基于蛋白組學研究醋酸棉酚治療子宮肌瘤的作用機制

關(guān)鍵詞醋酸棉酚；子宮肌瘤；蛋白組學；生物信息學；作用機制

子宮肌瘤（uterinefibroid，UF）是女性子宮平滑肌形成的良性腫瘤，在育齡婦女中的發(fā)病率為20%～50%[1]，其致病因素復雜，受年齡、種族、激素、生活方式、家族史、遺傳因素等影響[2]。相比手術(shù)的有創(chuàng)性，藥物保守治療是大多數(shù)UF患者更傾向的治療方式，常用治療藥物包括激素和中藥，但是激素只能暫時緩解癥狀，一旦停藥，肌瘤可能會再次生長，且長期使用激素可能會引起一系列的副作用；中藥治療效果因人而異，且需要較長時間的治療才能看到明顯的效果[3]。因此，選擇安全有效的治療藥物對UF具有重要意義。

醋酸棉酚（gossypolaceticacid，GAA）是一種多元酚醛類化合物，也是復方醋酸棉酚片的主要藥效成分。相關(guān)研究顯示，復方醋酸棉酚片在治療UF、子宮內(nèi)膜異位癥等方面具有較好的效果[4―5]，但關(guān)于GAA在UF中的調(diào)控作用及機制尚不清楚。蛋白組學能夠從細胞水平對蛋白質(zhì)的組成進行分析，明確整個過程的變化規(guī)律及特征，可用于全面、定量描述蛋白質(zhì)的表達及其在疾病或藥物治療影響下的變化[6]。基于此，本研究通過體外細胞實驗，觀察GAA對人UF細胞SK-UT-1增殖的調(diào)控作用，然后結(jié)合四維數(shù)據(jù)非依賴型采集（4D-DIA）蛋白組學技術(shù)挖掘差異蛋白并進行驗證，以期為闡明GAA治療UF的作用機制提供參考。

1 主要材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有CKX53型倒置顯微鏡（日本Olympus公司），DYY-7C型電泳儀、DYCZ-24DN型垂直電泳槽、DYCZ-40型電轉(zhuǎn)儀（北京六一生物科技有限公司），ChemiDocTMXRS+型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），ViiA7型實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)儀（美國ABI公司），MultiskanFC型酶標儀、EASY-nLC1200型質(zhì)譜系統(tǒng)、OrbitrapExploris480型高效液相色譜儀（美國ThermoFisherScientific公司）。

1.2 主要藥品與試劑

CCK-8檢測試劑盒（貨號CK04）購自日本同仁化學研究所；GAA（純度≥98.0%，貨號A506218-0001）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；米非司酮（貨號HY-13683，純度99.83%）購自美國MCE公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號分別為P0013B、P0010）均購自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司；兔源N-myc下游調(diào)節(jié)基因1（N-mycdownstreamregulatedgene1，NDRG1）抗體、兔源表皮生長因子受體反饋抑制劑1（epidermalgrowthfactorreceptorfeedbackinhibitor1，ERRFI1）抗體、鼠源GAPDH抗體（貨號分別為26902-1-AP、11630-1-AP、60004-1-Ig）均購自美國Proteintech公司；兔源CXC趨化因子配體3（CXCchemokineligand3，CXCL3）抗體（貨號DF8554）購自美國Affinity公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G、山羊抗鼠免疫球蛋白G二抗（貨號分別為111-035-003、115-035-003）購自美國Jackson公司。

1.3 細胞

人UF細胞SK-UT-1（貨號CTCC-007-0320）購自浙江美森細胞科技有限公司；人子宮內(nèi)膜細胞EEC（貨號QS-H011）購自旗賽生物科技（武漢）有限公司。

2 方法

2.1 細胞增殖活性考察

取正常培養(yǎng)的SK-UT-1細胞，吸去原培養(yǎng)液，加入磷酸鹽緩沖液（PBS）洗后加入胰蛋白酶消化3min后終止消化，以1000r/min離心5min，細胞沉淀用培養(yǎng)基重懸；取20μL細胞懸液加入20μL臺盼藍進行計數(shù)，以8000個/孔進行鋪板（96孔板），細胞體積100μL；然后分為不同質(zhì)量濃度（5、10、20、40、80、160μmol/L，濃度根據(jù)文獻[7]設(shè)置）GAA組、對照組（含有細胞）和空白組（不含細胞），每組設(shè)置3個復孔，于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)24h。各孔加入10μLCCK8繼續(xù)培養(yǎng)3h，采用酶標儀測定各孔光密度（opticaldensity，OD）值，并計算細胞存活率，細胞存活率（%）＝（給藥組OD值－空白組OD值）/（對照組OD值－空白組OD值）×100%。

2.2 4D-DIA蛋白組學分析

“2.1”項下實驗結(jié)束后，向?qū)φ战M、GAA組（80μmol/L）中加入含1mmol/LRIPA裂解緩沖液，冰上孵育5min；超聲5min，以15000r/min離心10min，收集上清液，采用BCA法測定總蛋白濃度。取上述蛋白溶液，在37℃下用10mmol/L二硫蘇糖醇還原45min，用50mmol/L碘乙酰胺烷基化15min；加入4倍體積的預(yù)冷丙酮，在－20℃下沉淀2h，離心，在37℃下用胰蛋白酶消化過夜。終止消化后，將樣品在C18色譜柱上脫鹽，真空濃縮后，用0.1%甲酸溶解，待上機檢測。

采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法檢測。將上述待測樣品上樣到分析柱IonOpticksAustralia（25cm×75μm，1.6μm）中進行分離；流動相A相為0.1%甲酸溶液，B相為乙腈溶液（含0.1%甲酸），梯度洗脫（0～25min，2%B→22%B；25～30min，22%B→35%B；30～35min，35%B→80%B；35～40min，80%B）；柱溫為50℃，上樣量為200ng，流速為300nL/min。分離后的餾分真空離心濃縮后，采用質(zhì)譜儀進行分析，檢測方式為正離子模式，母離子掃描范圍為m/z100～1700，毛細管電壓為1500V，干燥氣體速度為3L/min，干燥溫度為180℃；利用ddaPASEF模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，然后采用DIA-NN（v1.8.1）搜庫軟件，以Library-free方法搜庫，預(yù)測譜圖庫，并利用該譜圖庫進行蛋白質(zhì)分析以及質(zhì)控評價（包括肽段長度分布、肽段數(shù)分布、肽段漏切位點數(shù)分布、主成分分析等，以保證結(jié)果符合要求）[6]，然后將相應(yīng)數(shù)據(jù)過濾后用于后續(xù)的生物信息學分析。

2.3 生物信息學分析

基于“2.2”項下結(jié)果，以差異倍數(shù)（foldchange，F(xiàn)C）≥1.5或FC≤0.6667，且P值≤0.05篩選差異蛋白，并繪制差異蛋白統(tǒng)計柱狀圖；然后將每個差異蛋白的FC以2為底數(shù)取對數(shù)，P值以10為底數(shù)取對數(shù)的絕對值，繪制火山圖[8]。另外，使用WoLFPSORT軟件對差異蛋白進行亞細胞定位，并繪制餅圖，然后對差異蛋白進行基因本體（geneontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）信號通路分析。

2.4 差異蛋白表達驗證實驗

為了進一步驗證GAA在分子層面對UF的調(diào)控作用，選取FC排前3名的差異蛋白進行驗證。將細胞分為正常組（用EEC細胞）、模型組（用SK-UT-1細胞）、陽性對照組（米非司酮，10μmol/L[9]，用SK-UT-1細胞）和GAA高、中、低濃度組（80、40、20μmol/L，濃度根據(jù)“2.1”項下結(jié)果設(shè)置，用SK-UT-1細胞），細胞密度為8000個/孔，每組設(shè)3個復孔。培養(yǎng)24h后，將細胞裂解、離心、定量后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，以5%TBST封閉液室溫封閉2h，加入NDRG1、ERRFI1、CXCL3、GAPDH蛋白一抗（稀釋度均為1∶1000）于4℃條件下孵育過夜；以TBST洗膜，加入相應(yīng)二抗（稀釋度均為1∶10000）室溫孵育2h；以TBST洗膜，經(jīng)顯色后，采用凝膠成像系統(tǒng)進行觀察，然后以ImageJ軟件進行分析，以GAPDH蛋白為內(nèi)參，計算各目的蛋白的表達水平。

2.5 統(tǒng)計學方法

利用SPSS25.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 GAA對SK-UT-1細胞增殖活性的影響

由圖1可知，與對照組比較，10～160μmol/LGAA組SK-UT-1細胞存活率均顯著降低（P＜0.05）；GAA濃度大于80μmol/L時，細胞存活率均小于50%。因此，后續(xù)研究選擇80、40、20μmol/L作為GAA的干預(yù)濃度。

3.2 4D-DIA蛋白組學分析和生物信息學分析結(jié)果

3.2.1 蛋白質(zhì)量評估結(jié)果

肽段長度（圖2A）結(jié)果顯示，大部分肽段有7～20個氨基酸，符合基于酶解和質(zhì)譜碎裂方式的一般規(guī)律，質(zhì)譜鑒定到的肽段長度也符合質(zhì)控要求。肽段數(shù)量分布和漏切位點數(shù)分布（圖2B、2C）結(jié)果顯示，肽段數(shù)量較多且漏切位點數(shù)為0的肽段占比較高（為72.99%），符合質(zhì)控要求（肽段數(shù)量越多，表示該蛋白越可信；肽段漏切位點數(shù)為0的肽段越多，表示酶切越徹底，鑒定結(jié)果越可信）。主成分分析（圖2D）結(jié)果顯示，各組樣本之間的蛋白差異明顯，組內(nèi)樣本之間相關(guān)性明顯，符合質(zhì)譜上機標準。

3.2.2 差異蛋白分析結(jié)果

由圖3A、3B可知，GAA組與對照組共獲取了921個差異蛋白，其中上調(diào)蛋白254個、下調(diào)蛋白667個。

3.2.3 差異蛋白的亞細胞定位結(jié)果

結(jié)果顯示，差異蛋白主要分布在線粒體、細胞核、細胞外基質(zhì)、細胞質(zhì)和細胞膜，具體見圖4。

3.2.4 差異蛋白的GO分析和KEGG信號通路分析結(jié)果

選取GO分析中P值排前50名的條目繪制富集條目柱形圖（見圖5A），由圖5A可知，生物過程主要集中在線粒體蛋白翻譯、RNA聚合酶Ⅱ?qū)D(zhuǎn)錄的調(diào)控、蛋白翻譯、凋亡、細胞粘連及分化；細胞組分主要集中在線粒體膜、基質(zhì)、染色質(zhì)、細胞膜；分子功能主要集中在核糖體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合等。選取排前50名的KEGG信號通路繪制富集條目柱形圖（見圖5B），由圖5B可知，信號通路主要為PI3K/AKT（phosphoinositide3-kinase/proteinkinaseB，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B）、MAPK（mitogen-activatedproteinkinase，促分裂原活化的蛋白質(zhì)激酶）、TNF（tumornecrosisfactor，腫瘤壞死因子）、NF-κB（nuclearfactorκB，NF-κB）、AMPK（AMPactivatedproteinkinase，AMP活化的蛋白質(zhì)激酶）、Ras信號通路，主要涉及細胞凋亡、衰老、運動等細胞過程。

3.3 GAA對差異蛋白表達的影響結(jié)果

選取FC排前3名的蛋白NDRG1、ERRFI1、CXCL3進行驗證。與正常組比較，模型組細胞中NDRG1、CXCL3蛋白表達水平均顯著升高，ERRFI1蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和GAA各濃度組細胞中NDRG1、CXCL3蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），ERRFI1蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）。與陽性對照組和GAA高濃度組比較，GAA中、低濃度組細胞中CXCL3蛋白表達水平均顯著升高，ERRFI1蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。與陽性對照組比較，GAA高、中、低濃度組細胞中NDRG1蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖6。

4 討論

GAA作為復方醋酸棉酚片的主要藥效成分，在臨床上對UF具有良好干預(yù)作用。本研究結(jié)果證實，GAA對人UF細胞SK-UT-1具有顯著的抑制作用；進一步基于蛋白組學進行差異蛋白、KEGG信號通路、GO分析，結(jié)果顯示，GAA組和對照組的差異蛋白較多，主要集中于細胞線粒體。線粒體是動物細胞除細胞核外唯一具有DNA的細胞器，線粒體功能異常是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的重要原因[10]。差異蛋白的GO分析結(jié)果顯示，細胞過程主要為凋亡和衰老。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡、衰老與線粒體功能障礙密切相關(guān)[11]。KEGG信號通路分析結(jié)果顯示，醋酸棉酚影響的信號通路主要有PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路、TNF信號通路、NF-κB信號通路、AMPK信號通路、Ras信號通路，這些信號通路也與線粒體之間存在密切關(guān)系，可能在UF的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，如阻斷Ras信號通路的激活，可抑制UF細胞的增殖和血管生成[12―15]。

進一步對GAA組與對照組的差異蛋白進行篩選，明確FC排前3名的蛋白為NDRG1、ERRFI1、CXCL3，這3個蛋白可能是GAA調(diào)控細胞增殖、凋亡的重要靶點。NDRG1是N-myc下游調(diào)節(jié)基因，在細胞核、細胞膜及線粒體中廣泛存在，可參與細胞增殖、凋亡、脂質(zhì)生物合成、應(yīng)激反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、DNA修復、線粒體分裂等細胞過程；在腫瘤領(lǐng)域，NDRG1存在明顯的組織特異性和功能多效性，在不同腫瘤中發(fā)揮促癌作用[16]。ERRFI1主要作用于表皮生長因子受體信號通路，其不僅可以直接與表皮生長因子受體結(jié)合，抑制表皮生長因子受體激酶活性，還可以抑制表皮生長因子受體信號通路下游的Ras/MAPK和PI3K/AKT信號通路的激活[17]。ERRFI1作為一種腫瘤抑制基因，其表達減少以及蛋白功能的喪失有助于癌癥的發(fā)展[18]。CXCL3是CXC趨化因子亞家族的成員之一，在炎癥反應(yīng)、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)方面具有重要作用[19]，其表達水平升高會促進腫瘤細胞增殖，抑制腫瘤細胞凋亡[20]。本研究結(jié)果顯示，相較于正常的子宮內(nèi)膜細胞，SK-UT-1細胞中NDRG1、CXCL3蛋白表達水平均升高，ERRFI1蛋白表達水平降低；而經(jīng)GAA干預(yù)后，上述蛋白表達水平均逆轉(zhuǎn)。這提示GAA可能通過下調(diào)NDRG1、CXCL3蛋白表達，上調(diào)ERRFI1蛋白表達，抑制UF細胞的增殖、存活和侵襲。

綜上所述，GAA對UF的改善作用可能涉及PI3K/AKT、MAPK、TNF等信號通路；其可通過下調(diào)NDRG1、CXCL3蛋白的表達，上調(diào)ERRFI1蛋白的表達，影響UF細胞的增殖和凋亡，從而改善UF的發(fā)生發(fā)展。本研究仍存在一些不足：蛋白組學雖然能夠提供大量關(guān)于蛋白表達變化的信息，但單純依賴蛋白組學可能無法全面揭示GAA治療UF的復雜機制。未來的研究需要綜合運用多種研究方法驗證結(jié)果，深入揭示GAA的治療機制，為UF的臨床治療提供更有效的方法。