紅花玉蘭嫩枝扦插生根的轉(zhuǎn)錄組和內(nèi)源激素變化分析

摘 要 為探究紅花玉蘭嫩枝扦插不定根發(fā)生的分子機(jī)制，利用1" 000 mg/L的萘乙酸（NAA）處理當(dāng)年生嫩枝進(jìn)行扦插，分別對(duì)新采回枝條及插穗生根過(guò)程中不同階段進(jìn)行取樣，開(kāi)展RNA-Seq與內(nèi)源激素水平分析。結(jié)果表明，（1）通過(guò)RNA-Seq總共組裝了186 303個(gè)Unigene，其中88 161條Unigene得到注釋，總注釋率達(dá)到了47.32%。通過(guò)差異表達(dá)基因分析可知，相較于新采回插穗的階段S0，在經(jīng)NAA處理6" h后的S1、根原基突破表皮的S2和不定根伸長(zhǎng)的S3階段上調(diào)表達(dá)基因分別有5 796、3 205和4 262個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因分別有3 795、5 248和6 305個(gè)；KEGG 富集分析顯示這些基因大多聚集于苯丙素生物合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝等通路中，其差異表達(dá)可能與紅花玉蘭的扦插生根密切相關(guān)。（2）內(nèi)源激素水平分析表明：與新采回插穗S0相比，S1階段插穗中IAA、ABA、GA3和CTKs（IP和Zeatin）濃度均顯著上升；在S2階段IAA和ABA濃度顯著降低，但I(xiàn)AA/ABA比值顯著升高，GA3和IP濃度升至最高且與其他階段相比差異顯著，而Zeatin變化不明顯；至不定根伸長(zhǎng)的S3階段IAA和ABA濃度顯著回升，而GA3和CTKs濃度則顯著下降。綜合分析表明，生長(zhǎng)素、脫落酸和細(xì)胞分裂素等內(nèi)源激素的動(dòng)態(tài)變化及其比值促進(jìn)了根原基形成和不定根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的差異表達(dá)與內(nèi)源激素水平的升降相一致，最終誘導(dǎo)紅花玉蘭嫩枝插條生根。

關(guān)鍵詞 紅花玉蘭；扦插生根；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；內(nèi)源激素；差異表達(dá)基因

紅花玉蘭（Magnolia wufengensis L.YMa et L.R.Wang）是近些年來(lái)在湖北省宜昌市五峰縣被發(fā)現(xiàn)的木蘭科（Magnoliaceae）木蘭屬（Magnolia）植物新種[1]，為高大落葉喬木。紅花玉蘭性狀原始，外形優(yōu)美，氣味芬芳，花朵大且顏色鮮艷，自然變異豐富，具有極高的觀賞與利用價(jià)值，被認(rèn)定為林木良種，是深受歡迎的園林綠化優(yōu)良樹(shù)種[2]。由于該物種的分布范圍有限，加之野生資源的過(guò)度采挖和生長(zhǎng)環(huán)境的嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致其數(shù)量急劇減少，目前已陷入瀕危狀態(tài)。近年來(lái)，對(duì)紅花玉蘭的研究主要集中在種質(zhì)資源保護(hù)與遺傳多樣性[3-4]、抗逆性[5-7]、扦插技術(shù)[8]以及花發(fā)育調(diào)控[9-11]等方面，而對(duì)該物種在扦插過(guò)程中的不定根發(fā)生機(jī)制還未見(jiàn)報(bào)道。紅花玉蘭的繁育周期較長(zhǎng)，目前常用的繁育手段主要為播種育苗和嫁接。然而，由于其種殼過(guò)于厚重，透水透氣性不佳，導(dǎo)致播種育苗過(guò)程中發(fā)芽率較低。此外萌發(fā)的幼苗對(duì)水分和光照反應(yīng)敏感，幼苗成活率不高[12]；同時(shí)由于種子雜合性高，實(shí)生苗往往不能保持優(yōu)良株系的特性，使其應(yīng)用及觀賞價(jià)值大打折扣。嫁接繁殖作為一種繁殖技術(shù)，其操作難度較高，同時(shí)在嫁接完成后對(duì)嫁接苗的管理看護(hù)條件也較為嚴(yán)格，導(dǎo)致成本投入較大，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模推廣。相較之下，扦插繁殖作為林木快速繁殖的理想技術(shù)，既可以解決因種子萌發(fā)困難以及后代實(shí)生苗變異大的問(wèn)題，維持優(yōu)良品種的遺傳性狀；也可以避免因嫁接等方式帶來(lái)的投入成本高、培育時(shí)間長(zhǎng)以及管理?xiàng)l件嚴(yán)苛等難題。

扦插再生過(guò)程，實(shí)際上是植物處于非生物脅迫狀態(tài)下的一種再生過(guò)程。扦插中再生不定根的過(guò)程概括為3個(gè)連續(xù)的階段[13]：第一階段，剛剛剪下的外植體會(huì)感知傷口和環(huán)境等上游信號(hào)；第二階段，這些上游信號(hào)會(huì)在葉肉、維管等細(xì)胞中指導(dǎo)生長(zhǎng)素的合成，隨后生長(zhǎng)素通過(guò)極性運(yùn)輸?shù)竭_(dá)傷口附近的形成層等干細(xì)胞；第三階段，傷口附近的形成層等干細(xì)胞在較高濃度的生長(zhǎng)素作用下進(jìn)行細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)變，從而形成不定根。不定根的發(fā)生是植物扦插再生過(guò)程中最關(guān)鍵的一步，但其機(jī)制目前還未被完全揭示。宣磊等[14]利用RNA-seq技術(shù)深入研究中山杉（Taxodium ‘Zhongshanshan’）不定根發(fā)育過(guò)程中SHR-SCR信號(hào)途徑的 "ThSHR3和 ThSHR1基因在中山杉扦插生根過(guò)程中的調(diào)控機(jī)理，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因的表達(dá)在不定根發(fā)生過(guò)程呈逐漸上升的趨勢(shì)，在根的生長(zhǎng)期表達(dá)量達(dá)到最高。杜小龍等[15]對(duì)不同生根階段的桑樹(shù)（Morus alba L.）硬枝扦插皮部生根的插穗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組測(cè)序，篩選鑒定出21個(gè)差異表達(dá)基因，其中多酚氧化酶（PPO）、生長(zhǎng)素酰胺水解酶（ILL）、肌氨酸氧化酶（SOX）編碼基因、馬鈴薯糖蛋白（Patatin）和脂肪氧合酶（LOX）這5個(gè)基因，在生根過(guò)程中持續(xù)上調(diào)表達(dá)，調(diào)控酚類物質(zhì)氧化與IAA合成、游離態(tài)IAA的釋放等，誘導(dǎo)不定根的發(fā)生。

植物激素與扦插生根息息相關(guān)，是生長(zhǎng)素、赤霉素、脫落酸等植物激素間相互作用的結(jié)果。其中，生長(zhǎng)素扮演著重要角色，調(diào)控植物不定根的發(fā)育。大量研究發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素對(duì)植物不定根的發(fā)生與伸長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)作用，使用外源生長(zhǎng)素處理插穗既能夠促進(jìn)根原始體的形成，也可以促進(jìn)不定根的伸長(zhǎng)，進(jìn)而提高插穗的成活率[16]。目前已經(jīng)報(bào)道了多個(gè)參與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因，如TIR1/AFB、Aux/IAA和ARF蛋白家族，能夠控制不定根的發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，植物對(duì)生長(zhǎng)素的感知是通過(guò)TIR1/AFB家族中的F-box蛋白與生長(zhǎng)素/吲哚乙酸（Aux/IAA）家族中的蛋白結(jié)合進(jìn)而導(dǎo)致其多泛素化和蛋白水解[17]，進(jìn)而解除其對(duì)生長(zhǎng)素反應(yīng)因子ARFs的抑制，開(kāi)啟生長(zhǎng)素下游信號(hào)的響應(yīng)。在擬南芥中，生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的 "SHY2/IAA3和 "SLR1/IAA14及 "MSG2/IAA19等基因會(huì)影響側(cè)根的生長(zhǎng)，而 "AUX1和SHR/SCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的 "NAC1等基因的過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)側(cè)根的發(fā)育[18]。脫落酸（ABA）在植物生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色，其響應(yīng)各種脅迫中的功能和信號(hào)通路已被廣泛研究，現(xiàn)在公認(rèn)ABA在植物適應(yīng)包括干旱、寒冷或高鹽在內(nèi)的環(huán)境脅迫中扮演重要角色，調(diào)控植物對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)和增強(qiáng)抗逆性[19-20]。植物在遭遇非生物脅迫時(shí)，其體內(nèi)ABA的含量變化最為劇烈，這種現(xiàn)象不僅調(diào)節(jié)了整個(gè)植物生命周期中的許多發(fā)育過(guò)程，還對(duì)種子成熟和休眠、種子萌發(fā)、營(yíng)養(yǎng)發(fā)育和衰老等方面產(chǎn)生了顯著影響[21]。張錦春等[22]測(cè)定沙生檉柳（Tamarix taklamakanensis M.T.Liu）扦插生根過(guò)程中的ABA含量，發(fā)現(xiàn)其整體呈升高后降低再升高的趨勢(shì)，前期升高以增強(qiáng)損傷脅迫的耐受性，中期含量維持較低水平有利于根原基形成，生根后ABA含量升高從而增強(qiáng)自身的抗性。赤霉素（GA）在扦插過(guò)程中同樣不可缺少，赤霉素濃度的高低與不定根誘導(dǎo)生成有著密切的關(guān)系[23]。DELLA蛋白在GA信號(hào)傳導(dǎo)途徑中作為負(fù)調(diào)控因子，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程進(jìn)行調(diào)節(jié)。此外，DELLA蛋白還具有協(xié)同整合其他植物激素和外部環(huán)境信號(hào)的功能，從而成為調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要樞紐蛋白。馮健[24]研究發(fā)現(xiàn)，落葉松[Larix gmelinii （Rupr.） Kuzen.]扦插生根過(guò)程中，通過(guò)降解DELLA蛋白，提升GA信號(hào)效應(yīng)來(lái)促進(jìn)不定根的發(fā)生。

本研究以紅花玉蘭不定根發(fā)生4個(gè)階段的插穗作為試驗(yàn)材料，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析其在不同生根時(shí)期的差異表達(dá)基因，結(jié)合內(nèi)源激素水平的動(dòng)態(tài)變化來(lái)探討紅花玉蘭扦插生根的分子基礎(chǔ)，為紅花玉蘭樹(shù)種資源保護(hù)和規(guī)模化繁育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在湖北省宜昌市五峰土家族自治縣選取健康無(wú)病蟲(chóng)害的4 a生紅花玉蘭實(shí)生苗作為采穗母樹(shù)，于2020年7月初剪取靠近頂部的當(dāng)年生枝條作為插穗。對(duì)新采回的枝條、外源激素1 000 mg/L NAA處理6 h后、扦插15 d和35 d的插穗進(jìn)行取樣，分別命名為S0、S1、S2和S3，每個(gè)樣品重復(fù)3次，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和內(nèi)源激素含量測(cè)定。樣品立即置于液氮中進(jìn)行快速冷凍，并在 "-80 ℃下保存，備用。

1.2 扦插方法

在清晨進(jìn)行插穗制備時(shí)，選擇長(zhǎng)8～12 cm的枝條，保留1～2個(gè)節(jié)和上部1～2個(gè)葉片，并確保切口平滑；完成消毒后，將插穗浸泡于萘乙酸NAA溶液中6 h，同時(shí)以清水處理為對(duì)照組。扦插深度應(yīng)控制在3～5" cm；每個(gè)處理梯度扦插200株插穗，重復(fù)3次[25]。

扦插基質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)土（丹麥品氏泥炭土）∶河沙（1∶2）混合攪拌，消毒后于智能連棟溫室內(nèi)備用。

插后管理：通過(guò)噴霧和濕簾裝置保證溫室內(nèi)空氣相對(duì)濕度在80%～95%，溫度在25 ℃～ "30 ℃；控制基質(zhì)含水量在50％～60％。每隔 "15 d噴施0.3%的磷酸二氫鉀。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

選取不同階段的紅花玉蘭插穗樣本送往北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所需的RNA提取、建庫(kù)均在公司完成，采用高通量測(cè)序（Illumina）進(jìn)行測(cè)序分析。利用DESeq2（1.20.0）軟件篩選紅花玉蘭4個(gè)階段下表達(dá)水平顯著差異的基因，以|log2FC|≥1且P≤0.05作為篩選條件和判定標(biāo)準(zhǔn)，分別對(duì)比S1時(shí)期與S0時(shí)期、S2時(shí)期與S0時(shí)期和S3時(shí)期與S0時(shí)期的紅花玉蘭插穗之間的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出與扦插生根相關(guān)的差異表達(dá)基因（DEGs）；對(duì)DEGs進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路分析，在GO富集分析中，認(rèn)為 "P-valuelt;0.05為顯著富集項(xiàng)；在KEGG富集分析中認(rèn)為Corrected P-value lt; 0.05的 pathway為顯著富集項(xiàng)；使用Excel 2016進(jìn)行繪圖。

1.4 內(nèi)源激素檢測(cè)

使用串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定紅花玉蘭扦插生根過(guò)程中4個(gè)時(shí)期插穗材料的內(nèi)源激素，主要檢測(cè)激素為IAA、GA3、ABA、異戊烯基腺嘌呤（IP）與玉米素（Zeatin），每個(gè)樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析

2.1.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及功能注釋 表1為紅花玉蘭插穗4個(gè)時(shí)期材料的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果?？傆行A基為80.55 Gb，總有效序列為536" 965 374。除S2_3外，余下組別滿足Q20的序列全部超過(guò)98%。測(cè)定序列中的鳥(niǎo)嘌呤（G）和胞嘧啶（C）核苷酸的GC含量為45.97%～47.06%。使用Trinity程序組裝clean reads轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)后，拼接得到Unigenes的數(shù)量為186 303。將得到的Unigenes在七大數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行注釋，至少有一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)注釋成功的Unigenes數(shù)目有88161，占全部Unigenes的47.32%；而在所有數(shù)據(jù)庫(kù)中均成功注釋的Unigenes有5 557個(gè)，占全部Unigene的2.98%（表2）。

2.1.2 差異表達(dá)基因分析 采用DESeq[26]進(jìn)行分析，篩選閾值為padjlt;0.05，結(jié)果見(jiàn)圖1。與S0相比，紅花玉蘭扦插生根S1、S2和S3階段轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析獲得的差異表達(dá)基因數(shù)分別為9 591、8 453、10 567；差異上調(diào)表達(dá)基因分別有5 796、 "3 205、4 262；差異下調(diào)表達(dá)基因分別有3 795、 "5 248、6 305。通過(guò)維恩分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)比S1 vs S0和S2 vs S0，共有1 883個(gè)差異表達(dá)基因；S1 vs S0與S3 vs S0之間存在2 315個(gè)共有的差異表達(dá)基因；而S3 vs S0與S2 vs S0之間則有3 867個(gè)相同的差異表達(dá)基因。綜合3組數(shù)據(jù)，共有 "1 035個(gè)差異表達(dá)基因（圖2）。

2.1.3 差異表達(dá)基因的 GO 功能分析 對(duì)紅花玉蘭插穗不同時(shí)期樣本的1 035個(gè)差異基因進(jìn)行了GO功能分析，發(fā)現(xiàn)共有的6個(gè)GO功能類別（圖3）。在全部4個(gè)時(shí)期中，最顯著富集的GO功能類別位于分子功能方面（Molecular function，MF），其中具體功能是氧化還原酶活性（GO：0016491）。此外，在MF方面還包含了葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性（GO：0046527）和鈣調(diào)蛋白結(jié)合（GO：0005516）等功能。在生物過(guò)程方面（Biological process，BP），最顯著富集的GO功能類別是磷酸化（GO：0016310）。此外，BP還包括單機(jī)體碳水化合物（GO：0044723）和多糖生物合成過(guò)程等（GO：0033692）。這些GO功能類別的富集提示，在紅花玉蘭扦插生根過(guò)程中，這些特定功能可能發(fā)揮著重要的作用。這些發(fā)現(xiàn)有助于更深入地理解紅花玉蘭扦插生根的分子機(jī)制，為紅花玉蘭的分子育種提供了有價(jià)值的研究?jī)?nèi)容。

2.1.4 差異表達(dá)基因的 KEGG 通路分析 對(duì)紅花玉蘭插穗不同時(shí)期的差異基因KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)在S1時(shí)期相比S0時(shí)期之間存在757個(gè)差異基因，這些基因被映射到了前20個(gè)KEGG通路中（表3）；經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在S2時(shí)期相比S0時(shí)期之間存在639個(gè)差異基因，這些基因被歸屬于KEGG前20個(gè)通路中（表4）；有803個(gè)基因在S3時(shí)期相比S0時(shí)期的差異基因中被富集到KEGG前20個(gè)通路中（表5）。這些通路包括輔助因子和維生素代謝、氨基酸代謝、萜類化合物和聚酮類化合物的代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、脂類代謝和其他次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成等7個(gè)類別的代謝途徑。植物體內(nèi)合成細(xì)胞壁與根導(dǎo)管細(xì)胞結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵成分之一是木質(zhì)素，苯丙素生物合成與植物體內(nèi)木質(zhì)素生物合成之間聯(lián)系密切。因此，在不定根伸長(zhǎng)S3時(shí)期相比S0時(shí)期的差異基因中，參與苯丙素生物合成的基因數(shù)量最多。分別對(duì)2個(gè)不同時(shí)期的差異基因進(jìn)行了KEGG富集分析，富集到的通路集中在淀粉與糖代謝（Starch and sucrose metabolism）以及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Plant hormone signal transduction）中，因此可以推斷這2個(gè)通路與紅花玉蘭扦插生根之間存在較為密切的關(guān)聯(lián)。

在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，參與多種植物激素穩(wěn)態(tài)與代謝通路調(diào)節(jié)的基因包括GID1、IAA、DELLA、NPR1、PYL和ABF等轉(zhuǎn)錄因子。富集分析結(jié)果顯示，這些DEGs中的一部分參與了生長(zhǎng)素（IAA）合成途徑、赤霉素（GA）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和脫落酸（ABA）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

2.2 內(nèi)源激素含量檢測(cè)

2.2.1 紅花玉蘭扦插生根過(guò)程中激素含量的變化 在紅花玉蘭插穗生根過(guò)程的初始階段（S1），經(jīng)過(guò)NAA處理過(guò)的插穗中內(nèi)源激素IAA和ABA含量顯著高于未處理的新鮮插穗（S0）（圖4-A、4-C），此時(shí)ABA濃度在4個(gè)階段中最高，可能與其在脫離母體時(shí)所遭受的逆境脅迫有關(guān)。到根原基形成階段（S2），IAA和ABA的變化趨勢(shì)十分相似，呈現(xiàn)出顯著的持續(xù)性下降趨勢(shì)，反映了低水平的IAA和ABA對(duì)根原基形成具有促進(jìn)作用。與S2階段相比，在不定根伸長(zhǎng)階段（S3）IAA和ABA含量顯著升高，但仍顯著低于S0和S1階段，反映不定根的伸長(zhǎng)需要生長(zhǎng)素的促進(jìn)，在較高的ABA濃度下，對(duì)不定根伸長(zhǎng)的抑制作用相對(duì)較低，而對(duì)根原基形成的影響更為顯著。在S1和S0階段，IAA/ABA值并未表現(xiàn)出顯著差異。然而，在根原基形成階段（S2），IAA/ABA值顯著升高并達(dá)到頂峰；而在不定根伸長(zhǎng)時(shí)期（S3），盡管IAA/ABA值顯著降低，但仍高于S1階段的水平（圖4-E）。反映ABA與IAA之間可能存在著動(dòng)態(tài)平衡，較高的IAA/ABA比值對(duì)紅花玉蘭扦插生根過(guò)程中的根原基形成和不定根伸長(zhǎng)生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。

在紅花玉蘭整個(gè)扦插生根過(guò)程中，GA3的濃度相較于其他內(nèi)源激素來(lái)說(shuō)明顯降低（圖4-B）。經(jīng)過(guò)NAA處理后S1階段和根原基形成的S2階段分別與其相鄰的前一階段相比，GA3的含量均顯著上升，并于根原基形成后達(dá)到最高，而后在不定根伸長(zhǎng)階段（S3）逐漸下降到與初始階段相近，表明較高水平GA3含量對(duì)根原基的形成有促進(jìn)作用，而不定根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)對(duì)GA3的需求有所降低。此外，Zeatin的含量較低，僅0.06～0.13" "ng/g（圖4-F），而IP含量變化較大。與S0階段相比，S1時(shí)期IP濃度無(wú)明顯差別，在根原基形成的S2階段IP含量急劇上升至最高，不定根伸長(zhǎng)的S3階段插穗內(nèi)IP濃度顯著降至最低水平（圖4-D）。反映較高濃度的細(xì)胞分裂素可以促進(jìn)根原基的形成，而在不定根伸長(zhǎng)階段則需要維持在較低水平。

2.2.2 扦插生根相關(guān)差異基因的篩選 結(jié)合插穗不同時(shí)期樣本中內(nèi)源激素水平的變化和DEGs的KEGG分析，選擇3個(gè)可能參與調(diào)控紅花玉蘭扦插生根的差異表達(dá)基因（表6）。它們分別為Cluster-53.109833（生長(zhǎng)素早期響應(yīng)基因AUX/IAA，圖5-A）、Cluster-53.31619（ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)上游受體蛋白基因PYL，圖5-B）和Cluster- "53.95403（GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控蛋白基因DELLA，圖5-C）。

3 討" 論

扦插繁殖是木本植物最重要的一種無(wú)性繁殖方法。植物在扦插繁殖過(guò)程中其不定根的發(fā)生是由一系列十分復(fù)雜的與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因共同作用的結(jié)果。通過(guò)解剖和生理生化的研究發(fā)現(xiàn)，紅花玉蘭扦插過(guò)程中不定根的發(fā)育是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，有皮部生根和愈傷組織生根兩種[27]。為了進(jìn)一步發(fā)掘紅花玉蘭扦插過(guò)程中不定根的發(fā)生機(jī)制，本研究對(duì)其嫩枝扦插生根過(guò)程中的差異表達(dá)基因及內(nèi)源激素的動(dòng)態(tài)變化開(kāi)展 "研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的差異基因數(shù)量始終位于前3位。TIR1/AFBs-Aux/IAAs-ARFs核內(nèi)信號(hào)通路是經(jīng)典的生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)錄信號(hào)通路，通過(guò)降解與生長(zhǎng)素響應(yīng)因子ARF相互作用的AUX/IAA轉(zhuǎn)錄抑制子來(lái)啟動(dòng)下游生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[28-30]。蘇江等[31]研究發(fā)現(xiàn)，AUX/IAA家族相關(guān)基因與 "TIR1基因過(guò)量表達(dá)可以增加馬尾松不定根的產(chǎn)生數(shù)量，調(diào)控馬尾松不定根的生長(zhǎng)。Lakehal等[32]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)Aux/IAA基因（ "IAA6、 "IAA9和 "IAA17），在生長(zhǎng)素存在的情況下，生長(zhǎng)素受體TIR1和受體蛋白AFB2與 IAA6、 IAA9和 IAA17形成特異性傳感復(fù)合物，以控制不定根的啟動(dòng)。張煥欣等[33]研究發(fā)現(xiàn)IAA生物合成的限速酶編碼基因 OsYUCCA1和生長(zhǎng)素輸出載體蛋白At ABCB19在辣椒不定根發(fā)生的誘導(dǎo)期和啟動(dòng)期表達(dá)量顯著提高。本研究中AUX/IAA在不定根發(fā)生階段顯著上調(diào)表達(dá)，參與調(diào)控IAA合成基因的表達(dá)以及生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸，提升生長(zhǎng)素響應(yīng)從而促進(jìn)細(xì)胞的分裂與分化，進(jìn)而誘導(dǎo)根原基的形成。許多研究證明脫落酸與根的發(fā)育聯(lián)系密切，常被認(rèn)為是根系生長(zhǎng)的抑制因子。在南京椴（Tilia miqueliana Maxim.）嫩枝扦插生根過(guò)程中，高含量ABA對(duì)不定根的發(fā)育產(chǎn)生抑制，此外IAA、ABA具有相互協(xié)調(diào)作用，IAA/ABA比值可作為衡量扦插生根能力的指標(biāo)[34]。邢璐[35]研究發(fā)現(xiàn)脫落酸的受體蛋白PYL8和PYL9可以與轉(zhuǎn)錄因子MYB相互作用，由于該轉(zhuǎn)錄因子是生長(zhǎng)素信號(hào)通路的一部分，所以PYL蛋白可能通過(guò)MYB影響了生長(zhǎng)素信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)了兩種植物激素的交互影響，從而調(diào)控?cái)M南芥的側(cè)根生長(zhǎng)。王青等[36]研究發(fā)現(xiàn)麻楝（Chukrasia tabularis" A.Juss.）扦插生根進(jìn)程中ABA含量變化趨勢(shì)為先升高后降低，因此低濃度ABA有利于插穗生根與生長(zhǎng)。在ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，PYL蛋白作為ABA的上游受體蛋白，正調(diào)控ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[37]。本研究中，PYL基因在根原基形成和不定根伸長(zhǎng)階段均下調(diào)表達(dá)，推測(cè)該基因可能通過(guò)正調(diào)控ABA信號(hào)，降低插穗中ABA濃度，減弱其對(duì)生根的抑制作用。赤霉素（GA3）參與調(diào)控植物側(cè)根發(fā)育主根生長(zhǎng)等發(fā)育過(guò)程，高水平GA通過(guò)加速DELLA降解來(lái)抑制黃酮醇的合成，而黃酮醇的含量與生長(zhǎng)素含量呈負(fù)相關(guān)，赤霉素通過(guò)調(diào)節(jié)黃酮醇的含量改變根尖中生長(zhǎng)素含量，從而影響根的生長(zhǎng)[38]。Simone等[39]研究發(fā)現(xiàn)，番茄的自然遺傳變異Rg1可以提高根和芽的形成，該等位基因還能夠逆轉(zhuǎn)DELLA突變體pro中低水平的體外根和芽形成。DELLA基因是GA3信號(hào)負(fù)調(diào)控因子[40]。本研究中，DELLA基因在根原基形成期（S2）顯著下調(diào)，而GA3含量在此階段顯著升高，可能在這一過(guò)程中解除了DELLA蛋白對(duì)赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的阻遏，從而滿足根原基形成階段對(duì)赤霉素的需求。

綜上，通過(guò)對(duì)紅花玉蘭扦插生根過(guò)程中4個(gè)階段的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和內(nèi)源激素分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源植物激素在扦插生根過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化以及與其相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的差異表達(dá)，促進(jìn)了紅花玉蘭插穗根原基的形成與不定根的生長(zhǎng)。本研究初步探索紅花玉蘭嫩枝扦插生根的分子調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步解決其扦插繁殖難題奠定了理論基礎(chǔ)，也為解析紅花玉蘭扦插不定根發(fā)生的分子機(jī)制和其他近源樹(shù)種的研究提供參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn) Reference：

［1］ 馬履一，王羅榮，賀隨超，等.中國(guó)木蘭科木蘭屬一新種（英文）[J].植物研究，2006（1）：5-8.

MA L Y，WANG L R，HE S CH，et al.Anew variety of Magnolia （Magnoliaceae） from Hubei，China[J].Bulletin of Botanical Research，2006（1）：5-8.

[2]馬雨晶.國(guó)家林草局發(fā)布2020年度林木良種名錄[J].林業(yè)科技通訊，2021，582（6）：27.

MA Y J.National forestry and grass" administration releases the 2020" list of" improved tree species[J].Forest Science and Technology，2021，582（6）：27.

[3]賀隨超，馬履一，陳發(fā)菊.紅花玉蘭種質(zhì)資源遺傳多樣性初探[J].西北植物學(xué)報(bào)，2007（12）：2421-2428.

HE S C，MA L Y，CHEN F J.Genetic diversity of Magnolia wufengensis based on AFLP[J].Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，2007（12）：2421-2428.

[4]CHEN L Y，CHEN F J，HE S C，et a1.High genetic diversity and small genetic variation among populations of Magnolia wufengensis （Magnoliaceae），revealed by ISSR and SRAP markers[J].Electronic Journal of Biotechnology，2014，17（6）：268-274.

[5]梁大偉，馬履一，賈忠奎，等.自然降溫對(duì)紅花玉蘭抗寒生理指標(biāo)的影響[J].林業(yè)科技開(kāi)發(fā)，2010，24（2）：23-26.

LIANG D W，MA L Y，JIA ZH" K，et al. Study on the influences of naturel cooling on the cold tolerance physiological indicators of Magnolia wufengensis[J].Journal of Forestry Engineering，2010，24（2）：23-26.

[6]王延雙，方 文，王欣彤，等.水淹脅迫對(duì)紅花玉蘭苗木生長(zhǎng)和生理生化特性的影響[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，42（1）：35-45.

WANG Y SH，F(xiàn)ANG W，WANG X T，et al.Effects of waterlogging stress on growth，physiological and piochemistry characteristics of Magnolia wufengensis[J].Journal of Beijing Forestry University，2020，42（1）：35-45.

[7]桑子陽(yáng)，馬履一，陳發(fā)菊.干旱脅迫對(duì)紅花玉蘭幼苗生長(zhǎng)和生理特性的影響[J].西北植物學(xué)報(bào)，2011，31（1）：109-115.

SANG Z Y，MA L Y，CHEN F J.Growth and physiological characteristics of Magnolia" wufengensis seedlings under drought stress[J].Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，2011，31（1）：109-115.

[8]王 藝，賈忠奎，馬履一，等.4種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)紅花玉蘭嫩枝扦插生根的影響[J].林業(yè)科學(xué)，2019，55（7）：35-45.

WANG Y，JIA ZH" K，MA L Y，et al.Effects of four plant growth regulators on rooting of the softwood cutting of Magnolia wufengensis[J].Scientia Silvae Sinicae，2019，55（7）：35-45.

[9]陳麗園，桑子陽(yáng)，陳發(fā)菊，等.紅花玉蘭大小孢子發(fā)生及雌雄配子體發(fā)育的研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，44（9）：181-185.

CHEN L Y，SANG Z Y，CHEN F J，et al.Sporogenesis and gametophytes development of Magnolia wufengensis[J].Journal of Northwest A amp; F University（Natural Science Edition），2016，44（9）：181-185.[ZK）]

[10] WU W，CHEN F，JING D.et al.Isolation and Characterization of an AGAMOUS-Like Gene from Magnolia wufengensis （Magnoliaceae） [J].Plant Molecular Biology Reporter，2012，30（3）：690-698.

[11]JING D，LIU Z，ZHANG B，et al.Two ancestral APETALA3 homologs from the basal angiosperm Manolia wufengensis （Magnoliaceae） can affect flower development of Arabidopsis[J].Gene：An International Journal Focusing on Gene Cloning and Gene Structure and Function，2014，537：100-107.

[12]王羅榮，馬履一，王希群，等.紅花玉蘭播種育苗技術(shù)的初步研究[J].浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)，2007（2）：242-246.

WANG L R，MA L Y，WANG X Q，et al.Seedling techniques of Magnolia wufengensis and M.wufengensis var.multitepala[J].Journal of Zhejiang A amp; F University，2007（2）：242-246.

[13]許智宏，張憲省，蘇英華，等.植物細(xì)胞全能性和再生[J].中國(guó)科學(xué)：生命科學(xué)，2019，49（10）：1282-1300.

XU ZH" H，ZHANG X SH，SU Y H，et al.Plant cell totipotency and regeneration[J].Scientia Sinica（Vitae），2019，49（10）：1282-1300.

[14]宣 磊，王芝權(quán)，殷云龍，等.中山杉406 "ThSHR3基因的克隆、表達(dá)及蛋白互作研究[J].林業(yè)科學(xué)研究，2021，34（4）：32-39.

XUAN L，WANG ZH" Q，YIN Y L，et al.Cloning，expression and protein-protein interaction of" "ThSHR3" gene from Taxodium zhongshanense 406[J].Forest Research，2021，34（4）：32-39.

[15]杜小龍，曹 旭，劉 利，等.轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析鑒定桑樹(shù)硬枝扦插皮部生根相關(guān)功能基因[J].蠶業(yè)科學(xué)，2017，43（3）：374-381.

DU X L，CAO X，LIU L，et al.Identification of functional genes related to cortex rooting on Mulberry hardwood cuttings transcriptome-proteome correlation analysis[J].Acta Sericologica Sinica，2017，43（3）：374-381.

[16]李煥勇，劉 濤，張華新，等.植物扦插生根機(jī)理研究進(jìn)展[J].世界林業(yè)研究，2014，27（1）：23-28.

LI H Y，LIU T，ZHANG H X，et al.Research progress in rooting mechanism of plant cuttings[J].World Forestry Research，2014，27（1）：23-28.

[17]BLAZQUEZ A M，NELSON C D，WEIJERS D.Evolution of plant" hormone response pathways[J].Annual Review of Plant Biology，2020，71（1）：23-28.

[18]GE L，CHEN H，JIANG J F，et al.Overexpression of OsRAA1 causes pleiotropic phenotypes in transgenic rice plants，including altered leaf，flower，and root development and root response to gravity[J].Plant Physiology，2004，135（3）：1502-13.

[19]黎 家，李傳友.新中國(guó)成立70年來(lái)植物激素研究進(jìn)展[J].中國(guó)科學(xué)：生命科學(xué)，2019，49（10）：1227-1281.

LI J，LI CH" Y.Seventy-year major research progress in plant hormones by Chinese scholars[J].Scientia Sinica（Vitae），2019，49（10）：1227-1281.

[20]ZHU J.Abiotic stress signaling and responses in" plants[J].Cell，2016，167（2）：313-324.

[21]GONG Z，XIONG L，SHI H，et al.Plant abiotic stress response and nutrient use efficiency[J].Science China（Life Sciences），2020，63（5）：635-674.

[22]張錦春，劉有軍，王方琳，等.沙生檉柳扦插生根過(guò)程插穗相關(guān)理化特征分析[J].西北植物學(xué)報(bào)，2018，38（3）：484-492.

ZHANG J CH，LIU Y J，WANG F L，et al.Physiological and biochemical characteristics of Tamarix taklamakanensis cuttings during rooting stages[J].Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，2018，38（3）：484-492.

[23]陳佳寶，閆道良，鄭炳松.植物不定根誘導(dǎo)生成機(jī)制研究進(jìn)展[J].北方園藝，2021（6）：129-137.

CHEN J B，YAN D L，ZHENG B S.Research progress of the mechanism on adventitious root induction in plants[J].Northern Horticulture，2021（6）：129-137.

[24]馮 健.日本落葉松×長(zhǎng)白落葉松無(wú)性系間生根差異的分子機(jī)制[D].北京：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院，2008.

FENG J.Molecular mechanism of different rooting capacity between two clones of" Larix leptolrpis×Larix olgensis[D].Beijing：Chinese Academy of Forestry Sciences，2008.

[25]向旭初.紅花玉蘭扦插生根機(jī)制及其分子基礎(chǔ)研究[D]. 湖北宜昌：三峽大學(xué)，2023.

XIANG X CH.Study on the rooting of the softwood cutting" mechanism and" molecular basis of Magnolia wufengensis[D].Yichang Hubei：China Three Gorges University，2023.

[26]SIMON A，WOLFGANG H.Differential expression analysis for sequence count data[J].Genome Biology，2010，11（10）：1-12.

[27]梁玉婷，夏文勝，王 樸，等.紅花玉蘭硬枝扦插生根解剖結(jié)構(gòu)及酶生理響應(yīng)研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，60（20）：94-99.

LIANG Y T，XIA W SH，WANG P，et al.Study on rooting anatomical structure and enzyme physiological response of hardwood cuttings of Magnolia wufengensis[J].Hubei Agricultural Sciences，2021，60（20）：94-99.

[28]LI S，XUE L，XU S，et al.Mediators，genes and signaling in adventitious rooting[J].Botanical Review，2009，75（2）：230-247.

[29]ENDIAN Y，HEYUE Y，CHUNMEI L，et al.Genome-wide identification and expression analysis of the Aux/IAA gene family of the drumstick tree （Moringa oleifera Lam.） reveals regulatory effects on shoot regeneration[J].International Journal of Molecular Sciences，2022，23（24）：15729-15744.

[30]MANI S D，SOEUN H，NATHAN S，et al.The AFB1 auxin receptor controls the cytoplasmic auxin response pathway in Arabidopsis thaliana[J].Molecular plant，2023，16（7）：1120-1130.

[31]蘇 江，郭天瑋，季孔庶.馬尾松Aux/IAA家族相關(guān)基因克隆及初步分析[J].分子植物育種，2015，13（8）：1822-1830.

SU J，GUO T W，JI K ZH.Cloning and premilinary analysis of" Aux/IAA" family genes from Pinus massoniana[J].Molecular Plant Breeding，2015，13（8）：1822-1830.

[32]LAKEHAL A，CHAABOUNI S，CAVEL E，et al.A" molecular" framework for the control of adventitious rooting by TIR1/AFB2-Aux/IAA-Dependent" auxin signaling in Arabidopsis[J].Molecular Plant，2019，12（11）：1499-1514.

[33]張煥欣，董春娟，尚慶茂.辣椒下胚軸不定根發(fā)生相關(guān)差異表達(dá)基因分析[J].植物生理學(xué)報(bào)，2017，53（8）：1553-1568.

ZHANG H X，DONG CH J，SHANG Q M.Differential expression analysis of genes involved in adventitious rooting from pepper （Capsicum annuum） hypocotyl cuttings[J].Plant Physiology Journal，2017，53（8）：1553-1568.

[34]史鋒厚，趙 瑞，羅 帥，等.南京椴嫩枝扦插生根過(guò)程中植物激素的變化[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，39（2）：21-26.

SHI" F H，ZHAO R，LUO SH，et al.Study on plant hormone changes in soft cuttings of Tilia miqueliana during rooting[J].Journal of Central South University of Forestry amp; Technology，2019，39（2）：21-26.

[35]邢 璐.植物激素脫落酸的受體蛋白PYL8和PYL9通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子MYB家族成員調(diào)控?cái)M南芥的側(cè)根生長(zhǎng)[D].北京：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)，2016.

XING" L.ABA receptors PYL8 and PYL9 regulate" plant" lateral root growth via MYB transcription" factors[D].Beijing：University of Science and Technology of China，2016.

[36]王 青，張 捷，仲崇祿，等.麻楝扦插生根進(jìn)程中內(nèi)源激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的變化[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，40（4）：111-119.

WANG Q，ZHANG J，ZHONG CH L，et al.Variation of endogenesis hormone and nutritive matter concentration in Chukrasia tabularis cuttings during rooting[J].Journal of Central South University of Forestry amp; Technology，2020，40（4）：111-119.

[37]KIM H，HWANG H，HONG J W，et al.A rice orthologue of the ABA receptor，OsPYL/RCAR5，is a positive regulator of the ABA signal transduction pathway in seed germination and early seedling growth[J].Journal of Experimental Botany，2012，63（2）：1013-1024.

[38]TAN H，MAN C，XIE Y，et al. A crucial role of GA-regulated flavonol biosynthesis in root growth of Arabidopsis[J].Molecular Plant，2019，12（4）：521-537.

[39]SIMONE L，MARIANA A S D，F(xiàn)ERREIRA F G S E，et al. The tomato （Solanum lycopersicum cv.Micro-Tom） natural genetic variation Rg1 and the DELLA mutant procera control the competence necessary to form adventitious roots and shoots[J].Journal of experimental botany，2012，63（15）：5689-5703.

[40]周 鵬，李錢峰，熊 敏，等.DELLA蛋白介導(dǎo)的激素互作調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育研究進(jìn)展[J].植物生理學(xué)報(bào)，2020， "56（4）：661-671.

ZHOU P，LI Q F，XIONG M，et al.Advances in DELLA protein-mediated phytohormonal crosstalk in regulation of plant growth and development[J].Plant Physiology Journal，2020，56（4）：661-671.

Analysis of Transcriptome and Endogenous Hormone Changes in" Rooting Process of Shoot Cuttings of Magnolia wufengensis

Abstract To explore the molecular mechanism underlying adventitious rooting in softwood cuttings of Magnolia wufengensis，1 000 mg/L naphthalene acetic acid （NAA） was used to treat softwood cuttings from the current" year’s new growth.The cuttings were sampled were collected at different stages during rooting process of newly collected branches and cuttings.RNA-Seq and endogenous hormone levels were analyzed.The results showed that a total of 186 303 unigenes were assembled with RNA-Seq，and 88" 161 of them were annotated，with an annotation rate of 47.32%.Based on the analysis of differentially expressed genes，significant differences in gene expression were observed between the newly harvested cuttings （referred to as stage S0） and the cuttings at stages S1，S2，and S3.In particular，5 796，3 205 and 4 262 genes were up-regulated and 3 795，5 248 and 6 305 genes were down-regulated in the cuttings at stage S1 （after 6 hours of treatment with NAA），stage S2 （i.e.，root primordium formation phase） and stage S3 （i.e.，adventitious root elongation phase），respectively.KEGG enrichment analysis showed that most of these genes were clustered in pathways such as phenylpropanoid biosynthesis，plant hormone signal transduction，starch and sucrose metabolism.The differential expression of these genes might be closely related to the rooting in the cuttings of Magnolia wufengensis.The analysis of endogenous hormone levels revealed that the concentrations of IAA，ABA，GA3 and CTKs （IP and Zeatin） in the cutting sample at stage S1 were significantly higher than those in the cutting sample at stage S0.At stage S2，the concentrations of IAA and ABA decreased significantly，but the ratio of IAA/ABA increased significantly.Furthermore，at stage S2，the concentrations of GA3 and IP increased and were significantly higher than those at other stages，but the change of Zeatin was not evident.At stage S3，the concentrations of IAA and ABA increased significantly，while the concentrations of GA3 and CTKs decreased significantly.The comprehensive analysis showed that the dynamic changes in endogenous hormones such as auxin，abscisic acid and cytokinin and in their ratios promote the formation of the root primordium and the elongation of adventitious roots.The differential expression of genes related to plant hormone signal transduction is consistent with the change of endogenous hormone levels，finally promoting the rooting of the softwood cuttings of Magnolia wufengensis.

Key words Magnolia wufengensis;Cuttage rooting;RNA-Seq; Endogenous hormone;Differentially expressed genes