梨火疫病菌拮抗菌株組合的親和力及其防病效果測(cè)定

摘 要 為獲得對(duì)梨火疫病菌（Erwinia amylovora）抑菌活性高、防病效果好的拮抗菌組合，以實(shí)驗(yàn)室前期從香梨酵素液中分離初篩出的E. amylovora拮抗細(xì)菌菌株為材料，采用對(duì)峙培養(yǎng)法檢測(cè)菌株之間的親和性，打孔-抑菌圈法測(cè)定復(fù)配組合菌株的抑菌活性。對(duì)篩選出相容性良好，對(duì)E. amylovora抑菌作用強(qiáng)的拮抗細(xì)菌組合通過噴施香梨離體花序和盆栽杜梨苗評(píng)價(jià)其對(duì)梨火疫病的防病效果。結(jié)果顯示：篩選出相容性良好的3個(gè)拮抗細(xì)菌組合FX1-FJ20、FX74-FN12和FX70-FX43，其復(fù)配比例為1∶1的組合菌體發(fā)酵液和組合除菌發(fā)酵液的抑菌率均達(dá)到83%以上，明顯高于單一菌株。3個(gè)拮抗細(xì)菌組合菌體發(fā)酵液和組合除菌發(fā)酵液對(duì)香梨花腐的3～7 d的平均預(yù)防型防效分別為56.26%～73.16%和72.02～82.66%；對(duì)杜梨苗的7～15 d的預(yù)防型防效分別為67.38%～77.73%和71.78%～80.11%，治療型防效分別為64.53%～75.01%和 "69.09%～79.03%。組合菌的防效均較單個(gè)菌株提高，組合菌除菌發(fā)酵液的防效優(yōu)于組合菌菌體發(fā)酵液，預(yù)防型防效優(yōu)于治療型防效。綜合防效試驗(yàn)結(jié)果可見，拮抗菌組合FX74-FN12的防效最佳，其菌體發(fā)酵液和除菌發(fā)酵液對(duì)香梨花腐3～7 d的預(yù)防型防效分別為73.16%、82.66%，比單菌株的平均防效分別增加12.90%和22.40%；對(duì)杜梨苗的7～15 d的平均預(yù)防型和治療型防效分別達(dá)到75.00%和79.00%以上，比單菌株的平均防效分別增加15.12%和11.02%，對(duì)梨火疫病具有較好的生防潛力。

關(guān)鍵詞 梨火疫病菌；拮抗菌組合；相容性；抑菌活性；防效

由解淀粉歐文氏菌（Erwinia amylovora）引起的梨火疫病是新入侵我國(guó)、危害薔薇科仁果類果樹最具毀滅性的細(xì)菌病害，被列為國(guó)際重大檢疫性有害生物和我國(guó)一類農(nóng)作物病害[1]。該病害現(xiàn)已在新疆與甘肅65個(gè)縣、市（區(qū)）發(fā)生危害[2-3]，對(duì)全國(guó)林果業(yè)生產(chǎn)帶來巨大威脅和風(fēng)險(xiǎn)。

化學(xué)藥劑防治是梨火疫病防治的重要手段。農(nóng)用鏈霉素曾經(jīng)是梨火疫病防治的最佳藥劑，但它的普遍使用所導(dǎo)致的病原菌抗藥性菌系的產(chǎn)生及對(duì)人類健康安全和環(huán)境安全的隱患，已被禁止和限制大田施用[4]。目前，我國(guó)針對(duì)梨火疫病的專用登記藥劑的種類較為有限[5]，研發(fā)出新型的高效殺菌劑，采取有效措施阻斷梨火疫病的進(jìn)一步傳播擴(kuò)散，是保障林果安全生產(chǎn)的重大需求。近年來國(guó)內(nèi)外研究者利用拮抗微生物防治梨火疫病方面開展了一些工作，取得較好進(jìn)展，成為病害防治新的發(fā)展方向。有報(bào)道從果樹內(nèi)生菌、附生菌、土壤微生物中篩選拮抗菌，從植物提取物中提取抗菌成分用于梨火疫病的生物防治，涉及的生防微生物種類有熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）[6]、草生歐文氏菌（E. herbicola）[7]、解淀粉歐文氏菌無毒菌系[8]、酵母菌和E. amylovora的特異性噬菌體[9]等。國(guó)內(nèi)在梨火疫病的生物防治所開展的研究工作尚處于起步階段[10-11]，目前尚無登記的梨火疫病專用生防菌劑。

有研究發(fā)現(xiàn)，在植物病害生防中采用單一菌株，在田間應(yīng)用存在菌株定殖性能不佳、適應(yīng)力不強(qiáng)，易受環(huán)境條件的影響，防效不穩(wěn)定等問題；而將親和性良好的生防菌株二元或多元復(fù)配使用，可以產(chǎn)生協(xié)同增效的作用，能提高生防微生物防治的廣度及防效的穩(wěn)定性[12]。本研究以分離、篩選出的梨火疫病菌拮抗菌株為材料，測(cè)定拮抗細(xì)菌菌株之間親和性，篩選出菌株間親和力好、抑菌活性高的組合，明確其對(duì)梨火疫病的防治效果，為創(chuàng)制和應(yīng)用優(yōu)良的梨火疫病生防菌劑，安全防控病害、保障產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試病原菌 梨火疫病菌：E. amylovora 001菌株，庫爾勒香梨分離物，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存，致病力測(cè)定為強(qiáng)致病力的菌株。

1.1.2 供試拮抗菌菌株 以實(shí)驗(yàn)室前期從香梨酵素液分離細(xì)菌中通過平板對(duì)峙試驗(yàn)初篩出的對(duì)E. amylovora具有明顯的抑菌圈，或在與病原菌對(duì)峙培養(yǎng)平板上表現(xiàn)出競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快，能迅速覆蓋病原菌菌落的6個(gè)菌株作為待選組合生防潛力菌株，分別是FX1（Bacillus" velezensis）、FJ20（B." sp.）、FX74（B.amyloliquefaciens）、FN12（B.velezensis）、FX70（B. sp.）、FX43（B." sp.）。

1.1.3 培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基：蛋白胨10.00 ""g/L、瓊脂粉18.00 g/L、蔗糖5.00 g/L、氯化鈉5.00 g/L、牛肉膏3.00 g/L、蒸餾水 "1 000.00 mL。NB培養(yǎng)基：蛋白胨10.00 ""g/L、蔗糖5.00 g/L、氯化鈉5.00 g/L、牛肉膏3.00 g/L、蒸餾水 "1 000.00 mL。

1.2 拮抗菌株間的親和性測(cè)定

1.2.1 E.amylovora菌液的制備 在NA培養(yǎng)基中活化E.amylovora 001菌株，挑取單菌落接入NB培養(yǎng)液中，在28 ℃、150 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)24～48 h至菌液OD600nm＝0.8～1.0，8 000" "r/min離心3 min，收集菌體用無菌水稀釋至濃度約為1×107 cfu/mL的菌懸液。

1.2.2 拮抗細(xì)菌單菌株發(fā)酵液、除菌發(fā)酵液的制備 將拮抗菌株在NA平板上活化后，用接種環(huán)移取一環(huán)接入裝有50 mL NB培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，置于28 ℃、180" "r/min的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)12 h，獲得種子液。在NB培養(yǎng)液中按1%接種量接種拮抗細(xì)菌種子液，在28 ℃、180" "r/min的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)至發(fā)酵液OD600nm為 "0.8～1.0，稀釋至108 cfu/mL，備用。將發(fā)酵液在 "4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min去除菌體，上清液用微孔濾膜（d=0.22 μm）過濾除菌，得到除菌發(fā)酵液。

1.2.3 拮抗細(xì)菌單菌株發(fā)酵液、除菌發(fā)酵液對(duì)梨火疫病菌的抑菌活性測(cè)定 采用打孔—抑菌圈法測(cè)定拮抗菌的抑菌活性。將100 μL的梨火疫病菌（E. amylovora）菌液涂布于NA培養(yǎng)基上，用滅菌打孔器在涂菌培養(yǎng)基平板均勻打3個(gè)孔，分別在每孔中加入拮抗菌發(fā)酵液、除菌發(fā)酵液200 μL，以等量的無菌培養(yǎng)液為對(duì)照，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后采用十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑大小，計(jì)算抑菌率[13]。

抑菌率=[（處理組抑菌圈直徑-對(duì)照組抑菌圈直徑）/處理組抑菌圈直徑]×100%

1.2.4 拮抗細(xì)菌不同菌株之間親和性的測(cè)定 采用對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定拮抗細(xì)菌不同菌株之間親和性。取一個(gè)拮抗細(xì)菌菌株的新鮮發(fā)酵液100 μL均勻涂布于NA培養(yǎng)基上作為被測(cè)菌株，將無菌濾紙片（d=6 mm）放至在涂菌平板上，每皿2片，每個(gè)濾紙片滴加5 μL的另一個(gè)待測(cè)拮抗細(xì)菌的發(fā)酵液，以加入5 μL NB培養(yǎng)液的處理作為對(duì)照，各菌株均作為測(cè)試菌株和被測(cè)菌株交叉測(cè)試，每個(gè)處理重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察兩菌株間是否有抑菌圈，篩選出不產(chǎn)生抑菌圈，親和性良好的菌株組合。

1.3 拮抗細(xì)菌菌株組合抑菌活性的測(cè)定

1.3.1 拮抗細(xì)菌組合菌體發(fā)酵液、組合除菌發(fā)酵液的制備 在滅菌NB培養(yǎng)液中按1∶1比例加入拮抗細(xì)菌混合種子液，在28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600nm約為0.8～1.0，獲得拮抗細(xì)菌組合菌體發(fā)酵液。將組合菌體發(fā)酵液在 "4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min去除菌體，上清液用微孔濾膜（d=0.22 μm）過濾除菌，得到組合除菌發(fā)酵液，備用。

1.3.2 拮抗菌組合菌體發(fā)酵液、組合除菌發(fā)酵液對(duì)梨火疫病菌的抑菌活性測(cè)定 方法與“1.2.3”中單一拮抗菌株發(fā)酵液、除菌發(fā)酵液抑菌活性測(cè)定方法相似，在涂布E. amylovora菌液的培養(yǎng)基平板的打孔中（d=6 mm）加入200 μL的拮抗菌組合菌體發(fā)酵液、組合除菌發(fā)酵液，觀察產(chǎn)生的抑菌圈并測(cè)定其直徑。

1.4 拮抗菌組合對(duì)梨火疫病的防效測(cè)定

1.4.1 拮抗細(xì)菌組合菌體發(fā)酵液及組合除菌發(fā)酵液接種液的制備 按照“1.3.1”制備拮抗細(xì)菌組合菌體發(fā)酵液和組合除菌發(fā)酵液接種液。

1.4.2 香梨離體花序防效測(cè)定

在新疆庫爾勒市香梨園健康梨樹上采集初花期花枝插入3%蔗糖溶液中，待花苞全部綻放時(shí)用手持壓力噴霧器將待測(cè)拮抗菌單菌發(fā)酵液、單菌除菌發(fā)酵液，組合菌發(fā)酵液和組合除菌發(fā)酵液噴霧接種至花序全部潤(rùn)濕，每個(gè)處理接種50朵，重復(fù)3次；以噴施農(nóng)用鏈霉素（華北制藥廠生產(chǎn)，有效成分72%）4 000倍液為對(duì)照，同時(shí)設(shè)置無菌水代替拮抗菌發(fā)酵液（除菌發(fā)酵液）的對(duì)照，在25 ℃、75%空氣濕度的人工氣候箱中培養(yǎng)24 h后噴霧接種梨火疫病菌菌液。將接種后的花序置于人工氣候箱中25 ℃、75%空氣濕度繼續(xù)培養(yǎng)，3 d、4 d和5 d后定時(shí)觀察記錄發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)花腐率并計(jì)算防效。試驗(yàn)結(jié)束后將發(fā)病植株材料干熱滅菌后銷毀。

花腐率=病花數(shù)/總花數(shù)×100%

花腐防效=[（噴施無菌水對(duì)照組花腐率-處理組花腐率）/噴施無菌水對(duì)照組花腐率]×100%

1.4.3 盆栽杜梨苗防效測(cè)定 在庫爾勒市巴州農(nóng)科所日光試驗(yàn)溫室開展試驗(yàn)，以2 a生盆栽杜梨盆栽苗10～25 cm的新生幼嫩枝條為接種材料。

預(yù)防型防效試驗(yàn)：用手持壓力式噴霧器將拮抗菌發(fā)酵液、除菌發(fā)酵液噴霧接種盆栽杜梨苗，噴霧至杜梨苗全部濕潤(rùn)，每個(gè)處理噴施10～15個(gè)杜梨枝條，重復(fù)3次。同時(shí)設(shè)噴施農(nóng)用鏈霉素（72% WP，華北制藥廠）4 000倍液為對(duì)照，以無菌水噴霧為空白對(duì)照。接種后的杜梨苗放入搭建好的覆蓋塑料膜的保濕棚中， "48 h后再噴霧接種梨火疫病菌菌液，繼續(xù)在25 ℃～30 ℃、相對(duì)濕度75%以上，自然光照下的保濕棚中培養(yǎng)。待發(fā)病后掀開塑料膜，每天觀察發(fā)病情況，記錄發(fā)病枝條數(shù)，計(jì)算病情指數(shù)，統(tǒng)計(jì)防效。

治療型防效試驗(yàn)：與預(yù)防型試驗(yàn)接種順序相反，即先在杜梨苗上噴施接種病原菌液48 h后，再噴施拮抗菌發(fā)酵液、除菌發(fā)酵液，培養(yǎng)條件及防效調(diào)查方法等均與預(yù)防性試驗(yàn)一致。

盆栽杜梨苗梨火疫病的病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[7]： "0級(jí)，枝條無病斑；Ⅰ級(jí)，枝條病斑長(zhǎng)度占接種枝條長(zhǎng)度的1/3；Ⅲ級(jí)，枝條病斑長(zhǎng)度占接種枝條長(zhǎng)度的1/3～2/3；Ⅴ級(jí)，枝條病斑長(zhǎng)度占接種枝條的2/3。依據(jù)病情指數(shù)計(jì)算試驗(yàn)各處理的防效。

發(fā)病率=發(fā)病枝條數(shù)/接種總枝條數(shù)×100%

病情指數(shù)=[∑（各級(jí)發(fā)病枝條數(shù)×病級(jí)代表值）/（接種總枝條數(shù)×最高級(jí)值）]×100

枝枯防效=[（噴施無菌水對(duì)照組病情指數(shù)-噴施拮抗菌處理組病情指數(shù)）/噴施無菌水對(duì)照組病情指數(shù)]×100%

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Microsoft Excel整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件和Duncan氏新復(fù)極差法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌單一菌株對(duì)梨火疫病菌的抑制作用

供試拮抗細(xì)菌單一菌株對(duì)梨火疫病原菌的抑菌作用測(cè)定結(jié)果如表1所示，6個(gè)拮抗細(xì)菌菌株對(duì)梨火疫病菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，發(fā)酵液的抑菌圈大小為27.35 mm±0.85 mm～33.04 mm±" 0.39 mm，抑菌率均達(dá)到78%以上；除菌發(fā)酵液的抑菌圈大小為29.05 mm±0.76 mm～ "33.44 mm±0.84 mm，抑菌率達(dá)79%以上，其中FX1、FJ20、FX70和FX43還具有生長(zhǎng)速度快、競(jìng)爭(zhēng)能力強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，在與梨火疫病菌共培養(yǎng)的培養(yǎng)基平板上能在24 h迅速覆蓋病原菌菌落。

2.2 不同拮抗細(xì)菌菌株間的相容性

分別將不同拮抗菌株進(jìn)行交叉試驗(yàn)，測(cè)定菌株之間的親和性。結(jié)果顯示（圖1），菌株FX1與FJ20、FX74與FN12、FX70與FX43在平板上分別作為測(cè)試菌株和被測(cè)菌株共培養(yǎng)時(shí)，菌株之間均不產(chǎn)生抑菌圈，表明菌株間相容性好；而其他組合菌株（FX1與FN12、FX1與FX70、FX74與FX1、FN12與FX1、FX74與FX70、FX74與FJ20、FX1與FX43、FJ20與FX70、FJ20與FX43、FX74與FX43、FJ20與FN12、FN12與FX70、FN12與FX43）共培養(yǎng)時(shí)均產(chǎn)生抑菌圈，表明菌株間相互抑制生長(zhǎng)，菌株之間不相容。因此，選用相容性好的三個(gè)拮抗菌組合，分別命名為FX1-FJ20、FX74-FN12和FX70-FX43開展后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 拮抗細(xì)菌組合對(duì)梨火疫病菌的抑菌作用

對(duì)相容性良好3個(gè)拮抗菌組合測(cè)定其對(duì)梨火疫病菌的抑菌活性。結(jié)果表明（表2），拮抗菌組合FX74-FN12、FX1-FJ20、FX70-FX43的抑菌活性都較單一菌株提高，組合菌發(fā)酵液和組合菌除菌發(fā)酵液抑菌率分別為84.05%、83.84%、 "83.49%和84.21%、84.61%、84.06%，其中FX74-FN12組合的抑菌率最高。

2.4 拮抗細(xì)菌組合對(duì)梨火疫病的防效

將篩選出的對(duì)梨火疫病菌具有較強(qiáng)抑菌作用的3個(gè)拮抗菌組合FX1-FJ20、FX74-FN12、FX70-FX43及單菌FX1、FJ20、FX74、FN12、FX70、FX43的菌體發(fā)酵液、除菌發(fā)酵液，通過香梨離體花序、盆栽杜梨苗接種，測(cè)定、比較其對(duì)病害的防治效果。

2.4.1 對(duì)香梨花序的預(yù)防型防效 在離體香梨花序上噴施拮抗菌組合菌和單個(gè)菌株的發(fā)酵液及除菌發(fā)酵液，再接種梨火疫病菌，測(cè)定其預(yù)防型防效，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。未噴施拮抗菌菌液的對(duì)照，在接種病原菌后第2天香梨花序的花藥、柱頭、蜜腺、花萼、子房、花柄等處陸續(xù)開始出現(xiàn)深褐色、萎蔫和壞死的花腐癥狀，而預(yù)先噴施拮抗菌的處理能明顯延緩花腐癥狀出現(xiàn)的時(shí)間，降低花腐率。拮抗菌組合發(fā)酵液、組合除菌發(fā)酵液對(duì)香梨花腐防效分別為FX74-FN12（73.16%、 "82.66%）、FX1-FJ20（59.37%、72.02%）、FX70-FX43（56.26%、73.43%），而單一拮抗菌株發(fā)酵液、除菌發(fā)酵液的防效分別為FX74（65.03%、69.36%）、FN12（55.49%、67.07%）、FX1 "（51.05、67.85%）、FJ20（43.88%、62.50%）、FX70（56.61%、68.56%）、FX43（48.64%、 "59.32%），拮抗菌組合的防效顯著優(yōu)于單一菌株，組合菌除菌發(fā)酵液的防效顯著優(yōu)于組合菌發(fā)酵液。FX74-FN12組合菌發(fā)酵液、組合除菌發(fā)酵液的防效最高，比2個(gè)單菌株的平均防效有較大幅度提高，分別增加12.90%和22.40%；其次是FX1-FJ20組合菌發(fā)酵液、組合菌除菌發(fā)酵液，比2個(gè)單菌株的平均防效分別增加11.91%和 "6.85%；再次是FX70-FX43組合菌發(fā)酵液、組合菌除菌發(fā)酵液比2個(gè)單菌株的平均防效分別增加3.64%和9.49%。

2.4.2 對(duì)杜梨苗梨火疫病的預(yù)防型和治療型防治效果 預(yù)防型防效試驗(yàn)結(jié)果顯示（表4），在杜梨苗上預(yù)先噴施拮抗菌組合、單個(gè)菌株的發(fā)酵液及除菌發(fā)酵液能明顯降低嫩枝的枝枯率，減輕病情指數(shù)（Plt;0.05），具有明顯的保護(hù)效果，不同處理之間差異顯著。拮抗菌組合發(fā)酵液和組合除菌發(fā)酵液的7～15 d平均預(yù)防型防效分別為FX74-FN12（77.73%、80.11%）、FX1-FJ20（76.06%、77.73%）、FX70-FX43（67.38%、71.78%），而單一拮抗菌株發(fā)酵液和除菌發(fā)酵液的7～15 d平均預(yù)防型防效分別為FX74（67.26%、72.09%）、FN12（56.87%、66.91%）、FX1（65.36%、 "70.06%）、FJ20（56.54%、60.59%）、FX70 "（61.46%、65.86%）和FX43（54.02%、 "55.79%），拮抗菌組合防效較單一拮抗菌株的平均防效分別增加FX74-FN12 "（15.11%、 "12.41%）、FX1-FJ20（15.66%、10.61%）、FX70-FX43 （9.46%、 10.96%）。

治療型試驗(yàn)結(jié)果表明（表5），各處理對(duì)杜梨苗梨火疫病具有一定的治療效果。拮抗菌組合發(fā)酵液和組合菌除菌發(fā)酵液的7～15 d平均治療型防效分別為FX74-FN12（75.01%、79.03%）、FX1-FJ20（72.63%、75.10%）、FX70-FX43 "（64.53%、69.04%），而單一拮抗菌株發(fā)酵液和除菌發(fā)酵液的7～15 d平均治療型防效分別為FX74（64.06%、69.49%）、FN12（55.25%、 "64.71%）、FX1（59.84%、67.32%）、FJ20 "（51.65%、57.92%）、FX70（59.64%、62.67%）和FX43（50.99%、53.11%），拮抗菌組合發(fā)酵液和組合除菌發(fā)酵液的防效較單一拮抗菌株的平均防效分別增加了FX74-FN12（15.23%、9.62%）、FX1-FJ20（16.89%、12.48%）、FX70-FX43 "（9.10%、11.15%）。

綜合預(yù)防和治療防效的試驗(yàn)結(jié)果，3個(gè)拮抗菌組合的防效均比單個(gè)菌株明顯提高，組合除菌發(fā)酵液的防效顯著優(yōu)于組合菌發(fā)酵液的防效，預(yù)防型防效較治療型防效更佳。其中FX74-FN12組合的防效最好，其組合發(fā)酵液、組合除菌發(fā)酵液的預(yù)防型和治療型防效分別在75%以上和79%以上；其次是FX1-FJ20組合，其組合發(fā)酵液、組合除菌發(fā)酵液的預(yù)防型和治療型防效分別在72%以上和75%以上；再次是FX70-FX43，其組合發(fā)酵液、組合除菌發(fā)酵液的預(yù)防型和治療型防效分別在64%以上和69%以上。

3 討" 論

目前，對(duì)于植物病害生防菌的研究主要集中在單個(gè)菌株，多菌株組合復(fù)配對(duì)生防效果的影響研究較少。篩選不同類型、不同作用機(jī)制、不同營(yíng)養(yǎng)需求、不同環(huán)境適應(yīng)性的多功能生防潛力菌株，通過菌株的二元或多元復(fù)配，利用不同菌株在時(shí)間、空間和生理上的互補(bǔ)、協(xié)同及互惠互生作用，構(gòu)建研制高效廣譜的復(fù)合菌劑，能克服單菌株功效的局限性和在環(huán)境中的不穩(wěn)定性，增強(qiáng)其防病效果，因而更具有應(yīng)用價(jià)值[14]。有研究表明，組合菌株的合理選擇對(duì)于發(fā)揮其防病功效，提高生防效果至關(guān)重要。組合復(fù)配的生防細(xì)菌菌株間的親和性良好，能提高對(duì)病害的防治效果；但菌株間存在拮抗性則影響其穩(wěn)定性，反而會(huì)降低防病效果[15]。本研究中所采用的6個(gè)供試菌株FX74、FN12、FX1、FJ20、FX70和FX43其發(fā)酵液、除菌發(fā)酵液在平板對(duì)峙試驗(yàn)中均表現(xiàn)出對(duì)梨火疫病菌較強(qiáng)的抑菌作用，除菌發(fā)酵液產(chǎn)生的抑菌圈大于發(fā)酵液，表明其胞外代謝產(chǎn)物中的抑菌物質(zhì)具有較強(qiáng)的抑菌活性；同時(shí)FX1、FJ20、FX70和FX43菌株還具有營(yíng)養(yǎng)的競(jìng)爭(zhēng)能力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快的特性，形成的菌苔能迅速占據(jù)空間，快速覆蓋病原菌。本研究將這些具有不同抗菌機(jī)制的菌株通過相容性測(cè)定，從中篩選出相容性良好拮抗菌組合FX1-FJ20、FX74-FN12、FX70-FX43。將3個(gè)拮抗菌組合按照1∶1的比例復(fù)配，測(cè)定結(jié)果表明對(duì)梨火疫病菌的抑菌活性較單個(gè)菌株均有明顯增強(qiáng)。李恩琛等[16]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生防細(xì)菌的不同組合、不同比例復(fù)配對(duì)蘋果樹腐爛病菌的抑制效果不同，當(dāng)親和性菌株組合B1與FS-1206以2∶1復(fù)配時(shí)，其發(fā)酵液抑菌率達(dá)86.64%，抑菌效果顯著優(yōu)于單一生防細(xì)菌及其他復(fù)配組合。本研究篩選出的拮抗細(xì)菌組合，僅測(cè)定了1∶1的比例復(fù)配的抑菌活性，在后續(xù)工作中還需對(duì)組合菌株不同配比發(fā)酵對(duì)菌體生長(zhǎng)速度、活菌數(shù)量和抑菌物質(zhì)的產(chǎn)量及抑菌活性和防病效果的影響等研究還有待在后續(xù)工作中開展。

本研究采用對(duì)梨火疫高度感病的香梨花序和杜梨苗（香梨砧木）作為接種材料，通過噴霧接種拮抗菌組合發(fā)酵液菌和除菌發(fā)酵液，測(cè)定、評(píng)價(jià)對(duì)梨火疫病的防病效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，噴施3個(gè)拮抗細(xì)菌組合發(fā)酵液和組合菌除菌發(fā)酵液對(duì)梨火疫病菌侵染造成的香梨花腐、杜梨苗枝枯均具有較好的防病效果，拮抗細(xì)菌組合的防效顯著優(yōu)于單一菌株，組合菌除菌發(fā)酵液的防效顯著優(yōu)于組合菌發(fā)酵液。綜合香梨花序和杜梨苗防效的試驗(yàn)結(jié)果，F(xiàn)X74-FN12組合的防效最佳，對(duì)梨火疫病香梨花腐的預(yù)防型防效，對(duì)杜梨苗梨火疫病的預(yù)防型和治療型防效都能達(dá)到73%以上，組合除菌發(fā)酵液的防效更優(yōu)。其次是FX1-FJ20和FX70-FX43組合，也表現(xiàn)出較好的防病效果。李國(guó)等[17]將2株均能產(chǎn)生脂肽類抗生素的拮抗細(xì)菌特基拉芽孢桿菌C-9和鞘氨醇桿菌A1混合復(fù)配，提高了對(duì)棉花黃萎病菌的抑制能力和防病效果。分析其原因是2株菌混合提高了生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)性，能相互促進(jìn)、相互利用，化解在發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對(duì)活菌的反饋抑制現(xiàn)象，從而增強(qiáng)菌株的代謝活力，促進(jìn)了抑菌性物質(zhì)的產(chǎn)生。本研究中的拮抗菌組合，F(xiàn)X74-FN12組合中的2個(gè)菌株的抑菌作用均是通過產(chǎn)生胞外抑菌物質(zhì)，F(xiàn)X1-FJ20和FX70-FX43組合中的菌株除產(chǎn)生胞外抑菌物質(zhì)外，同時(shí)具有競(jìng)爭(zhēng)性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，組合后都產(chǎn)生優(yōu)于單個(gè)菌株的防病效果。其組合復(fù)配是否增加活菌濃度，提升了抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生量、活性及穩(wěn)定性還有待分析。因此，不同或相似作用機(jī)制的拮抗菌組合復(fù)配使用時(shí)，其防病作用不是簡(jiǎn)單的累加，而是具有一定的協(xié)同增效作用。本研究結(jié)果與陳志誼等[18]及藍(lán)星杰等[19]的研究結(jié)果相似。

本研究對(duì)篩選出的3個(gè)拮抗菌組合，通過室內(nèi)試驗(yàn)測(cè)定對(duì)梨火疫病菌的抑制作用及其防病效果，組合菌株在植株上定殖性能、田間防效及穩(wěn)定性等都需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證，為梨火疫病生防潛力菌株的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供參考。

參考文獻(xiàn) Reference：

［1］ MANSFIELD J，GENIN S，MAGORI S，et al.Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology[J].Molecular Plant Pathology，2012，13（6）：614-629.

[2]黃 偉，盛 強(qiáng)，羅 明，等.新疆庫爾勒香梨火疫病的發(fā)生特點(diǎn)及防控建議[J].植物保護(hù)，2022，48（6）：207-213.

HUANG W，SHENG Q，LUO M，et al.Occurrences status of fire blight on Korla fragrant pear in Xinjiang and the control proposala[J].Plant Protection，2022，48（6）：207-213.

[3]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳關(guān)于印發(fā)《全國(guó)農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物分布行政區(qū)名錄》的通知[EB/OL].（2021-10-21）[2022-05-28].http：//www.moa.gov.cn/nybgb/2021/202105/202110/t202110216380164.htm.

Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Prc.Notice of the General" Office of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs on Printing and Distributing the National" List of Administrative Regions Where" Agricultural" Plant" Quarantine" Pests are Distributed[EB/OL].（2021-10-21）[2022-05-28].http：//www.moa.gov.cn/nybgb/2021/202105/202110/t202110216380164.htm.

[4]王泓力，王 巖，吳曰福，等.12種殺菌劑對(duì)杜梨苗梨火疫病的預(yù)防與治療效果測(cè)定[J].植物保護(hù)，2022，48（6）：111-117.

WANG H L，WANG Y，WU Y F，et al.Prevention and control efficacies of 12 bactericides on fire blight of Pyrrus betulifolia seedlings[J].Plant Protection，2022，48（6）：111-117.

[5]中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng).農(nóng)藥登記數(shù)據(jù)[DB/OL].[2022-06-22].http：//www.chinapesticide.org.cn/hysj/index.Jhtm.

China Pesticide" Information Network.Pesticide Registration Data[DB/OL].[2022-06-22].http：//www.chinapesticide.org.cn/hysj/index.Jhtm.

[6]CABREFIGA J，BONATERRA A，MONTESINOS E.Mechanisms of antagonism of" Pseudomonas fluorescens EPS62e against Erwinia amylovora，the causal agent of fire blight[J].International Microbiology，2007，10（2）：123-132.

[7]VANNESTE J L，YU J，BEER S V.Role of antibiotic production by Erwinia herbicola Eh252 in biological control of Erwinia amylovora[J].Journal of Bacteriology，1992，174（9）：2785-2796.

[8]THARAUD M，LAURENT J，F(xiàn)AIZE M，et al.Fire blight protection with avirulent mutants of Erwinia amylovora[J].Microbiology，1997，143（2）：625-632.

[9]GILLJ，SVIRCEV A M，SMITH R，et al.Bacteriophages of Erwinia amylovora[J].Applied Microbiology，2003，69（4）：2133-2138.[ZK）]

[10] 賀 旭，韓 劍，盛 強(qiáng)，等.梨火疫病拮抗細(xì)菌FX1及其抑菌物質(zhì)的防病作用[J].園藝學(xué)報(bào)，2023，50（5）：1118-1129.

HE X，HAN J，SHENG" Q，et al.Screening of antagonistic bacterium FX1 against Erwinia amylovora and its control effect of the antibacterial substances on fire blight[J]. "Acta Horticulturae Sinica，2023，50（5）：1118-1129.

[11]徐琳赟，古麗孜熱·曼合木提，韓 劍，等.香梨內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選及對(duì)梨火疫病的生防潛力[J].西北植物學(xué)報(bào)，2021，41（1）：132-141.

XU L Y，GU LI ZI RE·M H M T，HAN J，et al.Screening of endophytic antagonistic bacteria from ‘Kuerlexiangli’ pear and their biocontrol potential against fire blight disease[J].Acta Botanica Boreali-Occidentalis Sinica，2021，41（1）：132-141.

[12]朱海霞，馬永強(qiáng)，盧 蒙，等.不同生防放線菌組合防治枯、黃萎病研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，37（7）：152-156.

ZHU H X，MA Y Q，LU M，et al.Control effect of combining biocontrol strains against Fusarium Oxysporium "f.sp.niveum and Verticillium dahliae[J].Journal of Northwest A ＆ F University（Natural Science Edition），2009，37（7）：152-156.

[13]韋文添，關(guān) 明.幾種藥劑對(duì)柑桔潰瘍病菌的毒力和防治效果[J].廣西農(nóng)學(xué)報(bào)，2017，32（1）：21-24.

WEI W T，GUAN M.Potency and prevention ＆ cure effect：fungicides to kill Botryosphaeria dothidea of citrus[J].Journal of Guangxi Agriculture，2017，32（1）：21-24.

[14]BRION K，DUFFY B，ANDREW B，et al.Combination of Trichoderma koningii with" fluorescent" Pseudomonads for control of take-all on wheat[J].Phytopathology，1996，86（2）：188-194.

[15]BOER M，BOM P，KINDT F，et al. Control of Fusarium wilt of radish by combining Pseudomonas putida strains that have different disease-suppressive mechanisms[J].Phytopathology，2003，93（5）：626-632.

[16]李恩琛，張樹武，徐秉良，等.3株生防細(xì)菌間親和性測(cè)定及其對(duì)蘋果樹腐爛病菌的抑制作用[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，55（5）：94-100.

LI E CH，ZHANG SH W，XU B L，et al.Determination of affinity among three biocontrol bacteria and their inhibitory effect on Valsa mali[J].Journal of Gansu Agricultural University，2020，55（5）：94-100.

[17]李 國(guó)，趙 輝，劉元元，等.多元混菌培養(yǎng)對(duì)棉花黃萎菌拮抗效果的研究[J].中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2018，34（3）：431-439.

LI G，ZHAO H，LIU Y Y，et al.Antagonistic effect of the mixed bacteria culture on Verticillium dahlia[J].Chinese Journal of Biological Control，2018，34（3）：431-439.

[18]陳志誼，劉郵洲，劉永鋒，等.拮抗細(xì)菌菌株之間的互作關(guān)系及其對(duì)生物防治效果的影響[J].植物病理學(xué)報(bào)，2005，35（6）：539-544.

CHEN ZH Y，LIU Y ZH，LIU Y F，et al.Compatibility between antagonistic bacterial strains and biocontrol efficacy by different bacterial combinations against Fusarium wilt of vegetables[J].Acta Phytopathologica Sinica，2005，35（6）：539-544.

[19]藍(lán)星杰，甘 良，劉繼紅，等.SC11生防菌劑及其不同復(fù)配對(duì)西瓜和茄子防病促生作用[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015， "24（12）：117-124.

LAN X J，GAN L，LIU J H，et al.Effects of SC11 combined with other biocontrol agents on disease control and growth promotion in watermelon and eggplant[J].Acta Agriculture Boreali-occidentalis Sinica，2015，24（12）：117-124.

Determination of" Affinity for Combination of Antagonistic Bacteria against

Fire Blight Pathogen Erwinia amylovora and Their Biocontrol Effect

Abstract In the pursuit ofantagonistic bacterial combinations exhhibiting high inhibitory activity and efficacious disease prevention effect against Erwinia amylovora， strains isolated from the the fragrant pear enzyme solution at the early stage in the laboratory were used as materials.The affinity between these strains was assessed via plate confrontation culture， while their combined inhibitive activity were measured using punching-inhibition circle method. The antagonistic bacterial combination demonstrating substantial affinity and potent inhibition of" E.amylovora were identified and further evaluated through in vitro spraying fragrant inflorescence and potted Birchleaf Pear seedlings. The results showed that combinations FX1-FJ20， FX74-FN12 and FX70-FX43， exhibited affinity and achieved inhibition rates more than 83% in both combined strains fermentation broth and" combined strains" filtered fermentation broth， significantly higher than that of the single strains. The average protective efficacy of the three antagonistic bacterial combinations on fragrant pear inflorescences ranged from 56.26% to 73.16% for"" combined strains" fermentation broth and 72.02% to 82.66% for" combined strains" filtered fermentation broth over 3 to 7 days，similarly，on potted Birchleaf Pear seedlings， protective efficacy ranged from 67.38% to 77.73% for"" combined strains" fermentation broth and 71.78% to 80.11% for"" combined strains" filtered fermentation broth over 7 to 15 days， with therapeutic efficacy ranging from 64.53% to 75.01% and 69.09% to 79.03%， respectively.Overall， the combined strains consistently exhibited enhanced efficacy compared to the single strains， with filtered fermentation showing good results to fermentation alone in terms of protective and therapeutic effects. Particularly， combination FX74-FN12 demonstrated the highest efficacy， achieving protective efficacies of" "73.16% and 82.66% in fermentation broth and filtered fermentation， respectively， during the initial" "3-5 days against fragrant pear blossom rot-an increase of 12.90% and 22.40%， respectively， compared to single-strain efficacy averages. Moreover， average protective and therapeutic efficacies on potted Birchleaf Pear seedlings over 7-15 days were more than 75% and 79%， respectively， showing increases of 15.12% and 11.02% compared to single-strain averages. These findings have the potential of FX74-FN12 for effective prevention of Birchleaf Pear fire blight.

Key words Erwinia amylovora; Antagonistic bacterial combination; Affinity; Antibacterial activity; Control effect determination