生防放線菌BM-25的鑒定、生物學(xué)特性及應(yīng)用效果探究

摘要" 從煙草根際土壤中分離篩選由基生根串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）引起的煙草根黑腐病的拮抗菌株，并對其進行抑菌活性測定，形態(tài)學(xué)、生化和分子鑒定，通過盆栽試驗考察該拮抗菌株的生防效果。結(jié)果表明，從煙草根際土壤中分離篩選的菌株BM-25對煙草根黑腐病菌的抑菌率達52.78%，具有廣譜抑菌活性。依據(jù)形態(tài)學(xué)、生化和16S rRNA序列特征，將菌株BM-25初步鑒定為擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）菌株，定名為Nocardiopsis sp. BM-25。生物學(xué)活性測定結(jié)果顯示，菌株BM-25具有解磷、解鉀能力及產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）、解纖維素酶和解淀粉酶活性。盆栽試驗結(jié)果表明，與CK處理相比，菌株BM-25處理的煙草株高增加49.72%，莖粗增加44.53%，最大葉面積增加73.58%。以上結(jié)果表明，菌株BM-25對煙草具有良好的生防和促生效果，可作為煙草專用菌劑開發(fā)的備選遺傳資源。

關(guān)鍵詞" 生物防治；放線菌；物種鑒定；生物學(xué)特性；防效

中圖分類號" S435.72；S476"""""" 文獻標識碼" A"""""" 文章編號" 1007-7731（2025）01-0090-05

DOI號" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.01.018

Analysis of biocontrol Actinomycetes BM-25 identification， biological characteristics and control efficacy

Abstract" Antagonistic strains of tobacco root black rot caused by Thielaviopsis basicola were isolated and screened from tobacco rhizosphere soil， and their antibacterial activity， morphological， biochemical， and molecular identification were conducted. The biocontrol effect of antagonistic strains was investigated by pot experiment. The results showed that the antibacterial rate of BM-25 isolated from tobacco rhizosphere soil was 52.78%， which showed broad-spectrum antibacterial activity. Based on the morphological， biochemical and 16S rRNA sequence characteristics， BM-25 was initially identified as a Nocardiopsis strain，and named Nocardiopsis sp.BM-25. The bioactivity of strain BM-25"showed that it had the ability to solubilize phosphorus and potassium， and produced IAA， cellulolytic enzyme and amylase. The pot experiment results indicated that compared to the CK treatment， the strain BM-25 treatment increased the tobacco plant height by 49.72%， stem diameter by 44.53%， and the largest leaf area by 73.58%. The above results indicated that strain BM-25"had good biocontrol and growth promotion effects on tobacco， and could be used as a candidate genetic resource for the development of tobacco-specific bactericides.

Keywords" biological control; Actinomycetes; species identification; biological characteristics; control efficacy

煙草根黑腐病是煙草生產(chǎn)中為害較重的土傳真菌性病害之一，大多煙區(qū)有不同程度的發(fā)生，嚴重地塊發(fā)病率甚至超過30%[1-3]，造成較大經(jīng)濟損失。煙田套作模式的推廣和病原菌的逐年富集，使得煙草病害混合發(fā)生率提高。生物防治以其安全綠色、環(huán)境友好等優(yōu)勢得到廣泛應(yīng)用。目前已有多種拮抗煙草根黑腐病生防菌的報道。例如，宋玉娟等[1]研究發(fā)現(xiàn)，棘孢木霉T-6對煙草促生效果達到75.14%；羅云艷等[2]分離獲得了解淀粉芽孢桿菌LY79，其發(fā)酵液對感染煙草根黑腐病的盆栽防效達71.54%；易龍等[3]研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌TB72對煙草根黑腐病的防治效果達84.5%，對病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)抑制效果較好。放線菌是原核生物界可以形成分叉菌絲和分生孢子的一類革蘭氏陽性菌，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、工業(yè)和環(huán)境治理等領(lǐng)域[3]。目前有關(guān)廣譜抑制真菌且能有效防治煙草根黑腐病的放線菌報道不多。本研究從煙草根際土壤中篩選由基生根串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）引起的煙草根黑腐拮抗菌，對其進行鑒定和抑菌譜測定，并通過盆栽試驗驗證拮抗菌株的生防效果，為煙草專用菌劑開發(fā)及煙草根黑腐病害的田間防治應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

采集團棵期至成熟期的健康煙株根際土壤，共10份。煙草根黑腐病菌（Thielaviopsis basicola）、番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、牡丹黃斑病菌（Phyllosticta commonsii）、牡丹灰霉病菌（Botrytis cinerea）、煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）、小麥莖基腐病菌（Fusarium pseudograminearum）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）均保存于河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院微生物學(xué)實驗室。供試煙草品種為云煙87。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離純化、抑菌譜測定及物種鑒定""" （1）菌株篩選。土壤樣品陰干后研磨成粉末，采用稀釋涂布平板法培養(yǎng)，28"℃恒溫培養(yǎng)6"d，3次重復(fù)，觀察菌落生長情況，分離菌株純化后保藏。（2）菌株抑菌譜測定。以煙草根黑腐病菌為指示病原菌，觀察并篩選具有抑菌性的目標菌株。在無菌條件下制作煙草根黑腐病菌菌餅，轉(zhuǎn)移至PDA平板中心，菌餅四周接入拮抗菌，28"℃恒溫培養(yǎng)5"d，設(shè)置3次重復(fù)。觀察并測量抑菌圈大小，計算抑菌率[4]。

1.2.2 菌株鑒定""" 純化菌株依據(jù)《放線菌快速鑒定和系統(tǒng)分類》[5]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[6]進行形態(tài)學(xué)特征觀察。具體方法：菌株采用插片法在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)；經(jīng)戊二醛固定，PBS緩沖液清洗和不同梯度乙醇脫水處理，噴金和干燥后在掃描電鏡下觀察菌株超微結(jié)構(gòu)。菌株生理生化反應(yīng)鑒定包括菌株的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、木糖、乳糖和甘露醇的碳源利用能力，V-P試驗，氧化酶、甲基紅反應(yīng)，耐鹽性和pH適應(yīng)性。采用TaKaRa MiniBEST試劑盒和液氮冷凍法提取菌株基因組RNA，并進行16S rRNA分子鑒定。

1.2.3 菌株的生物活性測定""" 參考文獻[4]研究方法，測定拮抗菌株的解磷、解鉀促生特性，以及產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）、解纖維素酶和解淀粉酶的能力。

1.2.4 菌株的盆栽防效驗證試驗""" 設(shè)3個處理：CK，自然發(fā)?。瞻讓φ眨?；T1，自然發(fā)病后灌根接種30%多菌靈600倍稀釋液；T2，接種煙草根黑腐病孢子懸浮液后在煙草根莖部均勻接種1×108 cfu/mL的拮抗菌株發(fā)酵液，3次重復(fù)。接種20"d后，參考文獻[7-9]研究方法，統(tǒng)計煙草株高、葉數(shù)和莖圍等農(nóng)藝性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選及抑菌效果測定

采用稀釋涂布法從煙草根際土壤樣品中共分離得到32株不同的放線菌，以煙草根黑腐病菌和番茄枯萎病菌等7株病原菌為指示菌，采用平板對峙法，篩選出5株對煙草根黑腐病具有抑制效果的菌株BM-6、BM-7、BM-14、BM-20和BM-25，其中菌株BM-25的抑菌性最好，抑菌圈直徑達1.326"cm（圖1A～B），抑菌率52.78%。在光學(xué)顯微鏡下觀察菌株BM-25的菌絲形態(tài)，發(fā)現(xiàn)對照菌絲生長均勻，光滑平整，抑制組菌絲分枝增多、部分菌絲膨大變粗（圖1C～D）。對菌株BM-25進行進一步的抑菌譜測定，結(jié)果表明（圖1E～J），該菌株對多種病原真菌均具有一定的抑制效果（圖2），說明其抑菌譜較廣，開發(fā)應(yīng)用潛力較大。

2.2 目標菌株BM-25的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征""" 菌株BM-25在高氏一號平板28"°C培養(yǎng)6"d，其菌落表面粗糙、不透明，呈白色，中間凹陷、邊緣不規(guī)則，無可溶性色素（圖3A）；光學(xué)顯微鏡觀察菌絲形態(tài)，其基生菌絲黃色，多橫隔斷裂成桿狀，氣生菌絲豐富，呈白色，菌體長短不一，為弧形彎曲狀或不規(guī)則“Z”字形（圖3B）；掃描電鏡觀察菌絲形態(tài)，菌絲以橫隔分裂形成孢子，孢子表面光滑（圖3C）。

2.2.2 生化特征""" 生化試驗中，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、木糖、乳糖和甘露醇的測定結(jié)果均為陽性；V-P試驗結(jié)果呈陰性，氧化酶、甲基紅測定結(jié)果均呈陽性，在含2.5% NaCl環(huán)境中生長最好，不抗酸，在pH=8的培養(yǎng)基中生長較好，符合擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）種群特征描述。

2.2.3" 16S rRNA特征""" 菌株BM-25的基因序列長度1 532"bp，GenBank登錄號OR701611。BLAST比對和系統(tǒng)發(fā)育對比發(fā)現(xiàn)，菌株BM-25的16S rRNA與線團擬諾卡氏菌（Nocardiopsis synnemataformans）（DSM44143）聚類在同一分支，與對應(yīng)序列的同源性超過99%（圖4）。因此，將菌株BM-25初步鑒定為擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）菌株，定名為Nocardiopsis sp. BM-25。

2.3 菌株BM-25的生物學(xué)活性測定

將菌株BM-25接種到解磷培養(yǎng)基、解鉀培養(yǎng)基、IAA比色液、淀粉和纖維素培養(yǎng)基上培養(yǎng)，產(chǎn)生解磷圈（圖5A）、解鉀圈（圖5B）、產(chǎn)IAA（圖5C）、解淀粉圈（圖5D）和解纖維素圈（圖5E）。

2.4 菌株BM-25的應(yīng)用效果驗證

云煙87盆栽種植30"d后分別進行T1等3種處理，接種20"d后，CK組植株出現(xiàn)枯萎，根莖發(fā)黑；T2組根系白嫩，須根發(fā)達，分支較多；T1組植株長勢稍弱于T2組，CK組植株須根發(fā)黑偏黃，根長較短（圖6）。T1組植株較CK組長勢較好，但株高、莖圍和最大葉面積等指標均低于T2組，T2組植株株高、葉數(shù)、莖圍和最大葉面積均高于T1組和CK組（表1）。這表明經(jīng)菌株BM-25處理后的煙草生長較好，該菌株的抗病性和促生特性較強。

3 結(jié)論與討論

施用生物肥料不僅可以有效提高煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)，且更加環(huán)保，有利于促進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。本研究從煙草根際土壤中分離得到32株放線菌，篩選出BM-25菌株，通過試驗發(fā)現(xiàn)，其對煙草根黑腐病有較好的抑菌效果，抑菌率達52.78%，且具有廣譜抑菌性；菌株BM-25具有解磷、解鉀，分泌IAA，解淀粉酶和纖維素酶的能力，對煙草株高等農(nóng)藝性狀也有較好的促生作用。經(jīng)鑒定，BM-25菌株與線團擬諾卡氏菌（Nocardiopsis synnemataformans）具有超99%的序列同源性。擬諾卡氏菌屬是一類重要的微生物資源，其種類和功能豐富，被廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)和環(huán)境保護等領(lǐng)域[10]。近年來在資源開發(fā)方面，收集和挖掘天然高鹽堿和海洋等極端環(huán)境中的擬諾卡氏菌株成為趨勢[11-13]。通過生化反應(yīng)鑒定及防效驗證等試驗，發(fā)現(xiàn)菌株BM-25在堿性環(huán)境中生長良好，并對煙草根黑腐病菌具有較好的抑制作用，對煙草植株具有一定促生作用。該菌株的鑒定進一步豐富了煙草根黑腐病菌的生防菌資源庫，為該病害的田間防治應(yīng)用提供了選擇。后續(xù)試驗將嘗試對擬諾卡氏菌屬的次級代謝產(chǎn)物進行研究，針對其抑菌物質(zhì)和抑菌機理進行探索。

參考文獻

[1] 宋玉娟，韓雪蓮，張安盛，等. 棘孢木霉T-6對煙草促生及對黑脛病和根黑腐病的抗病作用[J]. 中國煙草科學(xué)，2020，41（1）：50-55.

[2] 羅云艷，安航，何佶弦，等. 煙草根黑腐病根際拮抗菌的篩選、鑒定及其促生防病效果[J]. 中國煙草科學(xué)，2021，42（3）：57-64.

[3] 易龍，肖崇剛. 煙草根黑腐病拮抗木霉菌株TB72的鑒定及抑菌作用[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，29（8）：1889-1893.

[4] 陳上，趙瑞，丁雙陽，等. 一株類芽孢桿菌的分離鑒定及其抗革蘭氏陰性菌活性測定[J]. 微生物學(xué)通報，2019，46（10）：2665-2672.

[5] 阮繼生，黃英. 放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類[M]. 北京：科學(xué)出版社，2011.

[6] 東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001.

[7] 何明川，曾舒泉，王志江，等. 一株煙草疫霉拮抗菌MC4-2的鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化及防效測定[J]. 微生物學(xué)通報，2021，48（12）：4636-4648.

[8] 賴寶春，戴瑞卿，曾天寶，等. 小串鏈霉菌XG40菌株發(fā)酵條件優(yōu)化及其次生代謝產(chǎn)物性質(zhì)研究[J]. 中國生物防治學(xué)報，2022，38（5）：1242-1251.

[9] 高諭康，劉培培，李燕楠，等. 淺藍霉素H產(chǎn)生菌CRM05的發(fā)酵條件優(yōu)化及其抗菌活性研究[J]. 中國抗生素雜志，2023，48（11）：1251-1260.

[10] 王辰，張谷月，張園園，等. 白刺鏈霉菌（Streptomyces albospinus）CT205菌株發(fā)酵條件優(yōu)化及其次生代謝產(chǎn)物性質(zhì)研究[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，38（2）：304-310.

[11] 賴寶春，吳振強，戴瑞卿，等. 琯溪蜜柚炭疽病拮抗放線菌的篩選和鑒定[J]. 熱帶作物學(xué)報，2020，41（9）：1876-1882.

[12] 王明環(huán)，孫愛麗，趙聯(lián)晶，等. 直絲紫鏈霉菌A8發(fā)酵條件優(yōu)化、活性成分初步分析及對水稻紋枯病的防效研究[J]. 中國生物防治學(xué)報，2021，37（4）：804-816.

[13] 李文均，張永光. 擬諾卡氏菌屬放線菌研究進展[J]. 微生物學(xué)通報，2016，43（5）：1123-1135.