葉黃素對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響分析

[摘要]目的：研究葉黃素對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用。方法：挑選5周齡SPF級(jí)健康雌性SD大鼠，在體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳至第三代后進(jìn)行細(xì)胞流式鑒定；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度葉黃素（1.25、2.5、5 μmol/L）對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響，以確定葉黃素的最終使用濃度。后續(xù)實(shí)驗(yàn)分三組：對(duì)照組（α-MEM培養(yǎng)基）、成骨培養(yǎng)基組和結(jié)合組（成骨培養(yǎng)基+葉黃素）。成骨誘導(dǎo)分化第7、21天時(shí)，分別用堿性磷酸酶及茜素紅染色法研究成骨細(xì)胞礦化過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)礦化結(jié)節(jié)生成；成骨誘導(dǎo)第5天，蛋白免疫印跡法觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因核心結(jié)合蛋白因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（Bone morphogenetic protein，BMP2）、骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：第3代細(xì)胞表面抗原中CD29、CD90的陽(yáng)性表達(dá)率為97.7%、74.8%，CD34、CD45陰性表達(dá)率為0.03%、1.61%；CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著葉黃素濃度的增加至5 μmol/L，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活力受到抑制，從而影響其正常的生物學(xué)功能。由此確定葉黃素最終使用濃度為2.5 μmol/L；堿性磷酸酶染色及茜素紅染色結(jié)果顯示，葉黃素能抑制細(xì)胞堿性磷酸酶的表達(dá)，降低骨礦化能力；Western blot結(jié)果顯示，葉黃素可使RUNX2、BMP2、OPN蛋白表達(dá)量下降。結(jié)論：葉黃素對(duì)大鼠BMSCs成骨分化有明顯的抑制作用。

[關(guān)鍵詞]葉黃素；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；成骨分化；創(chuàng)傷性顳下頜關(guān)節(jié)強(qiáng)直；堿性磷酸酶

[中圖分類(lèi)號(hào)]TQ461" " [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A" " [文章編號(hào)]1008-6455（2025）01-0001-05

Effect of Lutein on Osteogenic Differentiation of Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

GUO Sha1， Maimaitiaili·MAIMAITIMIN2， YAO Zhitao1，3

（ 1.Orthognathic Surgery of Oral-maxillofacial Trauma， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830054， Xinjiang， China; 2. Department of Prosthodontics and Implant， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830054， Xinjiang， China; 3. Xinjiang Institute of Stomatology， Urumqi 830054， Xinjiang， China ）

Abstract： Objective" To study the effect of lutein on osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Methods" 5-week-old SPF-grade healthy female SD rats were isolated and cultured in vitro， and then the mesenchymal stem cells were transferred to the third generation for cell flow identification. The effects of different concentrations of lutein （1.25， 2.5， 5 μmol/L） on the proliferation of rat bone marrow mesenchymal stem cells were observed in cell proliferation experiment to determine the final concentration of lutein. The follow-up experiments were divided into 3 groups： control group （α-MEM medium）， osteogenic medium group， and combination group （osteogenic medium + lutein）. On the 7th and 21st day of osteogenic differentiation， alkaline phosphatase and alizarin red staining were used to study the formation of mineralized nodules at different time points during the mineralization of osteoblasts. On the 5th day of osteogenic induction， runt-related transcription factor 2 of bone marrow mesenchymal stem cells was observed by western blotting. Runx2） bone morphogenetic protein 2 （BMP2）， osteopontin （OPN）， and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase （glyceraldehyde 3-phosphate） dehydrogenase （GAPDH） protein expression levels. Results" The third generation cell surface antigen， the positive expression rates of CD29 and CD90" were 97.7% and 74.8%， and the negative expression rates of CD34 and CD45 were 0.03% and 1.61%. CCK-8 cell proliferation experiment showed that with the increase of lutein concentration to 5 μmol/L， the activity of bone marrow mesenchymal stem cells was inhibited， thus affecting their normal biological function. The final concentration of lutein was determined to be 2.5 μmol/L. The results of alkaline phosphatase staining and alizarin red staining showed that lutein could inhibit the expression of alkaline phosphatase and reduce the mineralization ability of bone. Western blot results showed that lutein decreased the expression levels of RUNX2， BMP2 and OPN proteins. Conclusion" Lutein can significantly inhibit osteogenic differentiation of BMSCs in rats.

key words： lutein; bone marrow mesenchymal stem cells; osteogenic differentiation; traumatic temporomandibular joint ankylosis; alkaline phosphatase

顳下頜關(guān)節(jié)強(qiáng)直（Ankylosis of temporomandibularjoint，TMJA）是指各種原因引起的一側(cè)或雙側(cè)關(guān)節(jié)內(nèi)發(fā)生病變，造成關(guān)節(jié)內(nèi)纖維性或骨性粘連，導(dǎo)致患者張口受限、咀嚼困難，創(chuàng)傷是其主要病因[1-2]。目前，創(chuàng)傷性TMJA的發(fā)生機(jī)制闡述仍未統(tǒng)一。近年來(lái)，隨著組織工程學(xué)理論和技術(shù)的不斷進(jìn)步，以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）為種子細(xì)胞的組織工程技術(shù)為骨損傷修復(fù)帶來(lái)了新的希望。

來(lái)源于中胚層的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），能夠進(jìn)行自我更新，從而可實(shí)現(xiàn)多種不同的發(fā)育方式。因其易于在體外擴(kuò)增、易于外源基因?qū)?，現(xiàn)已成為骨組織修復(fù)領(lǐng)域重要的種子細(xì)胞[4]。對(duì)于TMJA，關(guān)節(jié)損傷后局部微環(huán)境改變，出現(xiàn)局部成骨因子表達(dá)增強(qiáng)的“異常骨愈合”現(xiàn)象，其局部微環(huán)境發(fā)生改變，可能促使TMJ間充質(zhì)干細(xì)胞定向遷移至骨斷端之間并主要向成骨方向分化，破壞了關(guān)節(jié)區(qū)正常骨組織損傷后改建修復(fù)的穩(wěn)態(tài)平衡[2]。因此，改善BMSCs成骨分化能力是防治顳下頜關(guān)節(jié)強(qiáng)直的關(guān)鍵。

葉黃素是一種含氧類(lèi)胡蘿卜素，分子式為C40H56O2，分子量是568.85[6]。天然來(lái)源的葉黃素（Lutein），人工合成困難，只能通過(guò)天然植物來(lái)提取，故又有“植物黃體素”之稱(chēng)[7]。藥用葉黃素不溶于水，易溶于油脂和脂溶性溶劑，儲(chǔ)存在2℃～8℃，避光防潮密閉干燥。葉黃素的生理功能主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：延緩動(dòng)脈粥樣硬化[8]；通過(guò)抑制活性氧自由基來(lái)抗氧化，增強(qiáng)人體免疫力[9]；保護(hù)視力及預(yù)防白內(nèi)障[10]。近年來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)其擁有一定的抗腫瘤[11-12]及調(diào)控破骨細(xì)胞代謝[10]，但目前葉黃素對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探究葉黃素對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響。

1" 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Sprague Dawley（SD）大鼠（5周齡）購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照國(guó)家衛(wèi)生研究院（NIH）實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理原則指南（NIP出版物85-23，1996年修訂）進(jìn)行，由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及應(yīng)用監(jiān)督委員會(huì)審定，倫理審批號(hào)為IACUC-20220442-18。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：葉黃素（北京索萊寶）；大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化試劑盒（Oricell）；α-MEM培養(yǎng)基、澳洲胎牛血清（Gibco）；1%青鏈霉素、0.25%trypsin-0．02%EDTA消化液、PBS（Hyclone）；流式細(xì)胞儀、CD34、45、29、90抗體（BD）；堿性磷酸酶改良鈣鈷法染液（北京索萊寶）；茜素紅染色液（北京索萊寶）；CCK-8試劑盒（北京博奧森）；PAGE凝膠快速制備試劑（Biotides）；CO2恒溫培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀（Thermo），倒置顯微鏡（Zeiss公司）。OPN、GAPDH、BMP2、羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG抗體（Proteintech）；RUNX2（Abcam）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取和培養(yǎng)：將5周齡大鼠頸部脫臼處死，置于75%醫(yī)用酒精中浸泡60 s，將大鼠股骨從周?chē)浗M織中取出，置于6 cm的培養(yǎng)皿中，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗。轉(zhuǎn)移至無(wú)菌超凈臺(tái)，將骨髓切成小塊，用含有20%胎牛血清（胎牛血清；Thermo）、1%青霉素、硫酸鏈霉素的a-MEM進(jìn)行培養(yǎng)。去除非貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)貼壁的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并擴(kuò)增以供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)融合度超過(guò)95%時(shí)，對(duì)粘附的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行傳代。使用1～3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行研究實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 流式鑒定：將第3代細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%左右時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心（1 500 rpm，3 min）；棄上清液，在含有2%胎牛血清的PBS的離心管中重懸1×107細(xì)胞，與CD29（PE，1μl），CD34（1μl），CD45（Alexa 647，1μl）和CD90（PE，1μl）常溫避光孵育30 min。孵育結(jié)束后用PBS清洗，繼續(xù)300μl含有2%胎牛血清的PBS重懸細(xì)胞；200目篩網(wǎng)過(guò)濾。將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管中進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。根據(jù)FlowJo7.7對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：以每孔2×103為密度的第3代BMSCs接種入96孔板，并在培養(yǎng)基中加入不同濃度（1.25、2.5、5μmol/L）的葉黃素，以檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響。實(shí)驗(yàn)中采用CCK-8試劑盒來(lái)測(cè)定葉黃素對(duì)BMSCs細(xì)胞增殖的抑制作用。同時(shí)取出孔板將原液小心吸出，用PBS洗滌2次。將10% CCK-8工作溶液加入96孔板中的每一個(gè)含100 μl培養(yǎng)基的小孔中，培養(yǎng)箱避光孵育2 h，動(dòng)態(tài)觀察工作液顏色變化。孵育結(jié)束后，將已完全反應(yīng)的工作液轉(zhuǎn)移到新的96板中，利用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，于450 nm處測(cè)定吸光度值。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行三次。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組及成骨誘導(dǎo)

1.2.4.1 實(shí)驗(yàn)分組：①對(duì)照組（α-MEM）將第3代細(xì)胞接種于含α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基的T25培養(yǎng)瓶中；②成骨組將第3代細(xì)胞接種于含成骨細(xì)胞培養(yǎng)基的T25培養(yǎng)瓶中；③聯(lián)合組將第3 d細(xì)胞接種于含成骨細(xì)胞培養(yǎng)基與濃度為2.5 mol/L的葉黃素T25培養(yǎng)瓶中，均置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.4.2 成骨誘導(dǎo)：將第3代BMSCs按2×104/孔接種于24孔平板上，每孔5×105接種于6孔板，1×106/皿接種于6 cm皿。每隔3 d更換一次新鮮專(zhuān)用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.2.5 堿性磷酸酶染色：在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天，從培養(yǎng)箱中取出6孔板置于超凈工作臺(tái)，去除孔內(nèi)原有培養(yǎng)基后用PBS洗3次。每個(gè)孔添加40 g/L的多聚甲醛溶液固定，30 min后，將固定液丟棄，使用PBS清洗3次。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，在每一個(gè)小孔中加入相應(yīng)數(shù)量的染液，室溫孵育30 min，完成后用吸液槍將小孔中的染液吸凈，再用PBS沖洗3次，最后一遍保留孔內(nèi)PBS并在倒置熒光顯微鏡下拍攝照片。

1.2.6 茜素紅染色：茜素紅染色在2.5μmol/L葉黃素濃度處理BMSCs后的第21天進(jìn)行茜素紅染色測(cè)定，評(píng)估成骨細(xì)胞的骨質(zhì)礦化情況。將6孔板從培養(yǎng)箱中取出，用吸液槍將原液吸取干凈后用PBS沖洗3遍；在每個(gè)孔中添加40 g/L的多聚甲醛溶液，固定15 min后棄固定液，PBS清洗3次。PBS清洗可以去除固定液中的有機(jī)成分，防止有機(jī)成分污染樣品，從而使樣品的分析結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。清洗結(jié)束后，將500μl茜素紅染色工作液小心加入每孔內(nèi)，室溫避光孵育30 min；孵育結(jié)束后棄染加PBS洗3次，最后一遍保留孔內(nèi)PBS并在倒置熒光顯微鏡下拍攝照片。

1.2.7 Western Blot印跡法檢測(cè)：將1×106個(gè)細(xì)胞接種于6 cm皿中進(jìn)行成骨誘導(dǎo)并用2.5μmol/L葉黃素處理后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。隨后收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解并在冰上靜置15 min后提取蛋白質(zhì)。使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（賽默費(fèi)世爾科學(xué)公司）定量蛋白質(zhì)濃度。用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠制膠完成后，每孔加入等量蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜（Merch公司），用5%脫脂奶粉常溫下阻斷2 h；清洗，采用一抗RUNX2、BMP2、OPN、GAPDH在4℃冰箱中孵育過(guò)夜，二抗孵育1 h，沖洗曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有的實(shí)驗(yàn)都至少進(jìn)行了3次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理采用SPSS 26.0軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用單因素方差分析多組間的差異，用最小顯著性差異進(jìn)行成對(duì)比較，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2" 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)及鑒定：分離提取得到的原代BMSCs正常培養(yǎng)狀態(tài)下，原代培養(yǎng)首次換液后，可見(jiàn)細(xì)胞呈圓形均勻鋪滿(mǎn)瓶底，培養(yǎng)72 h后的大鼠BMSCs細(xì)胞伸出偽足，多數(shù)細(xì)胞為梭形，有少量細(xì)胞呈多角形集落生長(zhǎng)，

并相互融合成單細(xì)胞層（見(jiàn)圖1）。第3代細(xì)胞表面抗原中CD29、CD90的陽(yáng)性表達(dá)率為97.7%、74.8%，CD34、CD45陰性表達(dá)率為0.03%、1.61%（見(jiàn)圖2）。該流式鑒定結(jié)果表明所提取的細(xì)胞是大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

2.2 葉黃素對(duì)BMSCs增殖活性的影響：研究葉黃素對(duì)BMSCs增殖活性的影響，設(shè)定不同濃度的葉黃素（1.25、2.5、5μmol/L）干預(yù)BMSCs，采用CCK-8法測(cè)定24 h和48 h BMSCs的增殖情況，從而選定應(yīng)用葉黃素的濃度。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，不同濃度葉黃素對(duì)BMSCs的增殖有明顯的促進(jìn)作用。當(dāng)葉黃素濃度大于2.5μmol/L時(shí)，隨著葉黃素濃度的升高，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度逐漸減慢。當(dāng)葉黃素濃度為2.5μmol/L時(shí)BMSCs的增殖活性最高。由此，選擇葉黃素濃度2.5μmol/L進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖3。

2.3 葉黃素對(duì)BMSCs成骨分化的作用：從CCK-8試驗(yàn)的結(jié)果看，選2.5μmol/L葉黃素對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)成骨分化。結(jié)果顯示。成骨誘導(dǎo)第7天，通過(guò)堿性磷酸酶染色及堿性磷酸酶染色陽(yáng)性區(qū)域的定量分析，與成骨組相比，聯(lián)合組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的堿性磷酸酶表達(dá)及活性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見(jiàn)圖4A～B。成骨誘導(dǎo)第21天，通過(guò)茜素紅染色結(jié)果顯示，成骨組茜素紅特異性紅染的鈣化結(jié)節(jié)較多，染色最深，紅染斑塊面積最大，鈣化結(jié)節(jié)形成能力較強(qiáng)，見(jiàn)圖4C。

2.4 葉黃素對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后成骨相關(guān)蛋白表達(dá)的影響：成骨誘導(dǎo)5 d后，用免疫印跡法檢測(cè)成骨相關(guān)基因BMP2、OPN、RUNX2的蛋白表達(dá)量。根據(jù)WB實(shí)驗(yàn)的條帶結(jié)果顯示，對(duì)照組與成骨組中BMP2、RUNX2的蛋白表達(dá)量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。聯(lián)合組與成骨組相比，聯(lián)合組BMP2、OPN、RUNX2的蛋白表達(dá)量均低于成骨組，差異有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.001），見(jiàn)圖5。以上結(jié)果證實(shí)，葉黃素可以通過(guò)某通路抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。

3" 討論

創(chuàng)傷性顳下頜關(guān)節(jié)（TMJ）強(qiáng)直（TMJA）是指創(chuàng)傷性誘導(dǎo)的髁突和TMJ窩之間的纖維或骨融合，骨損傷必然伴隨骨量缺失。一般情況下，正常骨組織具備強(qiáng)大的自我修復(fù)能力，可通過(guò)自體分泌骨生長(zhǎng)因子與其他細(xì)胞因子、激素的協(xié)同作用下形成新骨，同時(shí)刺激破骨細(xì)胞，使新骨不斷塑形改建，從而使受損骨組織的結(jié)構(gòu)和功能都得到恢復(fù)。而TMJA則是骨組織過(guò)度修復(fù)的表現(xiàn)[13]。這種情況可能導(dǎo)致慢性、持續(xù)性和進(jìn)行性無(wú)法張開(kāi)頜骨、面部畸形和阻塞性睡眠呼吸暫停-低通氣綜合征[14-15]。目前，間隙關(guān)節(jié)置換術(shù)截骨是緩解融合TMJ、緩解TMJA臨床癥狀的唯一有效治療方法。然而，由于該區(qū)域的神經(jīng)、血管和顱底非常接近，這種手術(shù)具有挑戰(zhàn)性，技術(shù)要求很高[16]。但TMJA的確切分子機(jī)制尚不完全清楚。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨形成和骨折愈合中至關(guān)重要[17]。在修復(fù)過(guò)程中，這些細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞因子和趨化因子，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP2），從鄰近的骨、骨髓或其他組織被招募到損傷部位形成骨性強(qiáng)直[18-19]。Imai Y等[19]和Hofmann A等[21]發(fā)現(xiàn)參與肥厚性骨折不愈合的組織中含有可分化為成骨細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞，這進(jìn)一步表明這些組織可能是骨形成的有效間充質(zhì)干細(xì)胞。在建立TMJA動(dòng)物模型時(shí)，Porto GG等[22]報(bào)道，與應(yīng)用骨移植相比，應(yīng)用BMSCs在TMJ損傷區(qū)域誘導(dǎo)了更多的骨形成和更嚴(yán)重的強(qiáng)直癥狀。目前，針對(duì)TMJA的防治方法包括切開(kāi)復(fù)位內(nèi)固定術(shù)、復(fù)位關(guān)節(jié)盤(pán)、開(kāi)口牙合墊的使用及藥物干預(yù)。而在既往的研究中主要藥物為地塞米松，地塞米松屬于激素類(lèi)藥物，長(zhǎng)期服用可引起許多不良反應(yīng)，如免疫系統(tǒng)下降、糖尿病、骨質(zhì)疏松等。

葉黃素是一種含氧類(lèi)胡蘿卜素，存在于各種瓜果蔬菜中，在萬(wàn)壽菊中含量非常豐富[5]。近年來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)其擁有一定的抗腫瘤[11-12]及調(diào)控破骨細(xì)胞代謝作用[10]。但目前葉黃素對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化影響國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。因此，利用葉黃素改善BMSCs向成骨分化的水平，對(duì)于有效預(yù)防TMJA的發(fā)生有重要的意義。

在本研究中，BMSCs在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別分化為成骨細(xì)胞且第三代細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)表面標(biāo)記物CD29、CD90，而細(xì)胞標(biāo)志物CD34、CD45很少。這些結(jié)果表明，所提取的細(xì)胞均為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。BMSCs的成骨過(guò)程受到藥物、激素、細(xì)胞因子等多種因素的影響，因此相關(guān)因子來(lái)調(diào)控BMSCs的成骨分化可以為臨床上有效預(yù)防TMJA提供新策略。堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞功能性酶，細(xì)胞堿性磷酸酶的活性和礦化結(jié)節(jié)形成是成骨細(xì)胞早期和中期成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志，也是BMSCs成骨分化的重要指征[23]。通過(guò)堿性磷酸酶染色來(lái)檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨活性，從而確定其成骨能力。茜素紅染色法測(cè)定成骨組織中鈣質(zhì)結(jié)節(jié)的數(shù)量。兩種染色方法提示，葉黃素可影響B(tài)MSCs成骨向分化，可減少ALP的表達(dá)，并抑制其骨礦化，因此可推測(cè)葉黃素對(duì)BMSCs成骨分化具有一定的抑制作用。此外，RUNX2在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用[24]，RUNX-2、OPN、BMP2是調(diào)控成骨分化的重要因子，是成骨細(xì)胞分化的生物標(biāo)志物。既往研究表明應(yīng)用BMSCs在TMJ損傷區(qū)域誘導(dǎo)了更多的骨形成和更嚴(yán)重的強(qiáng)直癥狀[22]且葉黃素具有調(diào)控骨質(zhì)代謝作用[10]，在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)成骨培養(yǎng)第5天后，RUNX-2、OPN、BMP2的蛋白表達(dá)明顯減少，進(jìn)一步提示葉黃素影響了間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，因此可推測(cè)葉黃素可能是防治顳下頜關(guān)節(jié)強(qiáng)直的有效試劑。

但是本研究也有一些局限性。首先，僅使用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為體外成骨細(xì)胞分化后葉黃素的作用靶點(diǎn)，具體機(jī)制尚未明確，且缺乏破骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞的分化。第二，需要進(jìn)行后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步了解葉黃素在預(yù)防顳下頜關(guān)節(jié)強(qiáng)直中起到的不同作用，并找到影響關(guān)節(jié)強(qiáng)直形成的分子機(jī)制，以期更好地指導(dǎo)臨床治療，這對(duì)于有效預(yù)防TMJA的發(fā)生有重要的意義。

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[收稿日期]2024-03-04

本文引用格式：郭莎，麥麥提艾力·麥麥提敏，姚志濤.葉黃素對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響分析[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2025，34（1）：1-6.