尿脫落足細(xì)胞與IgA腎病的相關(guān)性研究

李利利，楊浩杰，張文靜，尹愛(ài)平，孫吉平

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)院；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎病中心腎內(nèi)科，陜西西安 710061)

IgA腎病(IgA nephropathy, IgAN)已成為世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)性腎小球疾病，占原發(fā)性腎小球疾病的20%～50%[1-2]。IgA腎病的臨床表現(xiàn)和病理表現(xiàn)多種多樣，大多數(shù)患者病情呈進(jìn)展性，約15%～40%的成人患者在10年后會(huì)進(jìn)入終末期腎病[3-4]，需替代治療維持生命，給患者及社會(huì)帶來(lái)了巨大的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，正確認(rèn)識(shí)和評(píng)價(jià)IgA腎病的疾病狀態(tài)，尋找與疾病活動(dòng)性、進(jìn)展或預(yù)后相關(guān)指標(biāo)對(duì)臨床工作有重要意義。腎臟病理是IgA腎病診斷的金指標(biāo)，但腎臟穿刺活檢是一項(xiàng)有創(chuàng)檢查，臨床上難以通過(guò)反復(fù)腎臟穿刺來(lái)監(jiān)測(cè)疾病的發(fā)展。近年來(lái)，血清、尿液中的一些無(wú)創(chuàng)傷性檢查在IgA腎病診斷及病理?yè)p傷評(píng)估的研究已成為熱點(diǎn)，對(duì)臨床工作有重要的指導(dǎo)意義。

足細(xì)胞(podocyte)與基底膜和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞一起構(gòu)成腎小球血液濾過(guò)屏障，是維持腎小球?yàn)V過(guò)膜結(jié)構(gòu)和功能正常的主要細(xì)胞之一[5]。當(dāng)足細(xì)胞受到損傷時(shí)，細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列的形態(tài)改變，直至從基底膜上分離剝脫到腎小囊中，隨尿液排除[6]。Podocalycin(PCX)由腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和足細(xì)胞合成，在足細(xì)胞成熟過(guò)程中固定于腎小球足細(xì)胞頂膜，對(duì)腎小球?yàn)V過(guò)屏障起負(fù)調(diào)節(jié)作用[7]。Podocalyxin蛋白是主要的足細(xì)胞標(biāo)志蛋白，通常僅以抗Podocalyxin用于鑒別足細(xì)胞[8]。因此，我們?cè)噲D通過(guò)檢測(cè)尿中足細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白Podocalyxin表達(dá)來(lái)判斷尿脫落足細(xì)胞數(shù)量，并與IgA腎病的臨床病理進(jìn)行相關(guān)性分析，以期為臨床上治療、預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展及預(yù)后提供一個(gè)新的無(wú)創(chuàng)傷的指標(biāo)。

1材料與方法

1.1研究對(duì)象2011年4月至2011年10月在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科行腎臟穿刺活檢明確診斷為原發(fā)性IgA腎病的患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：①行腎臟穿刺活檢，病理明確診斷為原發(fā)性IgA腎病，其中包括光鏡、免疫熒光及部分電鏡診斷，每例標(biāo)本光鏡下腎小球數(shù)目≥5個(gè)腎小球，免疫熒光可見(jiàn)IgA或以IgA為主的免疫復(fù)合物在腎小球系膜區(qū)(伴有或不伴有毛細(xì)血管區(qū))沉積，強(qiáng)度可分為+～；②性別不限，年齡≥12歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①排除過(guò)敏性紫癜、慢性酒精性肝病、乙肝病毒相關(guān)性腎病、強(qiáng)直性脊柱炎、銀屑病、狼瘡腎炎等繼發(fā)性腎臟損害；②排除伴有其他原發(fā)性腎小球腎炎及糖尿病伴發(fā)IgA腎??；③排除各種藥物、有機(jī)溶劑以及腫瘤等原因引起的腎臟損害。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；參試者均簽署知情同意書(shū)。

共收集到原發(fā)性IgA腎病的患者108例，有12例因光鏡下腎小球數(shù)目<5個(gè)而剔除，最終入組共96例(男性58例，女38例，男∶女=1.52∶1)；對(duì)照組10例，系來(lái)自我院泌尿外科單純腎腫瘤切除，并排除腎臟其他疾病的患者。

1.2資料收集①基本資料。包括一般情況，如年齡、性別、病程、發(fā)病時(shí)是否伴有高血壓、浮腫、腰痛；②實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)。包括尿液檢查，如尿中紅細(xì)胞、尿中上皮細(xì)胞、尿中管型細(xì)胞、24 h尿蛋白定量、尿β2微球蛋白；血液學(xué)檢測(cè)包括白蛋白、血紅蛋白、膽固醇、血β2微球蛋白、尿素氮、血肌酐、尿酸、胱抑素及免疫學(xué)指標(biāo)IgA、IgE、IgG、IgM、C3、C4；③腎臟穿刺病理指標(biāo)。腎小球、腎小管間質(zhì)評(píng)分包括腎小球系膜增生程度、腎小球硬化程度、腎小管間質(zhì)評(píng)分(RTIS)等；活動(dòng)性指標(biāo)如內(nèi)皮細(xì)胞增生指數(shù)(endoI)、破壞腎小球毛細(xì)血管袢活動(dòng)性指數(shù)(dGAI)、系膜細(xì)胞增生指數(shù)(MsHI)、系膜基質(zhì)增多指數(shù)(MsMI)、腎小球慢性病變指數(shù)(GCI)、腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)指數(shù)(infI)，慢性化指標(biāo)包括腎小管萎縮和腎間質(zhì)纖維化指數(shù)(TCI)及小動(dòng)脈慢性病變指數(shù)(VCI)等。

1.3患者分組①不同程度蛋白尿分組：1組，24 h尿蛋白定量為0.3～1.0 g；2組，24 h尿蛋白定量為1.0～3.0 g；3組，24 h尿蛋白定量>3 g；對(duì)照組，24 h尿蛋白量<0.15 g。②不同程度腎功能分級(jí)分組：根據(jù)中國(guó)人改良后的公式eGFR=175×Pcr-1.234×age-0.179×[0.79 if female]計(jì)算患者eGFR，慢性腎臟病(CKD)分期按照K/DOQI慢性腎臟病臨床實(shí)踐指南分組：CKD 1期：GFR≥90 mL/(min·1.73m2)，CKD 2期：GFR 60～89 mL/(min·1.73m2)，CKD 3期GFR 30～59 mL/(min·1.73m2)，CKD 4期GFR介于15～29 mL/(min·1.73m2)，CKD 5期GFR<15 mL/(min·1.73m2)或透析。③病理分型：按照Lee病理分級(jí)將IgA腎病分為5級(jí)，標(biāo)準(zhǔn)如下：Ⅰ級(jí)表現(xiàn)為腎小球絕大多數(shù)正常，偶爾輕度系膜增寬(節(jié)段、伴或不伴細(xì)胞增生)，間質(zhì)基本正常；Ⅱ級(jí)表現(xiàn)為腎小球示局灶系膜增殖和硬化(<50%)，罕見(jiàn)小的新月體，間質(zhì)基本正常；Ⅲ級(jí)表現(xiàn)為彌漫性系膜增殖和增寬(偶爾局灶節(jié)段)，偶見(jiàn)小新月體和粘連；局灶間質(zhì)水腫，偶爾細(xì)胞浸潤(rùn)，罕見(jiàn)小管萎縮；Ⅳ級(jí)表現(xiàn)為重度彌漫性系膜增生和硬化，部分或全部腎小球硬化，可見(jiàn)新月體(<40%)；小管萎縮，間質(zhì)浸潤(rùn)，可見(jiàn)間質(zhì)泡沫細(xì)胞；Ⅴ級(jí)表現(xiàn)為病變性質(zhì)類(lèi)似Ⅳ型，但更嚴(yán)重，腎小球新月體形成(>45%)；間質(zhì)類(lèi)似Ⅳ病變，但更嚴(yán)重。④按照腎小管間質(zhì)損害TlL程度分為4級(jí)，標(biāo)準(zhǔn)如下：Ⅰ級(jí)腎小管間質(zhì)基本正常，輕度腎小管變性擴(kuò)張；Ⅱ級(jí)小管萎縮、間質(zhì)纖維化范圍<20%，散在炎細(xì)胞浸潤(rùn)；Ⅲ級(jí)小管萎縮、間質(zhì)纖維化范圍30%～40%，散在和(或)彌漫炎細(xì)胞浸潤(rùn)；Ⅳ級(jí)：小管萎縮、間質(zhì)纖維化范圍>50%，散在和(或)彌漫炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

1.4方法

1.4.1主要試劑 小鼠抗人Podocalyxin單克隆抗體(美國(guó)Invitrogen 公司)；FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、牛血清白蛋白(BSA)、TritonX-100、PV-6000試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；碘化吡啶(PI，美國(guó)Sigma公司)；甘油(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.4.2免疫熒光法檢測(cè)尿中足細(xì)胞Podocalyxin表達(dá) 留取腎臟穿刺活檢當(dāng)日清潔晨尿100 mL，離心(1 500 r/min，5 min)，棄上清液；沉渣混勻，取20 μL涂片于相差顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)各類(lèi)細(xì)胞及管型，初步了解尿沉渣中有無(wú)單個(gè)核細(xì)胞；取600 μL沉渣置于自動(dòng)涂片離心機(jī)(Cytopro 7620)中，離心(1 200 r/min，5 min)，取出玻片，室溫干燥，4 ℃丙酮固定10 min，自然干燥；將干燥后的載玻片以PBS漂洗(3 min，3次)，置入Triton X-100浸泡5 min，PBS漂洗(3 min，3次)；牛血清白蛋白(BSA)封閉，室溫孵育30 min；滴加第一抗體小鼠抗人Podocalyxin單克隆抗體(1∶50稀釋)，4 ℃過(guò)夜；4 ℃冰箱拿出后在室溫下暖孵30 min；滴加第二抗體山羊抗小鼠抗體(FITC 1∶75稀釋)；37 ℃孵育30 min，孵育結(jié)束時(shí)不用PBS漂洗；復(fù)染細(xì)胞核，滴加碘化吡啶(PI)染核，室溫避光孵育5 min；PBS漂洗(3 min，3次)，50%甘油封片；采用雙盲法，在熒光顯微鏡下觀察(綠色熒光波長(zhǎng)580 nm，藍(lán)色熒光波長(zhǎng)510 nm)，每份標(biāo)本低倍鏡觀察全片，高倍確認(rèn)足細(xì)胞后攝像計(jì)算機(jī)儲(chǔ)存，選擇全片左上、左下、右上、右下、中間等位置20個(gè)高倍鏡視野，記錄完整的足細(xì)胞個(gè)數(shù)。

2結(jié)果

2.1尿脫落足細(xì)胞數(shù)量①按照蛋白尿程度分組：病例組尿脫落足細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組(每個(gè)高倍鏡下分別為5.334 8和0.300±0.674 9，P<0.05)；不同程度蛋白尿組之間也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。②按照腎功能不同分組：病例組尿脫落足細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組；隨著腎功能進(jìn)展，尿脫落足細(xì)胞數(shù)量也逐漸增多(表2)。③按照不同病理分型分組：病例組尿脫落足細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組；隨著病理改變加重，尿脫落足細(xì)胞數(shù)量也逐漸增多(表3)。④按照腎小管間質(zhì)損害分組：病例組尿脫落足細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組；腎小管間質(zhì)損害越重，尿脫落足細(xì)胞數(shù)量也越多(表4)。

表1 不同程度蛋白尿水平IgA腎病尿脫落足細(xì)胞數(shù)量的比較

與對(duì)照組相比，*P<0.05；與1組相比，▲P<0.05；與2組相比，☆P<0.05。

表2 不同腎功能IgA腎病尿脫落足細(xì)胞數(shù)量的比較

與對(duì)照組相比，*P<0.05；與1組相比，▲P<0.05；與2組相比，☆P<0.05。

表3 不同病理分級(jí)IgA腎病尿脫落足細(xì)胞數(shù)量的比較

與對(duì)照組相比，*P<0.05；與1組相比，▲P<0.05；與5組相比，☆P<0.05。

表4 不同腎小管間質(zhì)損害分級(jí)IgA腎病尿脫落足細(xì)胞數(shù)量的比較

與對(duì)照組相比，*P<0.05；與1組相比，▲P<0.05；與4組相比，☆P<0.05。

2.2脫落足細(xì)胞與腎臟病理的相關(guān)性分析尿脫落足細(xì)胞數(shù)量與endoI、MsHI 、MsMI之間無(wú)相關(guān)性(P分別為0.548、0.945、0.938)；與dGAI 、GCI、infI、TCI、(VCI、總評(píng)分之間均呈顯著的正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R分別為0.225(P=0.003)、0.325(P=0.001)、0.243(P=0.017)、0.335(P=0.001)、0.226(P=0.027)、0.409(P<0.001)。

2.3逐步線(xiàn)性回歸分析尿脫落足細(xì)胞線(xiàn)性回歸分析：24 h尿蛋白定量、收縮壓、舒張壓以及dGAI、TCI進(jìn)入回歸方程，回歸方程：尿脫落足細(xì)胞=3.520+1.070 24 h尿蛋白-0.065收縮壓+0.075舒張壓+0.316 dGAI+0.691 TCI。尿脫落足細(xì)胞與上述指標(biāo)有顯著的關(guān)系，可以顯著影響尿脫落足細(xì)胞數(shù)量(表5)。

表5 尿脫落足細(xì)胞線(xiàn)性回歸分析

3討論

IgA腎病(IgA nephropathy, IgAN)是以腎小球系膜細(xì)胞和(或)基質(zhì)增生、伴有系膜區(qū)IgA或者IgA為主的免疫復(fù)合物的顆粒狀沉積、電鏡下系膜區(qū)可見(jiàn)大量電子致密物沉積為特征的一類(lèi)腎小球疾病。既往研究多集中于系膜細(xì)胞在IgA腎病的腎小球硬化中的作用，但近來(lái)研究表明足細(xì)胞的損傷與IgA腎病之間有密切的聯(lián)系。足細(xì)胞除通過(guò)足突構(gòu)成分子屏障外，電荷屏障也是阻止白蛋白從腎小球?yàn)V過(guò)的重要機(jī)制。足細(xì)胞Podocalyxin蛋白正常表達(dá)可以保證腎小球?yàn)V過(guò)膜電荷屏障的完整性，其抗粘附作用可使足突裂隙隔膜得以維持[9]。

目前，公認(rèn)的IgA腎病預(yù)后不良的因素有大量蛋白尿、腎功能不全、發(fā)病時(shí)高血壓等，特別蛋白尿是影響IgA腎病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而足細(xì)胞的損傷常常與蛋白尿密切相關(guān)[10]。本研究結(jié)果提示，尿中Podocalyxin表達(dá)與蛋白尿程度呈正相關(guān)，這與NAKAMURA[11]研究慢性腎小球腎炎伴高膽固醇血癥患者尿蛋白定量與尿足細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)相一致。腎小球足細(xì)胞受損而導(dǎo)致足細(xì)胞數(shù)目的減少不僅可引起蛋白尿的發(fā)生，而且是腎小球硬化的始動(dòng)環(huán)節(jié)[12-13]。而YU等[14]研究表明，尿中足細(xì)胞可能在反映腎小球損傷方面較尿蛋白更為敏感，因此尿足細(xì)胞數(shù)量有助于判斷腎小球損傷程度及預(yù)后。

當(dāng)足細(xì)胞受到損傷后，細(xì)胞發(fā)生一系列的表型改變，早期表現(xiàn)為足突回縮、整個(gè)足突的消失，隨后出現(xiàn)足細(xì)胞胞體的縮小，假囊形成，陰離子電荷減少，最終從基底膜上分離剝脫到腎小囊中，這樣腎小球的濾過(guò)膜發(fā)生損傷，引起腎小球?yàn)V過(guò)率的改變，即濾過(guò)率下降。MACCONI等[15]對(duì)大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞數(shù)目的減少是足細(xì)胞功能缺陷和腎小球?yàn)V過(guò)功能障礙的決定因素。本研究發(fā)現(xiàn)，腎功能受損越嚴(yán)重，尿脫落足細(xì)胞數(shù)量越多，提示腎功能受損越嚴(yán)重，腎小球足細(xì)胞脫落越多，腎小球足細(xì)胞數(shù)量越少。研究表明，足細(xì)胞缺失與腎小球硬化的發(fā)生密切相關(guān)，當(dāng)足細(xì)胞數(shù)減少10%～20%時(shí)，腎小球硬化即開(kāi)始[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞數(shù)量與系膜細(xì)胞評(píng)分之間無(wú)相關(guān)，可能與腎小球系膜細(xì)胞損害無(wú)直接關(guān)聯(lián)。但是，尿中脫落足細(xì)胞數(shù)量與腎小球硬化評(píng)分、腎間質(zhì)評(píng)分及活動(dòng)性指標(biāo)dGAI、infI間呈正相關(guān)，推測(cè)尿中Podocalyxin表達(dá)可能提示存在活動(dòng)性病變。與慢性病變指標(biāo)GCI、TCI、VCI均呈正相關(guān)性，證實(shí)了足細(xì)胞脫落只有在腎小球硬化達(dá)到20%時(shí)才能脫落入尿中，推測(cè)尿中Podocalyxin表達(dá)存在腎小球硬化的基礎(chǔ)，可能是IgA腎病的進(jìn)展因素之一。既往有學(xué)者[17]發(fā)現(xiàn)，IgA腎病尿中足細(xì)胞數(shù)量與腎臟病理活動(dòng)性病變相關(guān)，連續(xù)監(jiān)測(cè)結(jié)果得出累計(jì)足細(xì)胞脫落量與病理慢性病變的加重相關(guān)，提示尿中足細(xì)胞作為一項(xiàng)無(wú)創(chuàng)指標(biāo)不僅能反映病理活動(dòng)性，也是疾病進(jìn)展因素之一。對(duì)IgA腎病患者長(zhǎng)期隨訪(fǎng)研究發(fā)現(xiàn)，尿足細(xì)胞持續(xù)陽(yáng)性者疾病持續(xù)進(jìn)展。

有研究表明，足細(xì)胞與蛋白尿、腎小球硬化及慢性腎損傷進(jìn)展密切相關(guān)，足細(xì)胞的減少及丟失已成為反映腎小球損傷嚴(yán)重程度和疾病進(jìn)展的重要觀測(cè)指標(biāo)[10]。腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化、高血壓、大量蛋白尿和腎功能損害是學(xué)術(shù)界意見(jiàn)比較一致的影響IgA腎病進(jìn)展的危險(xiǎn)因素。由于腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化是不可逆的損害，因此是預(yù)后不良強(qiáng)有力的危險(xiǎn)因素。本研究發(fā)現(xiàn)24 h尿蛋白定量、血壓、dGAI、TCI對(duì)尿脫落足細(xì)胞有顯著影響；根據(jù)病理指標(biāo)推測(cè)尿脫落足細(xì)胞不僅提示IgA腎病的活動(dòng)性病變，且與慢性基礎(chǔ)病變有一定關(guān)系，推測(cè)可能是IgA腎病進(jìn)展因素之一。

本研究樣本量有限，僅能發(fā)現(xiàn)尿脫落足細(xì)胞與臨床病理變化存在相關(guān)性。此外，本研究為橫斷面研究，未隨訪(fǎng)患者病情進(jìn)展情況，加入隨訪(fǎng)資料可能能更有力地說(shuō)明尿脫落足細(xì)胞可能是IgA腎病進(jìn)展因素之一。

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