對藜高致病活性鏈格孢菌DT-DYLC的液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

摘 要 以鏈格孢菌（Alternaria alternata）DT-DYLC為研究對象，以生物量和孢子量（OD600nm）為響應(yīng)值，采用單因素試驗(yàn)和Plackett-Burman試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)對其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，察氏固體培養(yǎng)基7 d時(shí)的菌落直徑為73.1 mm，菌絲質(zhì)量達(dá)0.049 g，均顯著高于其他培養(yǎng)基。通過Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出無機(jī)鹽為影響孢子量的主要因素。運(yùn)用響應(yīng)面分析確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為：蔗糖68.853 g/L，NaNO3 11.41 g/L、K2HPO4 5.523 g/L、KCl 1.405 g/L、MgSO4·7H2O 1.874 g/L、FeSO4 0.0375 g/L。在此條件下，孢子量達(dá)到3.4 ×107 CFU/mL，是優(yōu)化前的2.72倍。優(yōu)化培養(yǎng)基可用于液體發(fā)酵工廠化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞 鏈格孢；孢子量；培養(yǎng)基優(yōu)化；響應(yīng)面法

雜草是影響農(nóng)作物豐產(chǎn)豐收的重要生物因子之一。其與作物爭光、爭水肥、爭空間，阻礙農(nóng)作物機(jī)械化播種及收獲，并在一定程度上傳播病蟲害，降低農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，是導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量減少的重要因素。其中藜（Chenopodium album "L.）為藜科（Chenopodiaceae）藜屬（Chenopodium）1 a生闊葉雜草，是青海省危害農(nóng)田的一種闊葉雜草優(yōu)勢種[1]。在全世界分布有 250 個(gè)種和亞種[2]，危害世界不同地區(qū)25種農(nóng)作物[3]。藜干擾目的作物生長，惡化環(huán)境，是影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)的主要生物逆境之一[4]。減少雜草數(shù)量可以通過機(jī)械除草等綜合管理的方法[5-6]，可是僅使用單一的控制措施不能有效地控制田間雜草的生長，所以效果顯著、使用便捷、便于大面積使用的化學(xué)除草劑[7]更容易被選擇，但其最大的缺點(diǎn)便是對環(huán)境有污染[8-9]。因此，對環(huán)境友好、無污染的微生物除草劑應(yīng)運(yùn)而生。

微生物除草劑是指一類直接以微生物個(gè)體為對象開發(fā)制備的生物農(nóng)藥。而其中的主要成分為雜草生防微生物（主要為真菌），其多以自然界為來源，具有毒性低和長效防治的特點(diǎn)[10-11]。如“魯保一號”是利用尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）制成的微生物制劑用于防除大豆田里的菟絲子[12]（Cuscuta" sp.），其防效可達(dá)70%～95%[13]；1971年，Hasan[14]從意大利維埃斯特引進(jìn)了一株銹菌，并成功防治了澳大利亞當(dāng)?shù)胤簽E的澳大利亞粉孢苣；Stierle等[15]發(fā)現(xiàn)鏈格孢菌（Alternaria alternate）產(chǎn)生的環(huán)肽毒素對黑矢車菊（Centaurea maculosa）有極強(qiáng)的毒性；顧瓊楠等[16]在發(fā)病牛筋草上分離得到一株牛筋草炭疽菌（Colletotrichum eleusines）NJC-16，對牛筋草鮮重防效達(dá)到了73%；劉璐等[17]從野外感病稗草上分離得到的彎孢屬新種（Curvularia" sp.）處理稗草的發(fā)病指數(shù)最高可達(dá)62.53。

具有生防活性的微生物自然生長條件下的生防能力不能夠達(dá)到生防要求，故需要人工培養(yǎng)進(jìn)行生防能力的優(yōu)化，其中優(yōu)化生長培養(yǎng)基是一種有效提高生防菌株能力的方式。楊景艷[18]對殺線蟲活性菌株KM2501-1培養(yǎng)基成分進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后培養(yǎng)的菌株的殺線蟲能力提高了 "61.61%；彭上[19]對刺糖多孢菌培養(yǎng)基進(jìn)行了成分和發(fā)酵條件優(yōu)化，所得多殺菌素較對照組提高了60.74%；黎秋雨等[20]對具有枸杞木虱生防效果的雷斯青霉進(jìn)行了發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，優(yōu)化后的產(chǎn)孢量提高了9.84倍，對枸杞木虱三齡若蟲同期防效高了25.56%；可見，優(yōu)化生防微生物生長培養(yǎng)基有助于優(yōu)化其生防能力。

本研究團(tuán)隊(duì)前期從青海省西寧市大通縣達(dá)隆村農(nóng)田感病大葉藜葉片中分離到一株鏈格孢菌（Alternaria alternata）DT-DYLC，通過研究發(fā)現(xiàn)其對藜具有高致病活性，對小麥、青稞、玉米、番茄和黃瓜安全，具有在以藜為優(yōu)勢雜草的禾本科、茄科和葫蘆科田中應(yīng)用潛力[21]。為了篩選低成本、廉價(jià)的培養(yǎng)基配方，獲得高濃度的鏈格孢菌的孢子量，本研究以孢子量（OD600nm）為響應(yīng)值，采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)對Alternaria alternata DT-DYLC的培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，得出其最優(yōu)培養(yǎng)基配方，以期為該菌株規(guī)?；a(chǎn)和農(nóng)業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌種

鏈格孢菌（Alternaria alternata） DT-DYLC，從青海省西寧市大通縣達(dá)隆村農(nóng)田中采集到自然感病的大葉藜（Chenopodium hybridum）植株葉片篩選獲得。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 固體培養(yǎng)基的篩選

將于PDA培養(yǎng)基保存并活化好的DT-DYLC菌株接種于7種培養(yǎng)基平板中央（表1），于 25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，用游標(biāo)卡尺以十字交叉法測量菌落直徑，并拍照記錄菌落形態(tài)后，將菌絲刮下放到50 ℃烘箱中烘至恒量后于分析天平上準(zhǔn)確稱量并記錄數(shù)據(jù)。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2 培養(yǎng)基的單因素優(yōu)化 以“1.2.1”篩選出的最佳固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對配方各成分進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在接種并培養(yǎng)活化的平板中打直徑為8 mm的菌餅接種于裝有基礎(chǔ)培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，于搖床培養(yǎng)7 d（25 ℃、180" "r/min），用紫外分光光度計(jì)測定培養(yǎng)液最大吸收波長λ=600 nm的OD值，重復(fù)3次。培養(yǎng)基各成分及水平選擇如表2所示。

1.2.3 成分及配比優(yōu)化 根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)行成分配比優(yōu)化，以單因素結(jié)果為中心點(diǎn)，菌株DT-DYLC的OD（λ=600 nm）值為響應(yīng)值（Y），以碳、氮源及無機(jī)鹽含量設(shè)計(jì)3因素5水平的響應(yīng)面（RSM）試驗(yàn)，其因素及水平如表3 "所示。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS Statistics 27、 "Design Expert 13和Excel對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan氏新復(fù)極差法比較差異顯 "著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 固體培養(yǎng)基的篩選

綜合分析菌落直徑和菌絲干質(zhì)量，以水瓊脂培養(yǎng)基作為對照，平板置于25 ℃培養(yǎng)箱7 d后。察氏培養(yǎng)基上的菌落直徑最大，為73.1 mm，其次為PDA和PSA培養(yǎng)基，菌落直徑分別達(dá) "68.54 mm和67.74 mm；菌絲干質(zhì)量，在PDA和察氏培養(yǎng)基上分別達(dá)0.052 g和0.049 g（圖1）。結(jié)合二者評價(jià)，在察氏培養(yǎng)基中菌落直徑和菌絲干質(zhì)量均顯著高于其他培養(yǎng)基，故選定察氏培養(yǎng)基為鏈格孢菌DT-DYLC菌株菌絲生長的最適培養(yǎng)基。由圖2可見，DT-DYLC菌株菌落在察氏、PDA和PSA培養(yǎng)基長勢最優(yōu)。

2.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 蔗糖含量對DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基OD值的影響 菌株DT-DYLC液體培養(yǎng)基的OD值在蔗糖含量30～50 g/L的區(qū)間內(nèi)上升， "50～60 g/L下降，60～70 g/L又突然上升，并在70 g/L達(dá)到最大值之后，隨著蔗糖含量增加，培養(yǎng)基的OD值迅速下降（圖3-A），故選定70 g/L為菌株DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳蔗糖 "含量。

2.2.2 硝酸鈉含量對DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基OD值的影響 隨著硝酸鈉含量增加，菌株DT-DYLC的OD值在3～6 g/L的區(qū)間內(nèi)迅速上升，6～12 g/L間上升平緩，在12 g/L達(dá)到最大值，之后隨著硝酸鈉含量上升，OD值迅速下降（圖3-B），故選定12 g/L為菌株DT-DYLC培養(yǎng)基的最佳硝酸鈉含量。

2.2.3 MgSO4·7H2O含量對DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基OD值的影響 隨著MgSO4·7H2O含量的增加，菌株DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基的OD值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并在2 g/L時(shí)達(dá)到最大值，之后在MgSO4·7H2O含量2.0～2.5 g/L時(shí)急劇下降，2.5～3.0 g/L時(shí)略微上升，后又隨著MgSO4·7H2O含量增加下降（圖3-C）。故選定2 g/L為菌株DT-DYLC培養(yǎng)基的最佳MgSO4·7H2O含量。

2.2.4 KCl含量對DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基OD值的影響 隨著KCl的含量增加，DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基的OD值呈升高-降低-升高-降低的形式，OD值在0.5～1.5 g/L內(nèi)迅速上升，在1.5 g/L時(shí)達(dá)到最大值。后在1.5～2.0" "g/L內(nèi)下降，在2.0～3.0 g/L區(qū)間內(nèi)上升。在 "3.0～ "3.5 g/L區(qū)間內(nèi)下降（圖3-D）。故選定1.5 g/L為菌株DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳KCl含量。

2.2.5 K2HPO4含量對DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基OD值的影響 隨著K2HPO4的含量增加，DT-DYLC的OD值先升高后降低，在1～2 g/L內(nèi)迅速升高，2～4 g/L開始略微下降，4～6 g/L內(nèi)上升，最終在6 g/L達(dá)到最大值。6～7 g/L內(nèi)下降（圖3-E）。故選定6 g/L為菌株DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳K2HPO4含量。

2.2.6 FeSO4含量對DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基OD值的影響 隨著FeSO4含量的增加，DT-DYLC的OD值總體呈先升高后降低的趨勢，在0.01～0.04 g/L區(qū)間內(nèi)DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基OD值呈上升趨勢。并在0.04 g/L達(dá)到最大值之后開始下降（圖3-F）。故選定0.04 g/L為菌株DT-DYLC培養(yǎng)基的最佳FeSO4含量。

2.3 成分及配比優(yōu)化

根據(jù)“2.2”得出的結(jié)果對鏈格孢菌 "DT-DYLC菌株的液體培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，利用Design expert中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)3因素5水平試驗(yàn)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，如表4所示。

以DT-DYLC發(fā)酵液的OD值（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)中心組合的試驗(yàn)結(jié)果（表4）進(jìn)行分析得到OD值與蔗糖（A）、NaNO3（B）與無機(jī)鹽（C）的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=0.690 4-0.013 7A+0.023 4B-0.050 7C-0.039 4AB+0.045 6AC-0.031 7BC- "0.014 44A2-0.083 7B2-0.167 0C2

通過方差分析上述回歸模型可知（表5），回歸模型的Plt;0.000 1，顯著性檢驗(yàn)極顯著，失擬項(xiàng)的P值0.341gt;0.05，顯著性檢驗(yàn)不顯著，說明未知因素對試驗(yàn)的干擾很小，模型穩(wěn)定，回歸方程的決定系數(shù)為99.12%，證明該方程與實(shí)際情況較符合，該模型能夠模擬菌株DT-DYLC的OD值與碳源、氮源和無機(jī)鹽之間的關(guān)系。

模型數(shù)據(jù)顯示，各因子的影響主次順序?yàn)椋篊 gt;AC gt; AB gt; BC gt; C2gt; B gt; A2gt;Agt; B2。一次項(xiàng)B、C、交互項(xiàng)AB、AC、BC及二次項(xiàng) A2、C2影響顯著。

根據(jù)試驗(yàn)因素（蔗糖、硝酸鈉、無機(jī)鹽）之間的交互效應(yīng)三維立體響應(yīng)面和等高線圖（圖4），確定一個(gè)因素后觀察另外兩個(gè)因素對DT-DYLC的OD值影響。綜上，三者交互作用響應(yīng)面皆為開口向下的凸形曲面，且交互效應(yīng)的等高線形狀為橢圓形，說明兩兩之間的交互作用效果較顯著。

利用回歸方程計(jì)算得到菌株DT-DYLC液體發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)孢量的培養(yǎng)基條件為：蔗糖 68.853 g/L，硝酸鈉 11.41 g/L，無機(jī)鹽8.94 g/L（其中K2HPO4 5.523 g/L、KCl 1.405 g/L、MgSO4·7H2O 1.874 g/L、FeSO4 0.0375 g/L）。

3 討論與結(jié)論

微生物農(nóng)藥具有綠色環(huán)保、低毒無害、高效可控、抗性低、安全易存儲(chǔ)等優(yōu)點(diǎn)，是未來農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要方向之一。而篩選具有抑草作用的微生物是微生物除草劑研究的重要途徑之一[22-24]，孢子是微生物生長過程中的一個(gè)重要間體[25]，孢子數(shù)量決定著生防菌劑的生防效用。故產(chǎn)孢率也是評價(jià)生防菌制劑的一個(gè)重要指標(biāo)[26]。但在自然屆篩選到的具有生防能力的菌株，其致病力和產(chǎn)孢量往往不能滿足微生物農(nóng)藥的工業(yè)化生產(chǎn)，所以需要對自然篩選的菌株進(jìn)行培養(yǎng)基碳源、氮源及無機(jī)鹽的優(yōu)化，以優(yōu)化菌株產(chǎn)孢能力。同時(shí)，優(yōu)化培養(yǎng)基也是提高經(jīng)濟(jì)效益的重要途徑[27]。通過優(yōu)化培養(yǎng)基提高孢子產(chǎn)量可為真菌制劑制備及其工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)保障[28]。

本研究通過先對固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，選出最適固體培養(yǎng)基，后進(jìn)行單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化，旨在使鏈格孢DT-DYLC達(dá)到最適生長條件后，增加其孢子和抑草物質(zhì)的產(chǎn)量。李祥等[29]研究得出察氏培養(yǎng)基為除草鏈格孢HY-02的最佳培養(yǎng)基，與本研究結(jié)果相同；通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了培養(yǎng)基的最佳碳源為蔗糖，這與杜艷麗等[30]研究結(jié)果一致；本研究中所采用的無機(jī)鹽對鏈格孢DT-DYLC培養(yǎng)基的OD值影響效果較明顯，這與楊瑩等[25]利用中心組合優(yōu)化出芽短梗霉菌PA-2菌株所用的無機(jī)鹽效果相似，均能優(yōu)化促進(jìn)菌株生長產(chǎn)孢；王雪妍等[31]對貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）HP-24進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，發(fā)酵液中的活菌數(shù)可達(dá)到 1.17×109 CFU/mL；郭建軍等[32]通過響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基使多粘類芽孢桿菌LY1發(fā)酵產(chǎn)芽孢數(shù)量達(dá)到了 "6.825×109 CFU/mL；戴寶等[33]通過響應(yīng)面法優(yōu)化了萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus） BsR05的芽孢產(chǎn)量提高了1.27倍；證明通過響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基可以促進(jìn)產(chǎn)孢。

本研究通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，確定鏈格孢菌DT-DYLC的最佳固體培養(yǎng)基為察氏培養(yǎng)基，液體發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)孢的最佳條件為：蔗糖 68.853 g/L、NaNO3 11.41 g/L、無機(jī)鹽 8.94 g/L（其中K2HPO45.523 g/L、KCl 1.405 g/L、 "MgSO4·7H2O 1.874 g/L、FeSO4 0.037 5" "g/L），在此條件下，孢子量達(dá)到3.4×107" "CFU/mL，是優(yōu)化前的2.72倍。優(yōu)化后的發(fā)酵條件，不僅能有效提高菌液中的孢子量，而且可進(jìn)一步降低培養(yǎng)成本，為鏈格孢菌DT-DYLC生防菌劑的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供參考。本研究目前只優(yōu)化了該菌株液體發(fā)酵的配方，后期還需進(jìn)行發(fā)酵條件探索，以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。

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Liquid Medium Optimization of Alternaria alternata DT-DYLC with High

Pathogenic Activity" against Chenopodium album

Abstract Using Alternaria alternata DT-DYLC as the research object， and with mycelium biomass and spore number （OD600nm） as the response value， the fermentation medium was optimized by single factor test， Plackett-Burman test， and response surface test. The results showed that after 7 days of cultivation at 25 °C on Chaw’s medium， the colony diameter and mycelium mass of DT-DYLC reached 73.1 mm， and the mycelial mass was 0.049 g， both significantly higher than other tested media. The main factors affecting the spore number of A.alternata DT-DYLC was inorganic salt. The optimal fermentation medium for spore production was determined by response surface methodology consisted of sucrose 68.853 g/L， NaNO3 11.41 g/L， K2HPO4 5.523 g/L， KCl" 1.405 g/L， MgSO4·7H2O" "1.874 g/L， FeSO4 0.037 5 g/L. Under these conditions， the spore number in the fermentation broth of A.alternata DT-DYLC reached 3.4×107 CFU/mL， which was 2.72 times that of the unoptimized condition. The optimized medium can be used for the industrial-scale liquid fermentation of" A.alternata" DT-DYLC.

Key words Alternaria alternata; Spore yield; Medium optimization;Response surface methods