。其中，兩組樣品的共有菌屬為鐮刀菌屬和籃狀菌屬，根際土壤樣品的主要菌屬為毛殼屬和青霉屬，根部組織樣品的主要菌屬為須腹菌屬和針菌屬。

張秋玉等（2022）研究發(fā)現(xiàn)莼菜內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢菌群為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門，安超等（2021）研究的野生竹根七根際土的細(xì)菌主要分布在變形菌門和放線菌門，以及迪拉熱·海米提等（2021）在鹽穗木的根際土壤細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌門為放線菌門和變形菌門，而內(nèi)生真菌的優(yōu)勢門多為子囊菌門和擔(dān)子菌門，這些結(jié)果與本研究的相似。這說明不同植物根際微生物或內(nèi)生菌既存在差異，又具有一定的共性，尤其是變形菌門。Tang等（2020）研究表明，變形菌廣泛存在于土壤環(huán)境中，適應(yīng)能力強，在生理、形態(tài)和代謝等方面呈現(xiàn)出豐富的多樣性，對土壤中的碳氮循環(huán)及生態(tài)系統(tǒng)具有重要的影響。石水琴等（2022）對大別山五針?biāo)筛H細(xì)菌的研究結(jié)果與本研究的有所不同，前者主要種類為變形菌門、放線菌門和酸桿菌門，推測其原因可能是生境不同導(dǎo)致的差異。前者取樣地點為大別山五針?biāo)扇斯ち?，而本研究為天然林，植物的生境存在較大差別。

3.2 根際微生物與根部內(nèi)生菌功能預(yù)測分析

據(jù)前人研究發(fā)現(xiàn)，根部微生物對植物的生長有很大的影響，如慢生根瘤菌屬、腸桿菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、擬桿菌屬、不動桿菌屬和芽孢桿菌屬等都被證實可促進植物生長（張典利等，2018）。朱滕滕等（2023）研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬、不動桿菌屬的菌株對硒砂瓜幼苗的多種生長指標(biāo)均有促進作用。江美彥等（2022）研究發(fā)現(xiàn)分離得到的芽孢桿菌屬的菌株對白芷的生長具有較強的促進作用。本研究在兩組樣品的PICRUSt功能預(yù)測中，氨基酸代謝、碳水化合物代謝及輔助因子和維生素代謝這3種子功能代謝占比較大。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，游離的氨基酸可以通過調(diào)節(jié)滲透壓幫助植物抵御環(huán)境的脅迫（燕輝等，2012）。碳水化合物是植物生長的重要營養(yǎng)物質(zhì)，林夏珍等（2021）研究表明，非結(jié)構(gòu)性碳水化合物在一定程度上可以增加植物的抗逆性。維生素是普遍存在于植物中的重要營養(yǎng)素，安華明等（2004）研究發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)合成的維生素C在抗氧化和自由基清除、光合作用和光保護、細(xì)胞生長和分裂以及一些重要次生代謝物和乙烯的合成等方面具有非常重要的生理功能。由此推測，大別山五針?biāo)筛H土壤樣品與根部組織樣品中不同細(xì)菌組成不同功能的基因，從而影響到氨基酸、碳水化合物及輔助因子和維生素等方面的代謝，對促進大別山五針?biāo)傻纳L，提高其對環(huán)境的抵抗性等方面發(fā)揮了重要作用。

陳羽彤等（2024）研究顯示，土壤真菌群落的變化可以增加生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性，與宿主植物的生長發(fā)育密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，大別山五針?biāo)筛恐邪采鸂I養(yǎng)型、腐生營養(yǎng)型、病理營養(yǎng)型及多種交叉營養(yǎng)型等四大真菌類群，并且以共生營養(yǎng)型和腐生營養(yǎng)型為主要響應(yīng)功能群，這與馬源等（2024）的研究結(jié)果一致。一般來說，腐生營養(yǎng)型真菌大多歸屬為子囊菌門，在分解土壤有機質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)方面起重要的作用。菌根真菌是共生營養(yǎng)型的重要代表，其與植物存在共生關(guān)系，菌根真菌與寄主植物相互作用有助于植物吸收養(yǎng)分，菌根真菌也可以從寄主植物根中提取脂質(zhì)和碳水化合物。外生菌根真菌是森林生態(tài)系統(tǒng)中與樹木共生的重要成員，它與植物跨界共生具有復(fù)雜的分子互作過程（俞嘉瑞和袁海生，2023）。本研究中，大別山五針?biāo)筛績?nèi)生真菌中的外生菌根類群顯著高于土壤根際真菌類群，說明外生菌根在促進大別山五針?biāo)缮L發(fā)育方面起到十分重要的作用。有關(guān)外生菌根的生理活動對其宿主具體的影響機制有待后續(xù)進一步探索。另外，本研究仍有33.88%～68.31%的根部真菌功能未被鑒定，說明真菌群落功能的復(fù)雜性仍需深入研究。

本研究采用高通量測序分析了大別山五針?biāo)筛课⑸锏亩鄻有院腿郝浣Y(jié)構(gòu)，并預(yù)測了其功能。本研究結(jié)果顯示，根際土壤樣品微生物的多樣性和物種豐富度在細(xì)菌和真菌方面均高于根部組織樣品，并且兩組樣品在細(xì)菌和真菌方面的群落結(jié)構(gòu)組成差異較大。本研究功能注釋結(jié)果暗示，特定的細(xì)菌（不動桿菌屬和芽孢桿菌屬等）和真菌（外生菌根真菌等）可能在大別山五針?biāo)傻纳L與環(huán)境適應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。然而，本研究僅基于PICRUSt和FUNGuild對大別山五針?biāo)傻募?xì)菌和真菌功能進行了初步探索，各類群（尤其是關(guān)鍵類群）的確切功能尚不明晰，后續(xù)將利用宏基因組測序技術(shù)深入探索大別山五針?biāo)傻娜郝浣Y(jié)構(gòu)組成及其相關(guān)的功能注釋。此外，后續(xù)研究還將在本研究基礎(chǔ)上通過改良培養(yǎng)基類型、模擬大別山自然生態(tài)條件，盡可能富集到多樣的可培養(yǎng)微生物分離株，并從相關(guān)的菌種庫中分離篩選具有抗逆促生功效的有益菌株，為促進大別山五針?biāo)傻纳L發(fā)育提供參考依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 蔣巧媛 王登惠）