植物同源域指蛋白6對(duì)肝癌Hep-G2細(xì)胞遷移能力的影響

【摘要】目的 探討植物同源域指蛋白6（PHF6）對(duì)肝癌Hep-G2細(xì)胞遷移能力的影響，為臨床診療提供參考。方法 根據(jù)癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)分析PHF6在人正常肝臟和肝癌組織的表達(dá)情況，以及其表達(dá)對(duì)300余例肝癌患者近十年生存率的影響。比較siNC組（轉(zhuǎn)染PHF6無(wú)義序列）和siPHF6組（轉(zhuǎn)染siRNA-PHF6）細(xì)胞PHF6 RNA表達(dá)水平，利用劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞遷移能力，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)兩組細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因表達(dá)情況。結(jié)果 PHF6在肝癌患者中存在明顯過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，高表達(dá)PHF6患者存活率降低。轉(zhuǎn)染48 h后，siPHF6組細(xì)胞中PHF6 RNA表達(dá)水平低于siNC組（P=0.0016）。劃痕后12、24、48、72 h，siPHF6組細(xì)胞劃痕距離均大于siNC組，siPHF6組細(xì)胞遷移數(shù)量小于siNC組。與siNC組相比，siPHF6組細(xì)胞神經(jīng)鈣黏蛋白（CDH2）、纖連蛋白（FN1）的表達(dá)水平均降低，CDH1的表達(dá)水平升高（Plt;0.0001、Plt;0.0001、P=0.0018）。結(jié)論 沉默PHF6可顯著抑制肝癌細(xì)胞的遷移和EMT進(jìn)程，靶向PHF6治療肝癌具有應(yīng)用前途。

【關(guān)鍵詞】植物同源域指蛋白6；肝癌；Hep-G2；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

【中圖分類號(hào)】R394 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2096-2665.2025.02.0045.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2025.02.014

肝癌是全球死亡率排名第三的癌癥，肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是原發(fā)性肝癌的主要類型，占85%～90%[1-2]。目前，肝切除手術(shù)和肝移植能顯著延長(zhǎng)早期HCC患者的生存時(shí)間，但晚期患者復(fù)發(fā)率高、預(yù)后較差[3-4]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）是指上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有遷移能力的間充質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程。在這一過(guò)程中，上皮細(xì)胞逐漸失去黏附性，并明顯表現(xiàn)出間充質(zhì)細(xì)胞的特征，即細(xì)胞角蛋白Cytokeratins、上皮細(xì)胞鈣黏蛋白（CDH1）等上皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)下調(diào)，神經(jīng)鈣黏蛋白（CDH2）、波形蛋白（Vimentin）、纖連蛋白（FN1）等間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)增強(qiáng)[6]。癌癥分子靶向治療對(duì)治療肝細(xì)胞癌具有重要臨床意義。植物同源域指蛋白6（PHF6）是一種位于細(xì)胞核的染色質(zhì)結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。該基因位于人類染色體Xq26.3，屬于X連鎖基因，其突變?cè)贐?rjeson-Forssman-Lehmann綜合征中被發(fā)現(xiàn)[7-8]。 PHF6幾乎表達(dá)于所有組織，對(duì)神經(jīng)發(fā)育和造血很重要。在造血干細(xì)胞中敲除PHF6，可增加細(xì)胞自我更新能力，驅(qū)動(dòng)血癌發(fā)生，因此PHF6被認(rèn)為是一種抑癌基因[9-10]。敲除PHF6損害細(xì)胞增殖使其停滯在G（2）/M期，表明PHF6缺乏導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷的積累[11]。然而， PHF6是否影響肝癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移及作用機(jī)制尚未報(bào)道?；诖?，本研究探究PHF6對(duì)肝癌細(xì)胞Hep-G2遷移能力的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 取Hep-G2肝癌細(xì)胞株（購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)保藏中心），在飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（5% CO2、 37 ℃），培養(yǎng)基含有10%胎牛血清（FBS）（購(gòu)自Sigma公司）和1%青鏈霉素的DMEM（購(gòu)自Gibco公司）。細(xì)胞融合率達(dá)≥80%時(shí)用0.25%的胰酶（購(gòu)自Gibco公司）37 ℃消化1 min后傳代。實(shí)驗(yàn)分為siNC組（轉(zhuǎn)染 PHF6無(wú)義序列）、 siPHF6組（轉(zhuǎn)染siRNA-PHF6），每組使用的細(xì)胞數(shù)均為8×104個(gè)/ml細(xì)胞，每組設(shè)置3組重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 轉(zhuǎn)染PHF6基因 將8×104個(gè)/ml Hep-G2細(xì)胞接種于6孔板，每孔2 mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)8～12 h，融合率達(dá)40%進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine ? RNAiMAX Reagent （購(gòu)自Invitrogen公司）9 μL稀釋于150 μL Opti-MEM? Medium中，同時(shí)將2 μL（30 pmol）siRNA 儲(chǔ)存液加入150 μL opti-MEM? Medium中混合，室溫孵育5 min 后將二者混勻， 4 ℃ 孵育15 min后滴加到對(duì)應(yīng)孔中，培養(yǎng)6 h后更換培養(yǎng)液， 24～48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 siRNA-PHF6核酸序列如下：正義鏈， 5＇-GGCCUACAAGACAGCGCAATT3＇-；反義鏈：5＇-UUGCGCUGUCUUGUAGGCCTT3＇-，由金拓思（武漢）生物科技有限公司進(jìn)行設(shè)計(jì)并合成。

1.3 劃痕實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的siNC組和siPHF6組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞融合度≥90%時(shí)用10 μl槍頭垂直劃痕，隨后用磷酸鹽緩沖液（購(gòu)自Gibco公司）清洗細(xì)胞，去除雜質(zhì)和脫落的細(xì)胞，于培養(yǎng)0、 12、 24、 48、 72 h拍照記錄相同位置細(xì)胞的遷移變化，統(tǒng)計(jì)不同組別間細(xì)胞遷移差異。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 在6孔板的每孔Hep-G2細(xì)胞中添加500 μl Trizol裂解液（購(gòu)自TAKARA）以提取RNA，隨后測(cè)定提取RNA的濃度，并通過(guò)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。利用PrimeScriptTMII cDNA Synthesis Kit（購(gòu)自TAKARA）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，稀釋反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，以此作為實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板。檢測(cè)兩組細(xì)胞基因表達(dá)變化，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物序列，見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：起始95 ℃、 5 min；隨后變性溫度為95 ℃，維持 15 s，退火溫度為60 ℃，維持30 s，此過(guò)程共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。根據(jù)2-△△CT方法計(jì)算基因表達(dá)差異， 18S作為內(nèi)參。

1.5 Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 使用Transwell小室（孔徑8 μm，購(gòu)于Corning公司）進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞重懸于200 μL不含血清的DMEM溶液中，然后接種于上室。下室加入500 μL含10 % FBS的DMEM培養(yǎng)基作為催化劑。 37 ℃孵育24 h后，將已遷移至下室的細(xì)胞用100%甲醇在室溫下固定30 min，利用0.5%結(jié)晶紫溶液進(jìn)行30 min染色。對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行觀察，顯微鏡拍照。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 使用GraphPad Prism 9軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪圖，數(shù)據(jù)表示為（mean±SEM）；兩組間比較進(jìn)行Student t-test分析；對(duì)癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中患者生存率進(jìn)行對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)分析。0.01lt;Plt;0.05標(biāo)記為*， 0.001lt;Plt;0.01標(biāo)記為**， Plt;0.001標(biāo)記為***，Plt;0.0001標(biāo)記為****。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)肝癌患者存活率分析 PHF6在肝癌患者中存在明顯過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，見(jiàn)圖1-A；高表達(dá)PHF6患者存活率降低，見(jiàn)圖1-B、圖1-C。

2.2 兩組細(xì)胞PHF6 RNA表達(dá)水平比較 轉(zhuǎn)染48 h后， siPHF6組細(xì)胞PHF6 RNA表達(dá)水平低于siNC組（P=0.0016），見(jiàn)圖2。

2.3 劃痕、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 劃痕后12、 24、 48、 72 h， siPHF6組細(xì)胞劃痕距離均大于siNC組，見(jiàn)圖3-A、圖3-B。 siPHF6組細(xì)胞遷移數(shù)量小于siNC組，見(jiàn)圖3-C。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析結(jié)果 與siNC組相比， siPHF6組細(xì)胞CDH2、 FN-1的表達(dá)水平降低， CDH1的表達(dá)水平升高（Plt;0.0001、 Plt;0.0001、 P=0.002），見(jiàn)圖4。

3 討論

PHF6的體細(xì)胞功能突變?cè)赥細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病（T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL）中非常普遍，也存在于急性骨髓白血病（acute myeloid leukemia，AML）中，且敲除PHF6基因的造血干細(xì)胞（HSC）的重建和自我更新能力增強(qiáng)，這均表明PHF6可能是一種抗癌基因[12-14]。然而，PHF6在乳腺癌和結(jié)直腸癌中顯著高表達(dá)，提示PHF6可能參與其他惡性腫瘤，本研究將探討其在肝癌中的作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，PHF6在肝癌患者中存在明顯過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，高表達(dá)PHF6患者存活率降低；轉(zhuǎn)染48 h后，siPHF6組細(xì)胞中PHF6的RNA表達(dá)水平低于siNC組；劃痕后12、24、48、72 h，siPHF6組細(xì)胞劃痕距離均大于siNC組，siPHF6組細(xì)胞遷移數(shù)量小于siNC組；與siNC組相比，siPHF6組細(xì)胞CDH2、FN-1的表達(dá)水平降低，CDH1的表達(dá)水平升高。分析原因?yàn)?，EMT是指上皮細(xì)胞失去相互連接和極性，轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的現(xiàn)象。這一過(guò)程的激活是上皮癌細(xì)胞獲得惡性表型的核心機(jī)制，也是癌癥轉(zhuǎn)移和侵襲的重要環(huán)節(jié)[15]。因此，抑制EMT會(huì)干擾腫瘤的進(jìn)展。敲低PHF6可能通過(guò)上調(diào)E-cadherin和下調(diào)N-cadherin和Fibronectin-1來(lái)抑制EMT過(guò)程，繼而肝癌細(xì)胞Hep-G2細(xì)胞的遷移能力減弱。

此外， PHF6能招募組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39H1至rDNA（核糖體DNA）區(qū)域，并借助SUV39H1的三甲基化酶活性來(lái)提升rDNA區(qū)域組蛋白H3的9位賴氨酸殘基甲基化（H3K9me3）的水平，從而抑制rDNA轉(zhuǎn)錄。敲低PHF6則能夠通過(guò)促進(jìn) rDNA的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)[16]。但在T-ALL和AML的小鼠動(dòng)物模型中，敲低PHF6后腫瘤增長(zhǎng)速率卻加快；而在小鼠的急性B細(xì)胞淋巴白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）模型中，通過(guò)慢病毒技術(shù)敲低PHF6后，觀察到腫瘤的增長(zhǎng)速率顯著減緩[17]。本研究證明敲低PHF6可抑制肝癌細(xì)胞的遷移，進(jìn)而起到治療肝癌的作用，但這是否也是PHF6作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控表觀遺傳進(jìn)程來(lái)實(shí)現(xiàn)的，仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，沉默PHF6可顯著抑制肝癌細(xì)胞的遷移和EMT進(jìn)程，靶向PHF6治療肝癌具有應(yīng)用前途。通過(guò)基因編輯技術(shù)降低PHF6的表達(dá)或開(kāi)發(fā)PHF6的小分子抑制劑，特異性地降低PHF6的表達(dá)或功能，從而抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，可作為肝癌治療的新思路。

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