大骨節(jié)病差異表達基因PAPSS2對成骨細胞礦化及堿性磷酸酶活性的影響

王偉卓，程一釗，郭 雄，王坤正，袁普衛(wèi)

(1.西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院骨科，陜西西安 710004；2.西安交通大學醫(yī)學院環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點實驗室及衛(wèi)生部微量元素與地方病重點實驗室，陜西西安 710061；3. 陜西中醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨科，陜西咸陽 712000)

骨礦化過程涉及多種機械和代謝之間的相互作用，骨的形成和維持是成骨細胞和破骨細胞復雜的動態(tài)平衡，其增殖和分化由生長因子、細胞因子以及多種酶相互作用進行調(diào)控。許多骨骼疾病，如骨質(zhì)疏松癥、大骨節(jié)病(Kashin-Beck disease, KBD)、Paget病、類風濕關(guān)節(jié)炎和骨轉(zhuǎn)移癌等與成骨細胞和破骨細胞中的相對活性不平衡密切相關(guān)[1]。

PAPSS2(3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate synthetase 2)是體內(nèi)催化合成活性硫酸根供體的重要酶類基因。人類的PAPS合成ATP和SO42-兩種異構(gòu)體的PAPS合成酶(PAPSS)：PAPSS1和PAPSS2。PAPSS2是在骨形成和其他組織細胞外基質(zhì)分子的硫酸化所需的主要酶之一[2-3]。本實驗室前期基因芯片研究表明，PAPSS2基因在膝骨性關(guān)節(jié)炎與KBD中差異表達，與KBD骨骼病變可能具有相關(guān)性，患者表現(xiàn)為長骨變短及膝和手指關(guān)節(jié)增粗增大，呈現(xiàn)缺乏青春期生長突增的特點[4-5]。PAPSS2基因作為篩選出的可疑候選疾病相關(guān)基因與KBD的發(fā)病存在一定的因果關(guān)系。本實驗初步研究PAPSS2在小鼠成骨樣細胞中的作用，以了解其對KBD骨骼代謝影響的機制。

1材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)及成骨誘導本研究得到西安交通大學實驗動物及倫理委員會的批準。Phoenix包裝細胞系，小鼠成骨樣細胞株MC3T3-E1購自上海生命科學研究院細胞資源中心。細胞接種密度為1×104cells/cm2，培養(yǎng)液為改良的DMEM培養(yǎng)基加100 mL/L胎牛血清(Gibco)、100 U/mL青霉素以及100 mg/mL鏈霉素，維持在37 ℃含50 mL/L CO2飽和濕度條件下，每隔5～7 d傳代，不超出20代。

在成骨細胞生長培養(yǎng)基中通過加入0.05 mg/mL的抗壞血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸鹽(OS media)，對MC3T3-E1克隆4細胞進行成骨誘導，培養(yǎng)14 d，并進行PAPSS2檢測等后續(xù)實驗。

1.2PAPSS2慢病毒包裝、滴度測定和細胞轉(zhuǎn)染為了證明成骨細胞分化的重要性，分析PAPSS2功能，在培養(yǎng)液中采用慢病毒介導的RNAi技術(shù)在MC3T3-E1細胞中沉默PAPSS2表達[5]。轉(zhuǎn)染慢病毒的生成采用293FT細胞系，共轉(zhuǎn)染的表達構(gòu)建體(PAPSS2的Plenti-shRNA和pLenti-P2A、Plenti-P2B)和包裝混合物產(chǎn)生病毒(TaKaRa RNAi，大連寶生物)。病毒上清液收獲后48～72 h，感染293T細胞，用系列稀釋的濃縮慢病毒滴度測定。轉(zhuǎn)染并孵育48 h后，用RT-PCR、Western blot和免疫染色等方法檢測，以確定PAPSS2基因沉默的效率。

1.3PAPSS2高表達載體的構(gòu)建和逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染通過插入一個完整長度的3.64 kb的PAPSS2 cDNA(基因號No:NM_011864)、EcoRⅠ和NotⅠ位點的pBMN-I-GFP(Addgene)，構(gòu)建pBMP-PAPSS2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，包裝方法來自斯坦福大學加里諾蘭實驗室[5]。再分別包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBMN-I-GFP(對照)和pBMN PAPSS2氯化鈣沉淀法轉(zhuǎn)染Phoenix-eco細胞。轉(zhuǎn)染后，細胞放置在32 ℃培養(yǎng)箱(32 ℃有助于穩(wěn)定的病毒)48 h。收集含有感染性病毒的培養(yǎng)液，并通過滴定法0.45 mm的過濾器和過濾感染的MC3T3-E克隆4細胞。觀察GFP 陽性細胞證實GFP和PAPSS2蛋白表達，再進行免疫組化和Western blot分析。培養(yǎng)皿長滿70%～80%的MC3T3-E1細胞時，使用0.006 mg/mL Polybrene協(xié)助逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶pBMP PAPSS2和pBMN-I-GFP感染細胞。

1.4RT-PCR檢測PAPSS2表達使用Trizol試劑(Invitrogen)提取MC3T3-E1細胞中RNA，采取兩步逆轉(zhuǎn)錄PCR法擴增，檢測mRNA的表達。引物的序列如下：PAPSS2(正向引物，5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′，反向引物，5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′)，PCR擴增產(chǎn)物通過12 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行分離，為提高每個轉(zhuǎn)錄的準確度，有關(guān)頻帶使用NIH Image J圖像量化軟件和所產(chǎn)生的條帶以GAPDH進行水平標準化。PCR反應條件分別如下：94 ℃ 1 min 35個循環(huán)：95 ℃ 30 s和58 ℃ 40 s。實驗重復3次。結(jié)果與看家基因GAPDH的PCR結(jié)果相比較，評估使用循環(huán)閾值比較法計算。

1.5Westernblot檢測及免疫組化染色用含有蛋白酶抑制劑(Invitrogen公司)的NP40緩沖液(10 g/L NP-40、0.15 mol/L的NaCl、50 mmol/L的Tris，pH值8.0)裂解細胞。細胞裂解液20 min后，在4 ℃下以12 000 r/min離心，上清液-80 ℃存儲，使用BCA蛋白測定試劑(Pierce)進行蛋白質(zhì)定量。等量的蛋白質(zhì)變性SDS樣品緩沖液中，100 g/L的聚丙烯酰胺-SDS凝膠上分離。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的25 mmol/L的Tris，192 mmol/L的甘氨酸和200 mL/L的甲醇，以產(chǎn)生聚偏二氟乙烯。用Tris緩沖鹽水(TBS的20 mmol/L的Tris-HCl和137 mmol/L NaCl的pH為7.5)加1 mL/L Tween20的含有30 g/L的干奶粉阻斷印跡。使用一抗PAPSS2抗體(ABNOVA)，二抗(ABNOVA)和增強的化學發(fā)光檢測系統(tǒng)。

細胞與PAPSS2作用后，鋪于24孔板中，并保溫過夜。依次用100 mL/L正常兔或小鼠血清的PBS作用60 min，然后相應地在小鼠的抗PAPSS2抗體(0.001 mg/mL，Sigma公司)孵育10 min，用1 000 mL/L甲醇固定，兔抗PAPSS2的特異性多克隆抗體(1 μg/mL，ABNOVA)在TBS含有15 mL/L正常兔或山羊血清，過夜后將細胞孵育的FITC-或HRP偶聯(lián)的抗兔鼠IgG(1 μg/mL，ABNOVA)，15 mL/L正常兔、驢或山羊血清，分別作用60 min。細胞用FITC標記抗體，然后洗滌3次，在PBS中，用顯微鏡檢查。細胞核進行DAPI染色進行細胞數(shù)量的測定。

1.6堿性磷酸酶(ALP)活性的測定采取LOWRY等[6]改良的方法測定。將PAPSS2高表達、低表達及對照組的MC3T3細胞，成骨誘導7、14 d，測定ALP活性。測定混合物中含有0.1 mol/L的2-氨基-2-甲基-1-丙醇，0.001 mol/L的氯化鎂，0.008 mol/L的對硝基苯基磷酸二鈉(Sigma公司)和細胞勻漿。溫育3 min后，停止反應，用0.1 mol/L的NaOH，并在405 nm處讀出吸光度值(A)。按照說明，用p-硝基苯酚(Sigma公司)制備標準曲線。細胞的DNA根據(jù)Schneider的方法測定[7]。

1.7茜素紅染色及vonKossa染色測量細胞外基質(zhì)鈣化結(jié)節(jié)的形成茜素紅染色法可與鈣相結(jié)合形成矩陣。作用14 d后，用PBS洗滌細胞2次，再用20 mL/L甲醛固定。對細胞進行染色，用40 mmol/L的茜素紅溶液(pH 4.4)，在室溫下代謝40 min，并用去離子水漂洗2次。使用相差顯微鏡及數(shù)碼相機(IM50，萊卡，德國)捕獲被染色的細胞圖像。通過抽吸除去茜素紅溶液，將細胞用去離子水漂洗5次。定量采取茜素紅染色樣品中的濃度測定，通過比較與茜素紅標準中得到的吸光率值。用100 g/L cetylpyridinium chloride(Sigma)溶解在10 mmol/L磷酸鈉(pH 7.0)中將細胞脫色15 min，然后轉(zhuǎn)移到96孔板中，并用分光光度計測定在562 nm處的吸光度。礦化值進行歸一，直接在96孔板中確定的相對數(shù)小孔[8]。

由于鈣與矩陣中的磷酸根離子共同形成沉淀物，von Kossa染色也用于測定細胞的礦化[9]。PBS洗滌細胞15 min，用20 mL/L甲醛固定。用去離子水洗滌3次后，將細胞培養(yǎng)在室溫下，用30 g/L的硝酸銀在紫外光下作用1 h。用去離子水洗滌后，使用相差顯微鏡拍攝染色細胞的圖像。

1.8統(tǒng)計分析使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析。Tukey HSD test用來作個post hoc檢驗。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1成骨細胞分化中PAPSS2mRNA及蛋白的表達變化RT-PCR結(jié)果顯示，PAPSS2 mRNA水平隨著成骨細胞的誘導分化過程，表達呈逐漸增多的趨勢，在14 d左右MC3T3-E1分化為成骨細胞時表達比較明顯(圖1A、1B)。管家基因GAPDH表達在一個幾乎不變的水平。進一步Western blot的檢測結(jié)果顯示其蛋白表達水平與mRNA水平表現(xiàn)一致，這些也與文獻的報告相符[10](圖1C、1D)。

圖1 成骨細胞MC3T3-E1誘導分化各時間點PAPSS2 mRNA及蛋白表達的變化

2.2PAPSS2沉默衰減礦化作用和降低ALP活性與空載體細胞轉(zhuǎn)染相比較，編碼小分子干擾RNA(siRNA)的PAPSS2結(jié)構(gòu)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后3、7、14 d， PAPSS2在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PAPSS2沉默的細胞株中，mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達被抑制，而且在轉(zhuǎn)染后第7天，PAPSS2沉默的慢病毒感染的細胞中檢測不到PAPSS2蛋白；同時采用干擾7 d后PAPSS2表達的免疫熒光染色，PAPSS2沉默細胞的PAPSS2蛋白表達變化與RT-PCR和Western blot的結(jié)果一致(圖2)。第7天測定ALP活性，沉默組和對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0019，圖3)。

圖2 PAPSS2基因沉默病毒轉(zhuǎn)染及其PAPSS2的表達變化

采取von Kossa染色、茜素紅染色觀察礦化及定量分析，均表明PAPSS2的沉默可顯著降低ALP活性(P=0.0213)和細胞礦化(圖3)。這些均表明，PAPSS2沉默可以減弱MC3T3-E1細胞成骨的ALP活性和礦化。

2.3PAPSS2高表達對成骨細胞的ALP活性和礦化的影響通過在MC3T3-E1細胞中病毒轉(zhuǎn)染高表達PAPSS2[5]，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，進行RT-PCR、Western blot及免疫熒光染色，結(jié)果顯示，病毒感染的細胞與對照組比較， PAPSS2蛋白表達增加(圖4)。與轉(zhuǎn)染空載體的細胞株相比較，蛋白水平上的高表達PAPSS2都能檢測到PBMN-I-GFP-PAPSS2。

而且轉(zhuǎn)染的MC3T3-E1細胞中，檢測到礦化信號，誘導7 d及14 d后，PAPSS2過表達轉(zhuǎn)染細胞的ALP和細胞礦化都增強；茜素紅染色礦化量化結(jié)果與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；PAPSS2過表達轉(zhuǎn)染的細胞比轉(zhuǎn)染空載體的細胞的ALP活性更高(P=0.0211，圖5)。這些均表明，PAPSS2促進成骨細胞的ALP活性和礦化。

3討論

PAPSS2是一種廣泛參與細胞外基質(zhì)蛋白聚糖硫代謝相關(guān)酶。其異常將會影響整個蛋白聚糖的硫酸化過程，而蛋白聚糖的硫酸化對于軟骨細胞的生長發(fā)育和轉(zhuǎn)錄后功能修飾非常重要。一些研究表明許多骨骼系統(tǒng)疾病與PAPSS2基因有關(guān)。曾報道KBD和一些嚴重的遺傳性骨骼發(fā)育障礙疾患，如人類干骺端發(fā)育不良(spondyloepimetaphyseal)，骨軟骨發(fā)育不良(osteochondrodysplasias)與PAPSS2失活突變相關(guān)。華盛頓大學SCHWARTZ等報道外形矮小和短絀為特點Brachymorphism(bm)的小鼠，主要表現(xiàn)為四肢變短(尾巴粗短)及顱骨畸形，同時還伴有其他臟器的損害。發(fā)現(xiàn)bm小鼠的發(fā)育障礙與其骺板軟骨中PAPSS2缺失有關(guān)。一種巴基斯坦家庭患有的spondyloepimetaphyseal發(fā)育不良(SEMD)與PAPSS2基因的異常有關(guān)[11-12]。一個純合子PAPSS2的突變(S475X)被認定是SEMD的病因[12-13]。表現(xiàn)為不成比例的身材矮短小、下肢關(guān)節(jié)腫大、脊柱側(cè)后凸畸形和手足過短。Diastrophic發(fā)育不良是一種常染色體隱性遺傳的骨軟骨發(fā)育，構(gòu)成骨骼系統(tǒng)的疾病，增長或骨質(zhì)密度有缺陷(包括短肢身材，腭裂，全身關(guān)節(jié)發(fā)育不良，搭車拇指等)。IKEDA等[14]參照骨關(guān)節(jié)炎進行了PAPSS2序列多態(tài)性的調(diào)查，人類缺乏正常PAPSS2的活性具有長骨縮短和彎曲，也顯示退行性骨關(guān)節(jié)病、膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的表現(xiàn)。鑒于在突變小鼠和其他相似之處SEMD小鼠和人類缺乏正常PAPSS2的活性過早退行性膝關(guān)節(jié)病的發(fā)展，已經(jīng)有學者提出，這個突變體人類PAPSS2缺乏相關(guān)的關(guān)節(jié)模型[11]。這些都說明PAPSS2基因在骨骼發(fā)育過程中可能參與重要環(huán)節(jié)，直接影響成骨細胞的代謝。

圖3 PAPSS2基因沉默病毒轉(zhuǎn)染及其對堿性磷酸酶活性、成骨細胞礦化的影響

本實驗室前期成功利用寡核苷酸基因芯片技術(shù)，進行了KBD與正常人軟骨細胞人類全基因掃描，繪制差異基因表達譜，并進行定量實時反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)驗證結(jié)果的可靠性，應用Cluster和Treeview軟件對差異表達基因進行聚類分析，初步的生物信息學研究發(fā)現(xiàn)，KBD骨與軟骨細胞存在PAPSS2基因水平的變化[4,15-16]。本實驗在此基礎(chǔ)上，利用前成骨細胞的MC3T3-E1細胞進行分化和礦化基質(zhì)形成研究。ALP活性在成骨細胞礦化骨形成過程中是非常重要的，因為ALP通過水解焦磷酸鹽和無機磷酸鹽促進成骨細胞的礦化基質(zhì)蛋白形成。為確定PAPSS2是否會影響MC3T3-E1細胞ALP活性和礦化，本實驗還對ALP活性進行了評價。研究沉默PAPSS2時，顯著減少了作為成骨細胞分化的重要調(diào)節(jié)因子堿性磷酸酶活性，表明PAPSS2在促進成骨細胞的分化中起著重要的作用。與之相反，高表達PAPSS2在轉(zhuǎn)染后，表現(xiàn)出對ALP活性的抑制作用。通過染色及定量分析研究，對骨形成中的礦化作用表現(xiàn)出正性作用。但是這些作用涉及哪些細胞因子的參與，調(diào)節(jié)通路又是什么，需要進一步研究。

圖4 PAPSS2基因高表達病毒轉(zhuǎn)染及其PAPSS2的表達變化

圖5 PAPSS2基因高表達病毒轉(zhuǎn)染及其對堿性磷酸酶活性、成骨細胞礦化的影響

以上結(jié)果表明，PAPSS2在成骨細胞分化中起著重要的作用，在KBD中的異常表達與KBD關(guān)節(jié)畸形可能相關(guān)，需進一步研究。沉默PAPSS2減少ALP分泌及活性，減弱成骨細胞的礦化作用，增加PAPSS2表達，可以促進ALP分泌及活性，增強成骨細胞的礦化作用。

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