丁酸梭菌培養(yǎng)基的優(yōu)化

摘 要：為了提高丁酸梭菌D-1在培養(yǎng)過(guò)程中的生物量水平，本試驗(yàn)以梭菌增殖培養(yǎng)基（RCM培養(yǎng)基）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)丁酸梭菌D-1的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄糖、大豆蛋白胨、L-半胱氨酸鹽酸鹽對(duì)丁酸梭菌D-1具有顯著的促生長(zhǎng)作用，丁酸梭菌D-1的最佳培養(yǎng)溫度為37 ℃；通過(guò)正交試驗(yàn)確定丁酸梭菌D-1的最佳培養(yǎng)基組方為葡萄糖7 g/L、大豆蛋白胨10 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.7 g/L，優(yōu)化后的丁酸梭菌菌液OD600nm值由1.845提高至3.341，比優(yōu)化前培養(yǎng)效果提高81.1%。

關(guān)鍵詞：丁酸梭菌; 培養(yǎng)基; 正交試驗(yàn)；優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S852.61 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1673-1085（2025）02-0005-08

丁酸梭菌（Clostridium butyricum），又稱酪酸梭菌或丁酸梭狀芽孢桿菌，隸屬于芽孢桿菌科（Bacillaceae）、梭菌屬（Clostridium），是一種革蘭氏陽(yáng)性的專性厭氧芽孢桿菌[1]，廣泛存在于動(dòng)物腸道、土壤、糞便和奶酪等厭氧發(fā)酵產(chǎn)物中[2]。丁酸梭菌能夠通過(guò)發(fā)酵生成多種動(dòng)物生長(zhǎng)所需的氨基酸、消化酶、短鏈脂肪酸及維生素等，這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能夠被動(dòng)物腸道直接吸收，促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)和機(jī)體健康[3]；其發(fā)酵產(chǎn)物中的丁酸能夠修復(fù)動(dòng)物腸道黏膜，維護(hù)腸道屏障功能，改善腸道上皮組織的健康狀況[4-5]；丁酸梭菌還能促進(jìn)動(dòng)物腸道內(nèi)有益菌的增殖，抑制有害菌的增殖，從而維持消化道微生態(tài)平衡[6-7]。隨著對(duì)丁酸梭菌生理功能的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)其作為新型綠色飼料添加劑應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖生產(chǎn)中，能夠提高動(dòng)物機(jī)體免疫力，改善生產(chǎn)性能，減少抗生素的使用劑量，減少藥物殘留，符合國(guó)家“限抗禁抗無(wú)抗”政策的要求，在促進(jìn)畜牧業(yè)健康發(fā)展、生態(tài)環(huán)境保護(hù)、推動(dòng)無(wú)抗養(yǎng)殖等方面具有重要意義[8-9]。

由于丁酸梭菌是一種嚴(yán)格厭氧的異養(yǎng)菌，在有氧環(huán)境中會(huì)休眠，只有當(dāng)環(huán)境處于厭氧或無(wú)氧狀態(tài)時(shí)，丁酸梭菌才能良好生長(zhǎng)，培養(yǎng)難度大[10-11]。因此，與其他厭氧菌一樣，制約丁酸梭菌微生態(tài)制劑大規(guī)模生產(chǎn)的主要原因是微生物發(fā)酵法存在成本高、副產(chǎn)物多、菌體生物量低的問(wèn)題，難以滿足工業(yè)化的需求[12-13]。因此，優(yōu)化丁酸梭菌的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，從而提高其培養(yǎng)過(guò)程中的生物量水平，實(shí)現(xiàn)丁酸梭菌規(guī)模化生產(chǎn)，具有良好的研究前景[14-15]。本試驗(yàn)對(duì)丁酸梭菌的培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化，提高其培養(yǎng)過(guò)程中的菌體生物量，獲得活菌數(shù)較高的菌液，縮短丁酸梭菌的生長(zhǎng)周期，為丁酸梭菌微生態(tài)制劑的規(guī)模化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種 丁酸梭菌D-1由本實(shí)驗(yàn)室前期篩選并保存[16]。該菌株在未優(yōu)化的RCM培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)2 d后，其OD600nm值為1.845。

1.1.2 試驗(yàn)培養(yǎng)基 梭菌增殖培養(yǎng)基（RCM培養(yǎng)基）：牛肉浸粉10.0 g、酵母粉3.0 g、可溶性淀粉

1.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化鈉5.0 g、葡萄糖

5.0 g、醋酸鈉3.0 g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g、

瓊脂20.0 g（制備固體培養(yǎng)基時(shí)添加），蒸餾水加至1 000 mL，pH調(diào)至6.8 ± 0.1，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.1.3 其他試驗(yàn)材料 各種糖類、玉米粉、豆粕為工業(yè)原料，由公司采購(gòu)部門從原料廠商購(gòu)買；蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨為生化試劑，購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司；抗壞血酸、亞硫酸鈉、硫代乙醇酸鈉為分析純，由公司采購(gòu)部門從原料廠商購(gòu)買。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單因素試驗(yàn) 1）碳源的選擇及其添加量的確定：以RCM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以蔗糖、麥芽糖、果糖、紅糖代替其中的碳源（葡萄糖），初始添加量設(shè)置為5.0 g/L。在厭氧操作臺(tái)內(nèi)，按照5%的接種量向各個(gè)培養(yǎng)基中接入丁酸梭菌D-1，將其移入?yún)捬醪僮髋_(tái)的恒溫箱中，37 ℃下厭氧培養(yǎng)2 d，每組設(shè)置3個(gè)平行。培養(yǎng)完畢后使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)菌液的OD600nm值，測(cè)定不同碳源對(duì)丁酸梭菌D-1生長(zhǎng)的影響。

以測(cè)定得到的最佳碳源為基礎(chǔ)，接種量和培養(yǎng)條件如上所述保持不變，繼續(xù)測(cè)定1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 g/L的碳源對(duì)丁酸梭菌D-1生長(zhǎng)的影響，檢測(cè)方法同樣如上所述。

2）氮源的選擇及其添加量的確定：根據(jù)上述營(yíng)養(yǎng)成分篩選試驗(yàn)得到的最佳結(jié)果，以調(diào)整相關(guān)營(yíng)養(yǎng)成分后的RCM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以大豆蛋白胨、酪蛋白胨、玉米粉、豆粕代替其中的氮源（蛋白胨），初始添加量設(shè)置為10.0 g/L。在厭氧操作臺(tái)內(nèi)，按照5%的接種量向各個(gè)培養(yǎng)基中接入丁酸梭菌D-1，將其移入?yún)捬醪僮髋_(tái)的恒溫箱中，37 ℃下厭氧培養(yǎng)2 d，每組設(shè)置3個(gè)平行。培養(yǎng)完畢后使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)菌液的OD600nm值，測(cè)定不同氮源對(duì)丁酸梭菌D-1生長(zhǎng)的影響。

以測(cè)定得到的最佳氮源為基礎(chǔ)，接種量和培養(yǎng)條件如上所述保持不變，繼續(xù)測(cè)定5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 g/L的氮源對(duì)丁酸梭菌D-1生長(zhǎng)的影響，檢測(cè)方法同樣如上所述。

3）除氧劑的選擇及其添加量的確定：根據(jù)上述營(yíng)養(yǎng)成分篩選試驗(yàn)得到的最佳結(jié)果，以調(diào)整相關(guān)營(yíng)養(yǎng)成分后的RCM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以抗壞血酸、亞硫酸鈉、巰基乙酸鈉代替其中的除氧劑（L-半胱氨酸鹽酸鹽），初始添加量設(shè)置為0.5 g/L。在厭氧操作臺(tái)內(nèi)，按照5%的接種量向各個(gè)培養(yǎng)基中接入丁酸梭菌D-1，將其移入?yún)捬醪僮髋_(tái)的恒溫箱中，37 ℃下厭氧培養(yǎng)2 d，每組設(shè)置3個(gè)平行。培養(yǎng)完畢后使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)菌液的OD600nm值，測(cè)定不同除氧劑對(duì)丁酸梭菌D-1生長(zhǎng)的影響。

以測(cè)定得到的最佳除氧劑為基礎(chǔ)，接種量和培養(yǎng)條件如上所述保持不變，繼續(xù)測(cè)定0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 g/L的除氧劑對(duì)丁酸梭菌D-1生長(zhǎng)的影響，檢測(cè)方法同樣如上所述。

4）培養(yǎng)溫度的確定：以上述營(yíng)養(yǎng)成分篩選試驗(yàn)得到的最佳結(jié)果為培養(yǎng)基配方，制備梭菌擴(kuò)增培養(yǎng)基。在厭氧操作臺(tái)內(nèi)，按照5%的接種量向梭菌擴(kuò)增培養(yǎng)基接入丁酸梭菌D-1，放到裝有厭氧產(chǎn)氣包和氧氣指示劑的厭氧培養(yǎng)袋中，再分別移入溫度設(shè)置為33、35、37、39、41 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)2 d，每組設(shè)置3個(gè)平行。培養(yǎng)完畢后使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)菌液的OD600nm值，測(cè)定丁酸梭菌D-1的最佳培養(yǎng)溫度。

1.2.2 正交試驗(yàn) 以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化梭菌擴(kuò)增培養(yǎng)基中碳源、氮源和除氧劑的添加量對(duì)丁酸梭菌OD600nm值的影響。

1.2.3 生長(zhǎng)效果驗(yàn)證 以正交試驗(yàn)得到的最佳組合為基礎(chǔ)，制備梭菌擴(kuò)增優(yōu)化培養(yǎng)基。然后按照5%的接種量在厭氧操作臺(tái)內(nèi)向梭菌擴(kuò)增優(yōu)化培養(yǎng)基接入丁酸梭菌D-1，將其移入?yún)捬醪僮髋_(tái)的恒溫箱中，按照最佳培養(yǎng)溫度培養(yǎng)2 d，每組設(shè)置3個(gè)平行。期間檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的丁酸梭菌OD600nm值，繪制丁酸梭菌的生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 碳源的選擇及其添加量的確定 不同碳源對(duì)丁酸梭菌D-1生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、紅糖都可以為丁酸梭菌D-1的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但是丁酸梭菌D-1在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)效果最好，表明葡萄糖相比其他碳源能夠更好地被丁酸梭菌D-1吸收利用。因此，本試驗(yàn)選擇葡萄糖作為丁酸梭菌D-1培養(yǎng)的最佳碳源。

收稿日期：2024-08-14

通信作者：翟凱旋（1996—），從事微生物研究工作，E-mail：619081460@qq.com

葡萄糖添加量對(duì)丁酸梭菌D-1生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖2。隨著葡萄糖添加量的增加，丁酸梭菌D-1的OD600nm值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，原因可能是葡萄糖濃度過(guò)低時(shí)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足，不利于丁酸梭菌D-1的生長(zhǎng)；葡萄糖濃度過(guò)高又可能導(dǎo)致培養(yǎng)基滲透壓增加，導(dǎo)致丁酸梭菌D-1細(xì)胞脫水，影響其正常的生理功能，反過(guò)來(lái)抑制其活性。因此，本試驗(yàn)選擇7 g/L的葡萄糖作為丁酸梭菌D-1培養(yǎng)的最佳碳源添加量。

2.1.2 氮源的選擇及其添加量的確定 不同氮源對(duì)丁酸梭菌D-1生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，丁酸梭菌D-1在以大豆蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，其OD600nm值明顯高于蛋白胨對(duì)照組；其他氮源在促進(jìn)丁酸梭菌D-1生長(zhǎng)方面的作用則不如對(duì)照組。原因可能是酪蛋白胨中缺乏胱氨酸、蛋氨酸等丁酸梭菌生長(zhǎng)所需的含硫氨基酸，而玉米粉和豆粕的營(yíng)養(yǎng)成分又比較單一，導(dǎo)致丁酸梭菌D-1在以上述營(yíng)養(yǎng)成分為氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)效果不好。因此，本試驗(yàn)選擇大豆蛋白胨作為丁酸梭菌D-1培養(yǎng)的最佳碳源。

大豆蛋白胨添加量對(duì)丁酸梭菌D-1生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，當(dāng)大豆蛋白胨添加量在5～10 g/L時(shí)，隨著大豆蛋白胨添加量的增加，丁酸梭菌D-1的OD600nm值呈上升趨勢(shì)，表明丁酸梭菌處于增殖狀態(tài)；但當(dāng)大豆蛋白胨添加量大于10 g/L時(shí)則呈下降的趨勢(shì)，表明此時(shí)已不是丁酸梭菌最佳增殖狀態(tài)。因此，本試驗(yàn)選擇10 g/L的大豆蛋白胨作為丁酸梭菌D-1培養(yǎng)的最佳氮源添加量。

2.1.3 除氧劑的選擇及其添加量的確定 不同除氧劑對(duì)丁酸梭菌D-1生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，丁酸梭菌D-1在以L-半胱氨酸鹽酸鹽、巰基乙酸鈉、抗壞血酸為除氧劑的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)效果最好，其菌液OD600nm值明顯高于以亞硫酸鈉為除氧劑的培養(yǎng)基。其中又以L-半胱氨酸鹽酸鹽的效果更好。原因可能是L-半胱氨酸鹽酸鹽和巰基乙酸鈉主要通過(guò)其巰基提供電子給自由基，從而與氧氣反應(yīng)，這個(gè)去氧過(guò)程比較穩(wěn)定；抗壞血酸主要通過(guò)釋放H原子而具有很強(qiáng)的還原性，易被空氣中的氧氧化，但是生成的去氫抗壞血酸不夠穩(wěn)定；而亞硫酸鈉主要通過(guò)硫原子失去電子成為硫離子，將氧氣還原，作用過(guò)程相對(duì)單一。因此，本試驗(yàn)選擇L-半胱氨酸鹽酸鹽作為丁酸梭菌D-1培養(yǎng)的最佳除氧劑。

L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量對(duì)丁酸梭菌D-1生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖6。由圖6可知，隨著L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量的增加，丁酸梭菌D-1的菌液OD600nm值呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)；當(dāng)L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量大于0.7 g/L時(shí)，菌液OD600nm值則保持相對(duì)穩(wěn)定。原因可能是除氧劑需要達(dá)到一定量時(shí)才能在培養(yǎng)基中形成無(wú)氧狀態(tài)。因此，本試驗(yàn)選擇0.7 g/L的L-半胱氨酸鹽酸鹽作為丁酸梭菌D-1培養(yǎng)的最佳除氧劑添加量。

2.1.4 培養(yǎng)溫度的確定 不同培養(yǎng)溫度對(duì)丁酸梭菌D-1生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖7。由圖7可知，在以最佳營(yíng)養(yǎng)條件培養(yǎng)丁酸梭菌D-1的過(guò)程中，隨著培養(yǎng)溫度升高，丁酸梭菌D-1的菌液OD600nm值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在37 ℃時(shí)達(dá)到最高。此后盡管培養(yǎng)溫度增加，但其菌液濃度并沒(méi)有明顯增加。因此，本試驗(yàn)選擇37 ℃作為丁酸梭菌D-1培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)溫度。

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化丁酸梭菌D-1培養(yǎng)基中碳源、氮源、除氧劑的用量，培養(yǎng)溫度控制在37 ℃。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。其中，A因素為葡萄糖添加量（g/L），B因素為蛋白胨添加量（g/L），C因素為L(zhǎng)-半胱氨酸鹽酸鹽（g/L）。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，各因素對(duì)丁酸梭菌D-1菌液OD600nm值影響由大到小為：葡萄糖gt;大豆蛋白胨gt;L-半胱氨酸鹽酸鹽，表明葡萄糖的添加量是影響丁酸梭菌D-1生長(zhǎng)的最主要因素，L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加量對(duì)其生長(zhǎng)的影響最小，而且三種營(yíng)養(yǎng)因素添加量過(guò)多或過(guò)少均不利于丁酸梭菌D-1的生長(zhǎng)。因此，綜合各項(xiàng)指標(biāo)，本試驗(yàn)選擇葡萄糖7 g/L、大豆蛋白胨10 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.7 g/L（即A2B2C2組合）作為丁酸梭菌D-1的最佳培養(yǎng)基配方，制備梭菌擴(kuò)增優(yōu)化培養(yǎng)基。

2.3 生長(zhǎng)效果驗(yàn)證試驗(yàn)

丁酸梭菌D-1在梭菌擴(kuò)增優(yōu)化培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)效果見(jiàn)圖8。由圖8可知，丁酸梭菌D-1在梭菌擴(kuò)增優(yōu)化培養(yǎng)基和最佳培養(yǎng)溫度的條件下，其菌液OD600nm值隨培養(yǎng)時(shí)間的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在0.5 d時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，1 d時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，達(dá)到最大菌液OD600nm值為3.341。此后盡管培養(yǎng)時(shí)間增加，但其菌液OD600nm值并沒(méi)有明顯增加，最終穩(wěn)定在3.29左右。結(jié)果表明，丁酸梭菌D-1在梭菌擴(kuò)增優(yōu)化培養(yǎng)基上比在未優(yōu)化營(yíng)養(yǎng)成分的原RCM培養(yǎng)基上菌液OD600nm值提高約81.1%。

3 結(jié)論

在本研究中，單因素試驗(yàn)表明，適合丁酸梭菌D-1生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基成分為葡萄糖、大豆蛋白胨、L-半胱氨酸鹽酸鹽，最佳培養(yǎng)溫度為37 ℃。正交試驗(yàn)優(yōu)化后確定的培養(yǎng)基配方為葡萄糖7 g/L、大豆蛋白胨10 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.7 g/L。在此條件下，丁酸梭菌D-1的菌液OD600nm值比普通RCM培養(yǎng)基提高約81.1%。

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Culture Medium Optimization of Clostridium butyricum

ZHAI Kaixuan1 ， ZANG Xueyun1， LI Jinxiang1， LENG Dunpeng1， CHEN Ling2，

YIN Lingling2

（1.Qingdao Zhong ren Animal Pharmaceutical ， Co.， Ltd.， Qingdao 266300， China;

2. Shandong Provincial Feed and Veterinary Drug Quality Inspection Center， Jinan 250000， China）

Abstract： To enhance the biomass level of Clostridium butyricum D-1 during culture， this study optimized the culture medium for C. butyricum D-1 using the Clostridium proliferation medium （RCM medium） as the base medium. The optimization was carried out through single-factor experiments and orthogonal experiments. The results of the single-factor experiments showed that glucose， soybean peptone， and L-cysteine hydrochloride significantly promoted the growth of C. butyricum D-1， with the optimal culture temperature being 37 ℃. The orthogonal experiments determined the optimal medium composition for C. butyricum D-1 to be glucose at 7 g/L， soybean peptone at 10 g/L， and L-cysteine hydrochloride at 0.7 g/L. The optimized C. butyricum D-1 broth's OD value increased from 1.845 to 3.341， an improvement of 81.1% in culture efficacy compared to the previous optimization.

Keywords： Clostridium butyricum; Culture medium; Orthogonal experiment; Optimization