蝦廢料酶解工藝優(yōu)化及不同單糖與美拉德反應(yīng)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)系

摘要：采用雙酶（胰蛋白酶和木瓜蛋白酶）法水解蝦廢料，以多肽含量為指標(biāo)，采用單因素試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化酶解條件；再以大豆蛋白水解物（SPH）為原料與還原糖（葡萄糖、木糖、核糖）進(jìn)行美拉德反應(yīng)；探究美拉德反應(yīng)的褐變程度、中間產(chǎn)物和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（MRPs）的抗氧化能力；并采用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（SPME-GC-MS）探究反應(yīng)前后的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成和滋味。結(jié)果表明，蝦廢料蛋白雙酶水解的最佳條件為酶比2∶1、液料比40∶1、加酶量5 000 U/g，在此條件下，多肽含量可達(dá)（52±0.75）%。3種MRPs都出現(xiàn)褐變程度上升和自由基清除能力增強(qiáng)的現(xiàn)象。SPH經(jīng)美拉德反應(yīng)后醛類、酚類、呋喃類、吡嗪類、醚類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量不同程度地增加，3種MRPs中醛類含量占比均超過50%；3種單糖都可使SPH的風(fēng)味和感官得到明顯改善。SPH+單糖經(jīng)過美拉德反應(yīng)后可以明顯改良SPH在氣味、滋味上的劣勢。

關(guān)鍵詞：蝦廢料；酶解；美拉德；抗氧化能力；揮發(fā)性風(fēng)味

中圖分類號：TS201.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1000-9973（2025）01-0051-10

Optimization of Enzymatic Hydrolysis Process of Shrimp Waste and Relationship Between Different Monosaccharides and Volatile

Flavor Substances by Maillard Reaction

LIU Zhi-sheng， LI Xin-yang， LU Jue， HU Yan-bing， BAO Shi-di， LI Zhi-hang， WANG Tian-xin^*

（College of Food Science and Engineering， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China）

Abstract： Shrimp waste is hydrolyzed by double enzymes （trypsin and papain） method.With polypeptide content as the index， single factor test and response surface method are used to optimize the hydrolysis conditions， and then soybean protein hydrolysate （SPH） is used as the raw material for the Maillard reaction with reducing sugars （glucose， xylose， ribose）.The browning degree of Maillard reaction， the antioxidant capacity of intermediate products and Maillard reaction products （MRPs） are investigated. Solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry （SPME-GC-MS） is used to investigate the composition and flavor of volatile flavor substances before and after the reaction. The results show that the optimal conditions for double enzymes hydrolysis of shrimp waste protein are enzyme ratio of 2∶1， liquid-solid ratio of 40∶1 and enzyme addition amount of 5 000 U/g. Under these conditions， the polypeptide content could reach （52±0.75）%. The browning degree of the three MRPs and the scavenging capacity on free radicals all increase. The content of volatile flavor substances such as aldehydes， phenols， furans， pyrazines and ethers in SPH increases to different degrees after Maillard reaction， and the content of aldehydes in three MRPs accounts for more than 50%.All the three monosaccharides can significantly improve the flavor and sense of SPH. SPH+monosaccharides can significantly improve the odor and taste disadvantages of SPH after Maillard reaction.

Key words： shrimp waste; enzymatic hydrolysis; Maillard; antioxidant capacity; volatile flavor

收稿日期：2024-06-27

作者簡介：劉志勝（1998—），男，碩士，研究方向：食品添加劑與功能配料。

*通信作者：王田心（1985—），男，講師，博士，研究方向：食品添加劑與功能配料。

隨著消費(fèi)者對海產(chǎn)品需求的不斷擴(kuò)大，全球蝦產(chǎn)量迅速增加，其中南美白對蝦全球年產(chǎn)量超過310萬噸^[1]。南美白對蝦是當(dāng)今世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大蝦種之一^[2]。同時蝦廢料產(chǎn)量大、利用率低，是一種低價值但高蛋白的產(chǎn)品，具有較低的可食用性，且在加工過程中通常作為工業(yè)廢物被丟棄^[3]。

為提高蝦廢料蛋白的綜合利用及其生物制品的附加值，目前最流行的技術(shù)包括發(fā)酵^[4]、酶水解、干燥機(jī)械化學(xué)法^[5]。酶水解在上述方法中比較具有優(yōu)勢，因為該過程非常高效，可以很容易地調(diào)節(jié)從而控制蛋白質(zhì)的水解程度^[6]。蛋白水解酶催化蛋白質(zhì)的水解，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分解，從而能夠修改或改善其功能、生物學(xué)和營養(yǎng)特性。目前很多研究都關(guān)注于使用單一蛋白酶對蝦廢料的利用^[7]。

美拉德反應(yīng)（MR），也稱為非酶褐變反應(yīng)，由法國化學(xué)家于1912年發(fā)現(xiàn)。MR是蛋白質(zhì)和多糖之間的反應(yīng)，已被廣泛研究。MR可以減少不良風(fēng)味^[8]，同時提升酶解液的呈味和風(fēng)味特性^[9-10]，目前已經(jīng)開發(fā)了多種方法和技術(shù)，試圖通過MR來提高產(chǎn)品的風(fēng)味。MR化學(xué)反應(yīng)涉及還原糖上的羰基與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸上的反應(yīng)性氨基之間形成的共軛物。有大量潛在的MR產(chǎn)品，一些MRPs會使食物顏色或風(fēng)味發(fā)生改變，或增強(qiáng)特定的生物活性^[11-12]。

本研究以南美白對蝦廢料為原料，采用雙酶酶解法獲得的胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解蝦廢料得到最佳的酶解效果，并比較3種單糖的MRPs與未處理的SPH的氣味和滋味。此外，本研究證實(shí)了不同單糖MRPs的抗氧化活性、中間產(chǎn)物和褐變程度的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

蝦廢料：天津市濱海新區(qū)金元寶濱海農(nóng)產(chǎn)品交易市場；牛血清白蛋白、1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）：上海佰利萊生物科技有限公司；D（+）-木糖、D（－）-核糖、福林酚試劑：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；木瓜蛋白酶（10萬 U/g）、胰蛋白酶（10萬 U/g）：南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器

3K15型通用臺式冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；RCD-1A型均質(zhì)機(jī) 金壇區(qū)西城新瑞儀器廠；UV-6000型紫外可見分光光度計 美國賽默飛世爾科技公司；Synergy HTX型酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；BSM-120.4型電子天平 上海卓精電子科技有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州越新儀器制造有限公司；101-2A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 浙江力辰儀器科技有限公司；SG2型便攜式酸度計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Scientz-10N/C型普通多歧管型冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；GCMS-QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 蝦廢料蛋白制備

將蝦廢料沸水浴蒸煮10 min，挑選出蝦廢料中的蝦肉并加入適量去離子水經(jīng)均質(zhì)機(jī)均質(zhì)后進(jìn)行凍干，放入-20℃冰箱中備用。

1.2.2 計算機(jī)雙酶酶解效果預(yù)測

從UniProt（https：//www.uniprot.org/）服務(wù)器找到28條南美白對蝦的蛋白序列，利用BIOPEP-UWM（https：//biochemia.uwm.edu.pl/）服務(wù)器進(jìn)行雙酶酶解^[13-14]，見圖1。選擇胰蛋白酶（EC3.4.21.4）、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶（EC3.4.22.2）、無花果蛋白酶、鳳梨蛋白酶、堿性蛋白酶；兩兩組合酶解28條肽鏈，選出每條肽鏈3～6肽前三名出現(xiàn)的組合酶，確定胰蛋白酶和木瓜蛋白酶為最佳組合。

1.2.3 牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱取25 mg BSA，加水溶解后，配制成100 mL的溶液，得到濃度為250μg/mL的BSA溶液。移取牛血清白蛋白溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL置于試管中。加蒸餾水補(bǔ)足到1 mL，向各試管中加入5 mL堿性銅溶液，迅速混勻，在室溫下靜置10 min，再向各試管中加入0.5 mL福林酚試劑，迅速混勻，靜置30 min，以蒸餾水代替對照組母液作為空白對照，于640 nm處測定吸光度，以牛血清白蛋白濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。

1.2.4 多肽含量的測定

采用福林酚試劑法^[15]測定多肽含量；取少量樣品溶液，稀釋一定的倍數(shù)，吸取1 mL按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟操作，于660 nm處測定吸光度，見公式（1）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得相當(dāng)于牛血清白蛋白的濃度，即得蝦酶解液中多肽的含量：

多肽含量（%）=b×d×V₁/m×V₂×100%。（1）

式中：V₁為樣品溶液的總體積（mL）；V₂為測定溶液的體積（mL）；d為稀釋倍數(shù)；m為樣品溶液的質(zhì)量（mg）；b為測定溶液的濃度（mg/mL）。

1.2.5 單因素試驗設(shè)計

從1.2.2步驟中篩選出胰蛋白酶和木瓜蛋白酶作為混合酶；取1.2.1步驟中的樣品（凍干后的蝦廢料蛋白）0.5 g于100 mL小燒杯中，置于磁力攪拌水浴鍋中，固定液料比為40∶1，加酶量為4 000 U/g，胰蛋白酶∶木瓜蛋白酶為1∶1，酶解溫度分別為30，35，40，45，50℃，酶解液經(jīng)過離心（8 000 r/min，10 min），過0.22μm水膜；探究不同酶解溫度對多肽含量的影響。

加酶量：根據(jù)上述內(nèi)容確定最佳酶解溫度為45℃，酶比為1∶1和液料比為40∶1，加酶量分別為0，2 000，3 000，4 000，5 000，6 000 U/g，酶解液經(jīng)過離心（8 000 r/min，10 min），過0.22μm水膜；探究不同加酶量對多肽含量的影響。

酶比（蛋白酶胰∶木瓜蛋白酶）：根據(jù)上述內(nèi)容確定最佳酶解溫度為45℃，加酶量為4 000 U/g和液料比為40∶1，酶比分別為1∶2、1∶3、1∶1、2∶1、3∶1，酶解液經(jīng)過離心（8 000 r/min，10 min），過0.22μm水膜；探究不同酶比對多肽含量的影響。

液料比：根據(jù)上述內(nèi)容確定最佳酶解溫度為45℃，加酶量為4 000 U/g，酶比為2∶1，液料比分別為50∶1、40∶1、30∶1、20∶1，酶解液經(jīng)過離心（8 000 r/min，10 min），過0.22μm水膜；探究不同液料比對多肽含量的影響。

1.2.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)上述單因素試驗結(jié)果，確定了加酶量、液料比、酶比是影響雙酶酶解的主要因素，故設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗，以多肽含量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，確定雙酶酶解蝦廢料的最適工藝條件，見表1。

1.2.7 不同種類還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備

將酶解后的水解液再次凍干，將獲得的凍干粉配制成質(zhì)量濃度為30 mg/mL的溶液。將3種還原糖分別稱取一定質(zhì)量后按不同比例添加到凍干粉溶液中，使每個體系中肽∶糖為1∶0.25、1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2。取10 mL加入帶塞玻璃管中，塞緊后放入烘箱中100℃、4 h，反應(yīng)結(jié)束后立即降至室溫，即得到MRPs，將其儲存于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 褐變程度及中間產(chǎn)物的測定

選取3種肽∶糖為1∶2條件下的MRPs，稱取適量溶于去離子水中，分別稀釋相應(yīng)的倍數(shù)，褐變強(qiáng)度以420 nm處的吸光度表示，中間產(chǎn)物以294 nm處的吸光度表示。

1.2.9 抗氧化能力的測定

參考雷雨婷等^[16]的方法并稍作修改，選取3種肽∶糖為1∶2條件下的MRPs溶液稀釋一定的倍數(shù)，各取樣品溶液1.0 mL，溶液與0.1 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液1.0 mL避光反應(yīng)0.5 h后，用0.22μm水膜過濾，取0.2 mL于517 nm處測得的吸光度記作A₀，以無水乙醇溶液代替DPPH無水乙醇溶液測得的吸光度記作A₁，以水代替樣品溶液測得的吸光度記作A。利用公式（2）計算樣品DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率（%）=（1-A₀－A₁/A）×100%。 （2）

參考何宛詩等^[17]的方法并稍作修改，選取3種肽∶糖為1∶2條件下的MRPs溶液稀釋一定的倍數(shù)，配制2.6 mmol/L K₂S₂O₈溶液，與7.4 mmol/L ABTS溶液等體積混合并避光反應(yīng)14 h后，用無水乙醇對其進(jìn)行稀釋，得到ABTS工作液。取各濃度樣品溶液1.0 mL，與4.0 mL ABTS工作液混合并避光反應(yīng)10 min，用0.22μm水膜過濾，取0.2 mL置于96孔板中，在734 nm處測得的吸光度記作A₀，以水代替樣品溶液測得的吸光度記作A。利用公式（3）計算樣品ABTS自由基清除率：

ABTS自由基清除率（%）=A－A₀/A×100%。（3）

1.2.10 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

參考程華峰等^[18]的方法，選取3種MRP肽∶糖為1∶2條件下的MRPs溶液，量取10.0 mL MRPs置于頂空瓶內(nèi)，通過頂空固相微萃取技術(shù)對樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行吸附收集，通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對其進(jìn)行鑒定和分析。色譜條件：Rtx-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；柱流量1.0 mL/min。柱溫箱起始溫度為40℃，保持3 min后，以4℃/min升溫到150℃保持1 min，再以8℃/min升溫到250℃保持6 min。質(zhì)譜條件：EI離子源（溫度200℃）；質(zhì)量掃描范圍（m/z）：35～50 u；采用面積歸一化法計算相對含量。

1.2.11 感官評價

參考Li等^[19]的方法并稍作修改，選取5女5男共計10名天津科技大學(xué)食品學(xué)院學(xué)生對SPH及3種肽∶糖為1∶2條件下的MRPs進(jìn)行滋味感官評價，選擇0.35% NaCl溶液作為標(biāo)準(zhǔn)咸味劑，0.35%谷氨酸鈉溶液作為標(biāo)準(zhǔn)鮮味劑，0.08%檸檬酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)酸味劑，1.00%蔗糖溶液作為標(biāo)準(zhǔn)甜味劑和0.08%咖啡因溶液作為標(biāo)準(zhǔn)苦味劑。樣品的感官評分范圍為0～10分，其中0分表示沒有味道，10分表示味道濃烈。參考標(biāo)準(zhǔn)溶液獲得5分，品嘗每個樣品并計算最終平均值作為感官評價結(jié)果。品嘗每個樣品后用蒸餾水漱口，并給予2 min的休息時間，以消除任何潛在的殘留影響。

1.2.12 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復(fù)3次。所有數(shù)據(jù)采用SPSS、Origin 2018和Design-Expert 13進(jìn)行處理。當(dāng)Plt;0.05時，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同溫度對蝦廢料蛋白多肽含量的影響

以多肽含量為指標(biāo)，考察了不同溫度對酶解效果的影響，見圖3。其他酶解條件：液料比為40∶1，加酶量為4 000 U/g，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶比為1∶1。

由圖3可知，隨著酶解溫度的升高，多肽含量快速升高，達(dá)到峰值后又快速下降；酶解溫度的升高能加快酶解效果，但超過一定溫度后多肽含量急劇下降，這是因為高溫易導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)和特性的改變，從而影響其活性，這與孫志強(qiáng)等^[20]報道的結(jié)果一致。因此，酶解溫度為45℃時在本試驗中最合適。

2.1.2 不同加酶量對蝦廢料蛋白多肽含量的影響

以多肽含量為指標(biāo)，考察了不同加酶量對酶解效果的影響，見圖4。其他酶解條件：液料比為40∶1，酶解溫度為45℃，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶比為1∶1。

由圖4可知，加酶量為0 U/g時多肽含量為（17±0.36）%，這可能是因為凍干后的多肽易溶于水。隨著酶添加量的增加，多肽含量先逐漸增加后趨于穩(wěn)定，這是因為酶與底物的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和后，繼續(xù)增加酶的用量對水解效果作用不大?？紤]到經(jīng)濟(jì)效益，加酶量為4 000 U/g時在本試驗中最合適。

2.1.3 不同酶比對蝦廢料蛋白多肽含量的影響

以多肽含量為指標(biāo)，考察了不同酶比對多肽含量的影響，見圖5。其他酶解條件：液料比為40∶1，酶解溫度為45℃，加酶量為4 000 U/g。

由圖5可知，每種酶都有其特異性，并產(chǎn)生不同品質(zhì)、不同物理化學(xué)性質(zhì)和生物活性。隨著酶比的增加，多肽含量差異明顯，先快速上升后快速下降；在酶比為2∶1時多肽含量最高，在酶比為1∶3時木瓜蛋白酶占了很大比例，由于45℃溫度低，可能抑制了木瓜蛋白酶的生物活性，進(jìn)而導(dǎo)致多肽含量下降。因此，加酶比為2∶1時在本試驗中最合適。

2.1.4 不同液料比對蝦廢料蛋白多肽含量的影響

以多肽含量為指標(biāo)，考察了不同液料比對酶解效果的影響，見圖6。其他酶解條件：酶解溫度為45℃，加酶量為4 000 U/g，酶比為2∶1。

由圖6可知，不同液料比之間的多肽含量差異明顯；多肽含量隨著液料比的增大先升高后逐漸降低；隨著液料比的增大，相當(dāng)于增加了蛋白溶于水中的量，同時也易于酶充分與蛋白接觸，有利于蛋白的酶解，這與閆蓉蓉等^[21]的研究結(jié)果一致，而在液料比為50∶1時多肽含量降低，相當(dāng)于降低了反應(yīng)體系中的酶濃度和底物濃度，從而使得酶促反應(yīng)速度降低，多肽含量下降。多肽含量在液料比為40∶1時最高；在液料比為10∶1時最低，可能是由于含水量過少，體系過于黏稠，酶不能充分溶于水中。因此，液料比為40∶1時在本試驗中最合適。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗及結(jié)果分析

2.2.1 雙酶酶解回歸模型方差分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定雙酶酶解工藝參數(shù)，試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到多肽含量（Y）與加酶量（A）、液料比（B）、酶比（C）的二次多項回歸方程：

Y=52.16+2.64A+1.49B－0.861 2C+1.46AB+0.272 5AC+0.29BC－4.59A²－4.21B²－2.34C²。

對回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

模型的Plt;0.01，表明該模型極顯著，且失擬項的P=0.086 8gt;0.05，失擬項不顯著，說明擬合度好，此模型可用。該回歸模型的R²=0.991 0，R_Adj²=0.979 5，說明該回歸模型可以充分解釋該工藝，此模型可用于分析酶解蝦廢料的工藝優(yōu)化。根據(jù)各因素的顯著水平，結(jié)合F值大小可以判斷對水解度的影響順序為加酶量gt;液料比gt;酶比。通過模型得到的最優(yōu)結(jié)果為加酶量4 947.7 U/g、液料比43.3∶1、酶比1.89∶1，此時多肽含量為51.08%。根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整為加酶量5 000 U/g、液料比40∶1、酶比2∶1，在此工藝條件下進(jìn)行3組重復(fù)試驗，計算其多肽含量的平均值為（52±0.75）%，試驗結(jié)果與理論值相比誤差小，說明該優(yōu)化結(jié)果具有可行性。

2.2.2 響應(yīng)面和等高線分析

由圖7可知，隨著加酶量、液料比和酶比的增大，多肽含量先增大后減小，這與單因素試驗結(jié)果一致，交互作用的顯著性與表2中的結(jié)果一致。

2.3 還原糖的種類對MRPs褐變程度的影響

本次試驗測量了294 nm處的吸光度，以確定美拉德反應(yīng)過程中中間產(chǎn)物的生成；測量了420 nm處的吸光度，以確定美拉德反應(yīng)過程中的褐變程度，見圖8。

由圖8可知，在SPH+葡萄糖反應(yīng)體系中，其在294 nm和420 nm處的吸光度變化相較于其他兩種單糖明顯降低，表明葡萄糖對美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物和褐變程度的影響不大。核糖與木糖是一種五碳糖，葡萄糖是一種六碳糖，碳鏈越短其碳架空間位阻越小，活性越高，因而在相同的反應(yīng)條件下核糖與木糖比葡萄糖更易發(fā)生美拉德反應(yīng)，相關(guān)結(jié)果與劉翔^[22]的研究結(jié)果一致。

然而，SPH+核糖體系隨著肽糖比的增加，其中間產(chǎn)物和褐變程度前期增加迅速后期增加緩慢，可能是由于在高肽糖比條件下的高反應(yīng)速率。SPH+木糖體系介于兩者中間，3種反應(yīng)在后期褐變程度與中間產(chǎn)物均趨向穩(wěn)定，可能是高濃度糖已經(jīng)將肽消耗完畢。綜上，證實(shí)了不同的單糖是美拉德反應(yīng)的重要因素。

2.4 抗氧化能力

2.4.1 DPPH自由基清除率的變化

由圖9可知，所有樣品的DPPH自由基清除率均隨著肽糖比的增加而顯著增加，在肽∶糖為1∶2時3種單糖對DPPH自由基的清除率分別達(dá)到（89±0.77）%、（53±0.36）%、（41±1.03）%，不同單糖的MRPs DPPH自由基的清除率之間差異顯著（0.01lt;Plt;0.05）。SPH+核糖在肽糖比為1∶1.5內(nèi)DPPH自由基清除率顯著增加（Plt;0.05），并在肽糖比為1∶2時趨于穩(wěn)定。其他兩種單糖的MRPs隨著肽糖比的增加DPPH自由基清除能力也隨之增強(qiáng)。DPPH自由基清除能力為SPH+核糖gt;SPH+木糖gt;SPH+葡萄糖，且核糖的清除能力顯著高于其他兩種單糖，可能與不同單糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后產(chǎn)生的中間產(chǎn)物有關(guān)，也可能與自由基反應(yīng)將其轉(zhuǎn)化成更穩(wěn)定的產(chǎn)物有關(guān)^[23]。因此，可以得出不同單糖的MRPs對DPPH自由基的清除率不同。

2.4.2 ABTS自由基清除率的變化ABTS自由基常用于測量MRPs的抗氧化能力，因為它們是親水性自由基，可以與MRPs有效相互作用。

由圖10可知，SPH+葡萄糖ABTS自由基清除率的變化相較于其他兩種單糖最低，可能是因為核糖和木糖的增強(qiáng)與能夠提供的氫的中間體和褐變產(chǎn)物有關(guān)^[24]。

三者的MRPs的ABTS自由基清除率都隨著肽糖比的增加而逐漸增加。SPH+木糖和SPH+核糖在肽糖比較低時的ABTS自由基清除率差異較大，在肽糖比較高時其ABTS自由基清除率趨于一致，可能是單糖富余，將肽全部消耗掉，中間產(chǎn)物的增加不明顯導(dǎo)致；如2.3所述，核糖的MRPs中表現(xiàn)出最高的中間產(chǎn)物和褐變程度，因此經(jīng)美拉德反應(yīng)后中間產(chǎn)物和褐變產(chǎn)物的含量最高。因此可以得出結(jié)論，隨著肽糖比的增加，可以加速中間產(chǎn)物和褐變產(chǎn)物的形成，有利于ABTS自由基清除活性。

2.5 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析見表4。

由表4可知，SPH、SPH+葡萄糖、SPH+木糖、SPH+核糖分別檢測出51，62，58，62種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，表明美拉德反應(yīng)對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成具有復(fù)雜的影響。且產(chǎn)生的醛類、呋喃類等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量明顯增加（P＜0.05），醛類含量分別達(dá)到22.42%、51.66%、58.23%、74.8%，呋喃類含量分別達(dá)到0.4%、10.27%、21.76%、3.95%；醇類、酯類等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量呈現(xiàn)下降趨勢（P＜0.05），醇類含量分別達(dá)到10.31%、3.66%、2.59%、2.56%，酯類含量分別達(dá)到9%、7.53%、0.62%、1.37%；其他揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量變化不大。

醛類物質(zhì)是MRPs中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的重要組成部分，醛類物質(zhì)具有較低的嗅覺閾值，通過對比可以發(fā)現(xiàn)，SPH經(jīng)過美拉德反應(yīng)后，醛類化合物的種類和含量均有很大程度的增加，種類分別達(dá)到15，19，19，23種；含量分別上升到22.42%、51.66%、58.23%、74.8%。從相對含量來看，醛類占比較高^[25]，其中異戊醛占比最大，分別達(dá)到4.54%、35.82%、42.28%、44.9%，這種變化趨勢與還原糖的種類對MRPs的影響及抗氧化能力一致；異戊醛在低濃度時主要呈現(xiàn)出水果香味、巧克力味，可以改善口感，提升愉悅感；但是在高濃度時會產(chǎn)生令人不愉快的氣味。同時乙醛、壬醛和苯甲醛分別呈現(xiàn)清香味、柑橘香和苦杏仁味，說明MR改善了SPH的風(fēng)味，這3種醛類在SPH和3種MRPs中含量變化不大。而呈現(xiàn)出焦糖味和玫瑰香味的糠醛和苯甲醛在SPH中未檢測出，從而使得SPH經(jīng)過美拉德反應(yīng)后產(chǎn)生一種令人愉悅的鮮蝦味和焦糖味，而在3種MRPs中占有較大比例的分別為糠醛：0.55%、3.44%、8.47%，苯甲醛：2.63%、1.61%、5.29%。

SPH經(jīng)過美拉德反應(yīng)后醇類含量呈現(xiàn)下降趨勢，且醇類物質(zhì)相較于未經(jīng)過美拉德反應(yīng)的酶解液種類變化不大，但都產(chǎn)生新的醇類物質(zhì)。其中3種MRPs的物質(zhì)種類分別達(dá)到12，12，13種，SPH有10種。SPH中乙醇和順-2-甲基環(huán)己醇的含量分別達(dá)到3.66%和3.98%，而3種MRPs中未檢測到這兩種物質(zhì)，說明美拉德反應(yīng)將這兩種物質(zhì)作為反應(yīng)底物消耗掉，生成了較多的醛類，如糠醛、異戊醛、苯甲醛、苯乙醛等風(fēng)味物質(zhì)。SPH和3種MRPs中均含有庚醇、異辛醇，分別呈現(xiàn)堅果味和水果清香味，庚醇和異辛醇含量分別達(dá)到0.03%、0.11%、0.08%、0.15%和1.37%、1.09%、0.37%、1.02%，表明經(jīng)過MR后異辛醇含量有所上升，對整體氣味有提升作用。

大多數(shù)酮類物質(zhì)的閾值相對較低，既可以產(chǎn)生良好的風(fēng)味，也可以產(chǎn)生令人不愉快的氣味；SPH中異亞丙基丙酮含量達(dá)到6.62%，呈現(xiàn)蜂蜜味；SPH和3種MRPs的酮類含量分別達(dá)到8.37%、8.72%、4.5%、8.42%；SPH+木糖體系含量最少。SPH和3種MRPs都含有2，3-辛二酮、甲基庚烯酮，呈現(xiàn)出甜的奶油香、檸檬草味；2，3-辛二酮含量分別達(dá)到0.81%、0.61%、0.51%、0.58%；甲基庚烯酮含量分別達(dá)到0.94%、0.46%、0.47%、0.44%，表明MR對整體風(fēng)味有一定影響。

酯類物質(zhì)大多是由羧酸和醇類的酯化作用產(chǎn)生的，大多對風(fēng)味起到積極的作用；SPH和3種MRPs的酯類數(shù)量分別達(dá)到3，8，4，6種，含量分別達(dá)到9%、7.53%、0.62%、1.37%。SPH中乙酸乙酯含量達(dá)到8.61%，呈現(xiàn)出水果味、甜味，但在3種MRPs體系中未檢測到乙酸乙酯。

呋喃類物質(zhì)大多具有肉香味和烤香味，呋喃類是重要的肉味物質(zhì)^[26]且閾值極低，SPH經(jīng)過美拉德反應(yīng)后呋喃類含量呈現(xiàn)顯著上升的趨勢（P＜0.05），SPH和3種MRPs中呋喃類的種類和含量分別達(dá)到1，3，4，4種和0.4%、10.27%、21.76%、3.95%，這也是SPH經(jīng)過MR后產(chǎn)生烤肉味的原因之一，對主體風(fēng)味產(chǎn)生了較大的影響。

吡嗪類具有堅果香，SPH中并未檢測到吡嗪類物質(zhì)，3種MRPs中分別檢測到3，1，1種，含量分別達(dá)到0.35%、0.1%、0.04%，主要由氨基酸Strecker降解形成的α-氨基酮通過縮合而成。烷烴類、酸類、酚類、烯類、醚類物質(zhì)含量占比小，對總體風(fēng)味的影響不大。

2.6 滋味評價

對SPH+葡萄糖、SPH+木糖、SPH+核糖3個樣品進(jìn)行剖面對比分析，從咸味、鮮味、酸味、甜味、苦味5種基本味道對比打分，見圖11。

由圖11可知，SPH經(jīng)過MR后在甜味、苦味上較SPH上升較大，在酸味上差異不明顯。SPH+木糖、SPH+核糖的MRPs苦味相比SPH明顯上升（P＜0.05），說明其MRS程度最徹底，但使得整體滋味接受度下降，同時鮮味下降明顯（P＜0.05）；最鮮的是SPH原液，SPH和SPH+葡萄糖整體上滋味較好；SPH+單糖對滋味有一定的改善作用，且作用效果突出。

3 結(jié)論

為了提高蝦廢料的利用率，探究不同條件對雙酶酶解蝦廢料的影響，采用單因素試驗設(shè)計和響應(yīng)面法優(yōu)化得出最佳的水解工藝條件：胰蛋白酶與木瓜白酶最佳酶比為2∶1，加酶量為5 000 U/g，液料比為40∶1，在此酶解條件下水解度可達(dá)（52±0.75）%。在最佳酶解條件的基礎(chǔ)上探究不同還原糖MRPs的褐變程度、中間產(chǎn)物、抗氧化能力、揮發(fā)性成分及感官評價，結(jié)果表明SPH+核糖的褐變程度、中間產(chǎn)物、抗氧化能力最強(qiáng)并帶有焦糖味，在滋味評價中，SPH+葡萄糖最好；SPH、3種單糖的MRPs分別鑒定出51，62，58，62種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醛類含量分別占22.42%、51.66%、58.23%、74.8%，可以看出SPH經(jīng)過MR后醛類是主要的呈味物質(zhì)，且含量均超過50%；同時呈現(xiàn)肉香味和烤香味的呋喃類物質(zhì)含量分別為0.4%、10.27%、21.76%、3.95%。MR可以用于改善SPH的風(fēng)味和滋味，為蝦廢料的開發(fā)提供技術(shù)支持。

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