基于分離培養(yǎng)和高通量測(cè)序的芷江白蠟蟲病原菌研究

摘 要 為了明晰引起湖南芷江侗族自治縣白蠟蟲發(fā)病的主要原因及病原種類，利用分離培養(yǎng)法和高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)分別從芷江李家界、胡家頭、田家溪和楊家村采集的6份罹病白蠟蟲樣本（5份雄蟲、1份雌蟲）進(jìn)行真菌群落組成和多樣性分析。結(jié)果表明，胡家頭、田家溪、楊家村的4份雄蟲樣本在真菌群落結(jié)構(gòu)上高度相似，其優(yōu)勢(shì)病原菌均為漸狹蠟蚧菌（Lecanicillium attenuatum）（豐度達(dá)94%以上，分離率28.12%），而采集于李家界的雄蟲樣本真菌多樣性較高，群落結(jié)構(gòu)和組成也明顯不同于以上4份雄蟲樣本（Plt;0.05），主要病原菌為六出花鏈格孢（Alternaria alstroemeriae）（分離率7.76%）和枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioide）（分離率9.75%）。采集自楊家村的雌蟲樣本真菌群落結(jié)構(gòu)不同于雄蟲，主要病原菌為松針刺盤孢菌（Colletotrichum fioriniae）（分離率18.50%）和一種橫斷孢屬真菌（Strelitziana sp.）（豐度25.77%）。此外，芷江罹病的雌、雄白蠟蟲在真菌群落組成上具有顯著差異，而雄性白蠟蟲的真菌群落結(jié)構(gòu)受立地環(huán)境影響較大，種蟲來(lái)源與白蠟蟲發(fā)病無(wú)明顯相關(guān)性。

關(guān)鍵詞 白蠟蟲；分離培養(yǎng)；昆蟲病原真菌；群落結(jié)構(gòu)和組成

白蠟蟲[Ericerus pela（Chavannes）]隸屬于半翅目（Hemiptera）蚧總科（Coccoidea）蠟蚧科（Coccidae），是中國(guó)特有的重要資源昆蟲。白蠟蟲的主要寄主植物是木犀科的女貞樹（Ligustrum lucidum Ait）和白蠟樹（Fraxinus chinensis Roxb），一齡若蟲在寄主植物葉片上活動(dòng)（定葉），二齡若蟲定棲在寄主植物枝干上（定桿），二齡雄若蟲定桿后分泌的白蠟具有很高利用價(jià)值，被廣泛應(yīng)用于化工、食品、醫(yī)藥、信息技術(shù)、化妝品等現(xiàn)代工業(yè)，素有“蠟中之王”美譽(yù)[1-4]。作為種蟲，雌蟲可通過有性生殖或孤雌生殖來(lái)繁衍后代[5]，為白蠟的生產(chǎn)提供種源。

白蠟在中國(guó)的生產(chǎn)和利用已有上千年歷史，形成了“高山產(chǎn)蟲，低山產(chǎn)蠟”的傳統(tǒng)生產(chǎn)模式[6]，白蠟蟲養(yǎng)殖是山區(qū)農(nóng)民致富的主要途徑和經(jīng)濟(jì)收入的主要來(lái)源[7]。但在生產(chǎn)中，白蠟蟲易受到寄生蜂、瓢蟲及病原微生物等威脅，導(dǎo)致白蠟產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益降低[4，8]。前期研究表明，盤長(zhǎng)孢屬（Gloeosporium）或刺盤孢屬（Colletotrichum）的某種真菌可導(dǎo)致湖南地區(qū)白蠟蟲雌蟲發(fā)生褐腐病，而種蟲帶菌被認(rèn)為是其主要侵染源[9]。引起白蠟蟲雌蟲霉病的是濕串孢霉屬的一種真菌（Monilochaetes sp.）[10]，主要靠雨水、媒介昆蟲和風(fēng)力傳播病菌孢子。此外，枝孢屬2種真菌（Cladosporium langeronii和C. sphaerospermum）也能引起白蠟蟲雌蟲發(fā)病，可造成雌蟲大量死亡，嚴(yán)重影響種蟲數(shù)量和質(zhì)量，進(jìn)而影響白蠟生產(chǎn)[11]。目前，關(guān)于白蠟蟲雌蟲受真菌感染死亡的報(bào)道較多，鮮有雄蟲被真菌侵染致死的報(bào)道。

湖南省芷江縣是中國(guó)傳統(tǒng)的白蠟產(chǎn)區(qū)，素有“白蠟之鄉(xiāng)”美譽(yù)[12]。芷江白蠟已于2020年登記成為全國(guó)農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志。但最近幾年，芷江多個(gè)地方的白蠟蟲爆發(fā)病害，引起雌、雄若蟲的大量死亡，只有少量可以遷移到枝條上，導(dǎo)致雄蟲產(chǎn)蠟量顯著減少，雌蟲產(chǎn)卵量驟然降低，嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)胤N蟲的種群繁衍，給養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。2022年6月底至7月初（白蠟蟲定桿期），本文作者通過死亡蟲體的初步鏡檢，發(fā)現(xiàn)湖南省芷江縣白蠟蟲是由真菌侵染致死的，但僅憑鏡檢結(jié)果，無(wú)法明確具體的病原種類。因此，本研究利用分離培養(yǎng)法和高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)6份罹病白蠟蟲樣品進(jìn)行了真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析，以期明確芷江罹病白蠟蟲的主要病原菌及引起發(fā)病的主要因素，為芷江白蠟蟲病害防控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 采集地概況

湖南省芷江縣（109°17′31″ E～109°54′49″ E，27°04′12″ N～27°38′24″N）地處云貴高原東緣，地形以山地和丘陵為主，呈山間盆地狀；海拔300～1 000 m，屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候，年均氣溫15.8 ℃～17.3 ℃，年均日照1 527.7 h，年均降雨量1 156.4～1 432.9 mm，年均無(wú)霜期279 d[12]。本研究樣品采集于芷江縣中部芷江鎮(zhèn)的4個(gè)村落，其中李家界屬于中低海拔區(qū)，農(nóng)戶較少，人口密度低，周圍多山林，植被覆蓋率相對(duì)較高；胡家頭、田家溪、楊家村3個(gè)采集地立地條件明顯與之不同，屬于低海拔區(qū)，農(nóng)戶集中、農(nóng)田較多，人為干擾較大，植被以農(nóng)田作物為主，植被覆蓋率相對(duì) "較低。

1.2 樣品采集和處理

2022年6月底至7月初，分別從芷江鎮(zhèn)的李家界、胡家頭、田家溪、楊家村4個(gè)養(yǎng)蟲基地采集帶有罹病白蠟蟲的大葉女貞葉片樣本，共采集到6份樣本（表1），用無(wú)菌自封袋單獨(dú)裝好后低溫帶回實(shí)驗(yàn)室。

從每份樣本中隨機(jī)選取3片葉子，將上面的白蠟蟲用無(wú)菌解剖刀刮取下來(lái)，分別置于1.5 mL的離心管中，每份樣本3個(gè)重復(fù)，共得到18個(gè)樣品。收集好的白蠟蟲立即放于-80 ℃冰箱保存，用于基因組提取和高通量測(cè)序；剩下的樣本放于4 ℃冰箱保存，用于可培養(yǎng)蟲生真菌的分離純化。

1.3 蟲體鏡檢

分別對(duì)葉片上發(fā)病的白蠟蟲和轉(zhuǎn)移到枝條上產(chǎn)蠟的健康白蠟蟲的蟲體進(jìn)行鏡檢。用無(wú)菌刀片刮取白蠟蟲的蟲體放于載玻片上，以無(wú)菌水為浮載劑制作成臨時(shí)玻片，在普通光學(xué)顯微鏡下 "（Olympus BX53）觀察蟲體形態(tài)、體表及體內(nèi)蟲生真菌的菌絲與孢子形態(tài)特征，挑選典型的標(biāo)本拍照，并對(duì)白蠟蟲病原真菌進(jìn)行初步分類鑒定[13]。

1.4 蟲生真菌的分離及純化

從每份樣本中隨機(jī)選取3片葉子，每片葉子挑取10個(gè)白蠟蟲，分別置于無(wú)菌培養(yǎng)皿（6 cm）中，在超凈工作臺(tái)中對(duì)蟲體進(jìn)行表面消毒[14]，依次用75%酒精浸泡40 s、1.5%次氯酸鈉浸泡 "1 min、無(wú)菌水沖洗4～5次，然后用滅菌濾紙吸干蟲體表面水分，將它們分別放在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上[PDA，含硫酸鏈霉素和卡那霉素 "（50 mg/L）]，每皿放5個(gè)蟲體，置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待蟲體長(zhǎng)出菌絲后，用滅菌接種針分別挑取菌落形態(tài)不同的菌絲到新的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。純化后的菌株接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，置于4 ℃冰箱保存，備用。

1.5 蟲生真菌的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：首先觀察純化菌株的菌落形態(tài)，包括正反面顏色、菌絲質(zhì)地、是否產(chǎn)生可溶性色素等，定期觀察菌絲生長(zhǎng)速率并拍攝菌落照片；再利用普通光學(xué)顯微鏡觀測(cè)菌絲形態(tài)、是否產(chǎn)孢、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、孢子形態(tài)和大小等顯微結(jié)構(gòu)，并將分離菌株的形態(tài)特征與蟲體鏡檢結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)和比對(duì)分析，明確不同分離菌株在罹病白蠟蟲上的生長(zhǎng) "特征。

分子生物學(xué)鑒定：采用CTAB法[15]提取分離菌株的基因組DNA作為模板，以ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）為擴(kuò)增引物，進(jìn)行分離菌株核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）基因序列擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至陜西楊凌天潤(rùn)奧科生物公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。對(duì)測(cè)序所得ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行比對(duì)，并從GenBank中下載同源性較高基因序列，最后使用MEGA11.0基于Neighbor-Joining（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定分離菌株的分類 "地位。

1.6 蟲生真菌群落的高通量測(cè)序

1.6.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增 用E.Z.N.A.soil試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）提取白蠟蟲樣品中的真菌基因組DNA，用紫外分光光度計(jì)（NanoDrop 2000）和1%瓊脂糖凝膠電泳分別檢測(cè)DNA的純度和提取質(zhì)量。檢測(cè)合格后，利用帶Barcode的正向引物ITS1F和反向引物ITS4R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為（20 μL）：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，正向和反向引物（5 μmol/L）各0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，DNA模板 10 ng，ddH2O補(bǔ)充至20 μL。反應(yīng)條件為：95" ℃預(yù)變性3 min；95" ℃變性30 s，55" ℃退火30 s，72" ℃延伸45 s，循環(huán)35次；最后72" ℃延伸10 min。每個(gè)DNA樣品擴(kuò)增3次，將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrepDNA試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，用Tris-HCl洗脫回收目標(biāo)DNA片段，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)回收質(zhì)量，用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進(jìn)行檢測(cè)定量。純化后的PCR產(chǎn)物送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，利用Illumina MiSeq PE300平臺(tái)（Illumina，San Diego，CA，USA）進(jìn)行測(cè)序。

1.6.2 測(cè)序數(shù)據(jù)分析 根據(jù)PE reads之間的 "overlap關(guān)系，使用Flash（Version 1.2.11， "http：//www.cbcb.umd.edu/software/flash）對(duì)測(cè)序獲得的原始序列（Raw reads）進(jìn)行拼接[16-17]，使用Fastp（Version 0.19.6，https：//github.com/OpenGene/fastp）軟件對(duì)reads的質(zhì)量和拼接效果進(jìn)行質(zhì)控，并去除過濾嵌合體序列[18]。根據(jù)序列首尾兩端的Barcode和引物序列區(qū)分各樣本數(shù)據(jù)，去除Barcode和引物序列后，最終獲得有效序列（Effective reads）。使用Uparse（Version11，http：//www.drive5.com/uparse/）對(duì)全部有效序列進(jìn)行聚類，將一致性（identity）達(dá)到97%以上的序列聚類為OTU[19]，計(jì)算每個(gè)OTU代表性序列在各個(gè)樣品中的相對(duì)豐度（Relative abundance），使用Qiime（Version 1.9.1，http：//qiime.org/install/index.html）軟件基于真菌ITS Unit數(shù)據(jù)庫(kù)（Version 8.0 https：//unite.ut.ee/）對(duì)OTU分類注釋真菌物種信息[20]，獲得每個(gè)OTU在各級(jí)分類水平上的信息[21]。使用Mothur（Version 1.30.2，https：//www.mothur.org/wiki/Downl）軟件[22]、Qiime軟件和R語(yǔ)言包（Version 3.3.1）進(jìn)行α和β多樣性分析。使用LefSe（http：//huttenhower.sph.harvard. edu/galaxy/root？tool_id=lefse_upload）軟件分析不同樣本間具有顯著性差異的群落或物種[23]。最后基于Funguild數(shù)據(jù)庫(kù)（Version 1.0，http：//www.funguild.org/），對(duì)真菌群落生態(tài)和功能信息進(jìn)行注釋[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲體鏡檢

健康蟲體的形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰、完整，沒有發(fā)現(xiàn)解體或被真菌侵染現(xiàn)象（圖1-A）。感病蟲體完整，但含有大量菌絲和分生孢子，有些菌絲和分生孢子梗伸出蟲體，并在體外產(chǎn)生大量分生孢子（圖 "1-B～1-D）。

2.2 蟲生真菌分離鑒定

從白蠟蟲蟲體上觀察到的蟲生真菌主要有6種，均在分離培養(yǎng)中得到了純菌株（菌株編號(hào) "ZP1～ZP6）。6種真菌在白蠟蟲蟲體上的寄生狀態(tài)及菌落形態(tài)和顯微特征具體如下。

被菌株ZP1侵染的白蠟蟲蟲體內(nèi)布滿大量的菌絲，細(xì)長(zhǎng)的分生孢子梗常從蟲體邊緣長(zhǎng)出，并向外延伸約250 μm（圖2-A），大量分生孢子散落在蟲體周圍（圖2-B）。菌株在PDA上培養(yǎng)15 d后可長(zhǎng)滿6 cm培養(yǎng)皿。菌落白色、致密而厚，背面呈奶油黃色，生長(zhǎng)后期菌落中央逐漸增高隆起，形成褶皺；氣生菌絲無(wú)色，匍匐生長(zhǎng)（圖2-C）；分生孢子梗較長(zhǎng)，瓶梗狀的產(chǎn)孢細(xì)胞基部漸狹，單生、對(duì)生或輪生，每輪3～4個(gè)；分生孢子單生，圓柱狀，兩端圓或一端稍尖，大小為（5.33～7.75）μm×（2.07～2.69）μm（圖2-D～2-E）。形態(tài)特征表明，菌株ZP1為蠟蚧菌屬（Lecanicillium） "真菌。

菌株ZP2侵染白蠟蟲后，蟲體內(nèi)產(chǎn)生大量分生孢子，較粗短菌絲和分生孢子梗常從蟲體邊緣伸出（圖3-A～3-B）。菌株在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d可長(zhǎng)滿6 cm培養(yǎng)皿。菌落呈棕粉紅色至白淺灰色，顏色從中央向邊緣遞減（圖3-C），肉眼可觀察到菌落中央有大量橘黃色分生孢子堆（圖 "3-D）。氣生菌絲棉絮狀，透明，有隔，具分枝；長(zhǎng)橢圓形的分生孢子光滑、無(wú)隔膜，基部鈍圓或稍尖，大小為（9.28～14.81） μm×（2.34～5.20） μm（圖3-E～3-F）。形態(tài)特征表明，菌株ZP2為刺盤孢屬（Colletotrichum）真菌。

菌株ZP3的分生孢子常與少量蠟絲混合，游離在被侵染的白蠟蟲蟲體周圍（圖4-A）。該菌株在PDA上培養(yǎng)7 d可長(zhǎng)滿6 cm培養(yǎng)皿。菌落近圓形，呈厚實(shí)的絨毛狀，正面橄欖綠色，背面藍(lán)黑色至黑色，中央稍隆起（圖4-B）。分生孢子淡黃褐色，呈倒棒狀、梨形或卵形，具有若干隔膜，分隔處平滑或縊縮（圖4-C），大小為（24.63～56.16）μm×（6.72～12.25） μm。形態(tài)特征表明，菌株ZP3為鏈格孢屬（Alternaria）真菌。

菌株ZP4的菌絲常從被侵染的蟲體邊緣長(zhǎng)出，形成分生孢子梗并產(chǎn)生橢圓形分生孢子（圖4-D）。菌株在PDA上培養(yǎng)16 d后可長(zhǎng)滿6 cm培養(yǎng)皿。菌落正面呈灰橄欖色或土黃色，有皺褶并隱約可見少許輪紋；菌落背面暗綠色，并有裂紋（圖4-E）。產(chǎn)孢細(xì)胞短甁梗狀，分生孢子近紡錘形或橢圓形，大小為（3.80～6.25） μm×（2.24～4.00） μm（圖4-F）。形態(tài)特征表明，菌株ZP4為枝孢屬（Cladosporium）真菌。

菌株ZP5在PDA上培養(yǎng)5 d可長(zhǎng)滿6 cm培養(yǎng)皿。菌落由中心向外呈橙黃色到白色，隨菌絲老化向培養(yǎng)基中釋放橙紅色水溶性物質(zhì)（圖4-H）。分生孢子常聚集形成大小為（9.94～22.14）μm×（9.15～21.23）μm的黃黑色分生孢子團(tuán)（圖4-I），散落在蟲體周圍（圖4-G）。形態(tài)特征表明，菌株ZP4為附球菌屬（Epicoccum）真菌。

菌株ZP6在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后長(zhǎng)滿6 cm培養(yǎng)皿。氣生菌絲薄絨狀，菌落白色，不產(chǎn)生色素（圖4-K）。產(chǎn)孢細(xì)胞為單瓶梗，產(chǎn)生兩種不同類型的分生孢子，小型分生孢子卵圓形，大小為（5.80～11.63）μm×（2.21～4.32）μm；大型分生孢子細(xì)長(zhǎng)，呈鐮刀狀，兩端略彎曲，頂端稍尖，壁較厚，具4～7個(gè)橫隔膜（圖4-L），大小為 "（17.68～22.64）μm×（3.02～4.07）μm，散落在被侵染的蟲體周圍（圖4-J）。形態(tài)特征表明，該菌為鐮孢菌屬（Fusarium）真菌。

此外，從白蠟蟲蟲體上共分離到129株真菌，依據(jù)形態(tài)學(xué)特征初步鑒定為14種真菌（包含上述6種）。對(duì)這14種真菌的ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)并提交至GenBank獲得菌株登錄號(hào)，最后構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5），明確了這14種真菌的分類地位，它們分屬于11個(gè)屬（表2）。菌株ZP1為漸狹蠟蚧菌（Lecanicillium attenuatum），除樣本SL和Yy外，其余樣本均分離到，其分離率最高；菌株ZP2為松針刺盤孢（Colletotrichum" fioriniae） "（18.50%），只在雌蟲樣本Yy中分離到六出花鏈格孢（Alternaria alstroemeriae）；菌株ZP3～ZP5分離自雄蟲樣本SL，分別為六出花鏈格孢（Alternaria alstroemeriae）（7.76%）、枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）（9.75%）和黑附球菌（Epicoccum nigrum）（3.20%）；菌株ZP6～ZP8為鐮孢菌屬真菌，分別為Fusarium longifundum（8.75%）、F. annulatum（7.08%）和接骨木鐮孢菌（F.sambucinum）（1.55%），幾乎每份樣品中均分離得到鐮孢菌屬真菌；菌株ZP9為球毛殼菌（Chaetomium globosum）（2.33%），分離自樣本YT和Yy；菌株ZP10和ZP11分離自雌蟲樣本Yy，分別為球黑孢菌（Nigrospora sphaerica） "（2.33%）和Diaporthe phaseolorum（1.55%）；菌株ZP12-ZP14主要分離自雄蟲樣本，分別為Coniella quercicola（3.65%）、黃曲霉（Aspergillus flavus）（3.10%）和曲霉屬真菌（Aspergillus sp.）（2.33%）。

2.3 高通量測(cè)序結(jié)果

2.3.1 序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及α多樣性分析 經(jīng)質(zhì)控過濾并去除嵌合體后，共獲得609 816條優(yōu)化序列，平均長(zhǎng)度為625 bp。每個(gè)樣品按最小序列數(shù)抽平到21 712條序列，在97%的相似性水平下聚類后得到6 691個(gè)真菌OTU?；贠TU水平建立Shannon多樣性指數(shù)稀釋曲線，隨著測(cè)序數(shù)量的增加，曲線趨于平坦飽和（圖6），表明本次測(cè)序數(shù)據(jù)合理。

α多樣性分析表明，雌蟲樣本Yy的Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)最高 "（Plt;0.05），Simpson指數(shù)最低（Plt;0.05）（表3），說(shuō)明罹病雌、雄蟲體上真菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著，雌蟲蟲體上真菌群落的種類多且分布均勻。雄蟲樣本SL的真菌群落多樣性及豐富度僅次于雌蟲樣本，而其余4份雄蟲樣品（SH、YT、CY、YY）的Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)及Chao1指數(shù)均較低，但Simpson指數(shù)均顯著高于樣本SL和Yy（Plt;0.05），說(shuō)明這4份樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單、物種組成較單一。

2.3.2 β多樣性分析 基于OTU水平進(jìn)行的PCA主成分分析結(jié)果表明，PC1與PC2的貢獻(xiàn)率分別為39.11%和15.48%（圖7），兩個(gè)水平可解釋50%以上的數(shù)據(jù)差異。樣本SH、YT、CY和YY聚類于同一象限，同一樣本內(nèi)的3個(gè)樣品高度集中，而不同樣本間分布距離較近且有重疊，表明這4份樣品真菌群落的構(gòu)成趨于一致；而SL和Yy樣本則較為分散，同一樣本內(nèi)的3個(gè)樣品雖聚類于同一象限但距離較遠(yuǎn)，均表現(xiàn)出一定的個(gè)體獨(dú)立性。PC1可將雌蟲樣品Yy與其余5份雄蟲樣品明顯區(qū)分開，表明罹病雌、雄白蠟蟲在真菌群落結(jié)構(gòu)上存在明顯差異；PC2可將SL與其余4份雄蟲樣品明顯區(qū)分開。

為進(jìn)一步揭示不同樣本群落結(jié)構(gòu)的相似性或差異關(guān)系，在OTU水平上對(duì)樣本群落距離矩陣進(jìn)行層級(jí)聚類分析（Hierarchical clustering），構(gòu)建樣本層級(jí)聚類樹。層級(jí)聚類結(jié)果與PCA分析結(jié)果相一致，所有樣品主要聚集為2個(gè)獨(dú)立的大分支（圖8），雌蟲樣本Yy為一個(gè)分支，雄蟲樣本為另一個(gè)分支，表明雌、雄白蠟蟲上真菌群落之間存在較大的差異。在雄蟲樣本的分支中，SL單獨(dú)聚類為一小支，其余4份雄蟲樣本聚集明顯，為另一個(gè)小分支。

2.3.3 真菌群落組成及差異分析 聚類得到的OTU代表序列與真菌ITS數(shù)據(jù)庫(kù)（Unite）比對(duì)和物種注釋結(jié)果表明，6 691個(gè)OTU歸屬于6門30綱72目176科349屬599種。在門水平上，所有樣本真菌群落的組成結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，優(yōu)勢(shì)菌門為子囊菌門（Ascomycota），次優(yōu)勢(shì)菌門為擔(dān)子菌門（Basidiomycota）（圖9-A）。與其余5份樣本相比，樣本SL中子囊菌門的相對(duì)豐度顯著較低，而擔(dān)子菌門的相對(duì)豐度顯著較高（Plt;0.05）。

在屬水平上，18個(gè)樣品中豐度最高的前6個(gè)屬為蠟蚧菌屬（65.08%）、鏈格孢屬（7.11%）、刺盤孢屬（7.01%）、枝孢屬（6.54%）、橫斷孢屬（Strelitziana）（4.31%）和木霉屬（Trichoderma）（2.84%）（圖9-B）。其中，僅漸狹蠟蚧菌能注釋到種水平（圖9-C），其他蟲生真菌需要結(jié)合分離培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)一步確定。如前所述，前4個(gè)屬均有相應(yīng)的菌種被分離培養(yǎng)出來(lái)，而橫斷孢屬和木霉屬真菌未被分離培養(yǎng)出來(lái)。

6份白蠟蟲樣本的真菌群落組成和結(jié)構(gòu)不盡相同，且菌種的相對(duì)豐度差異較大。樣本SL的優(yōu)勢(shì)屬包括鏈格孢屬（特有屬，42.56%）、枝孢屬（38.35%）、維希尼克氏酵母屬（Vishniacozyma）（4.77%）、蠟蚧菌屬（3.82%）和附球菌屬（特有屬，2.53%）；其中，Alternaria alstroemeriae和枝狀枝孢菌的分離率較高。雌蟲樣品Yy的優(yōu)勢(shì)屬為刺盤孢屬（41.91%）、橫斷孢屬（特有屬， nbsp;25.77%）和木霉屬（特有屬，17.00%），而松針刺盤孢是該樣本分離培養(yǎng)真菌中的優(yōu)勢(shì)種。樣本SH、YT、CY和YY在群落結(jié)構(gòu)和組成上高度相似，漸狹蠟蚧菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種，其豐度均在94%以上。

2.3.4 LefSe組間差異顯著性分析 多樣性分析及群落結(jié)構(gòu)和組成分析均表明，樣本SH、YT、CY和YY的菌群結(jié)構(gòu)具有高度一致性，組間物種組成差異性極小。為了尋找不同樣本間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)志物（Biomarker），明晰罹病白蠟蟲的主要病原菌，將這4份樣品合并為一組（命名為“FM”），并利用LefSe分析樣本FM、SL及Yy間具有顯著性差異的群落或物種（LDA值≥ 4.0）。結(jié)果表明，樣本SL和Yy中指示類群比較豐富（圖10）。在屬水平上，樣本SL顯著富集的類群有鏈格孢屬和枝孢屬；Yy則是刺盤孢屬、木霉屬和橫斷孢屬；FM中起重要作用的真菌類群是糞殼菌綱（Sordariomycetes）肉座菌目（Hypocreales）蟲草科（Cordycipitaceae）的蠟蚧菌屬，在種水平上對(duì)應(yīng)的是漸狹蠟蚧菌。以上在各組中顯著富集的類群可作為各組的生物標(biāo)志物，即不同樣本的優(yōu)勢(shì)病原菌。

2.3.5 功能預(yù)測(cè) 利用Funguild對(duì)白蠟蟲樣本的真菌群落進(jìn)行功能預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明6份樣本的真菌功能類群主要包括腐生營(yíng)養(yǎng)型（Saprotroph，33.72%）、病理營(yíng)養(yǎng)型（Pathotroph， "25.98%）、病理-腐生-共生營(yíng)養(yǎng)型（Pathotroph-Saprotroph-Symbiotroph，16.58%）、病理-共生營(yíng)養(yǎng)型（Pathotroph-Symbiotroph，9.98%）、共生營(yíng)養(yǎng)型（Symbiotroph，8.40%）、病理-腐生營(yíng)養(yǎng)型（Pathotroph-Saprotroph，3.40%）。

6份樣本共得到12個(gè)生態(tài)功能群，不同樣本的主要生態(tài)功能群的相對(duì)豐度存在顯著差異（圖11）。樣本SL的主要功能群包括：動(dòng)物病原菌-內(nèi)生真菌-地衣寄生菌-植物病原菌-木材腐生菌（Animal pathogen-Endophyte-Lichen parasite-Plant pathogen-Wood saprotroph，38.35%）和動(dòng)物病原菌-內(nèi)生菌-植物病原菌-木材腐生菌（Animal pathogen-Endophyte-Plant pathogen-Wood saprotroph，42.56%），在屬水平上分別對(duì)應(yīng)的是枝孢屬和鏈格孢屬。樣本SH、YT、CY和YY中動(dòng)物病原菌（Animal pathogen）的相對(duì)豐度達(dá)95%以上，為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)功能群，在種水平上對(duì)應(yīng)的是漸狹蠟蚧菌。雌蟲樣本中的優(yōu)勢(shì)功能群包括：內(nèi)生菌-植物病原菌（Endophyte-Plant pathogen，41.94%）、植物病原菌（Plant pathogen，26.45%）和內(nèi)生菌（Endophyte，17%），在屬水平上對(duì)應(yīng)的分別是刺盤孢屬、橫斷孢屬和木 "霉屬。

3 討論與結(jié)論

昆蟲病原真菌（Entomopathogenic fungi）具有侵染和殺死昆蟲的能力[24]，自然界病死的昆蟲約60%是因感染這些真菌而死亡的[25]。為揭示“白蠟蟲之鄉(xiāng)”芷江的白蠟蟲病原菌，本研究同時(shí)采用分離培養(yǎng)法和Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)不同種蟲來(lái)源及立地條件下的6份罹病白蠟蟲樣本進(jìn)行了真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究，共分離培養(yǎng)得到11屬14種真菌；通過高通量測(cè)序共檢測(cè)出349屬599種真菌，明顯高于分離培養(yǎng)得到的菌株，但大部分物種的豐度極低。高通量測(cè)序結(jié)果與分離培養(yǎng)的結(jié)果在優(yōu)勢(shì)菌群及多樣性分析上基本一致，但高通量測(cè)序注釋到種水平的菌種僅漸狹蠟蚧菌。幾乎每份樣品在蟲體鏡檢時(shí)均觀察到鐮孢菌屬真菌，其分生孢子大量游離在蟲體周圍，且鐮孢菌的分離率也較高，但高通量測(cè)序結(jié)果中鐮孢菌的豐度極低（0.02%）。鐮孢菌在死亡蟲體上常以腐生菌的形式生存[26]，本研究中觀察和分離到的鐮孢菌可能是白蠟蟲死后在蟲體上大量腐生形成的，而測(cè)序豐度低可能與鐮孢菌凋亡較快、遺傳物質(zhì)嚴(yán)重降解有關(guān)[27]。

樣本SL的優(yōu)勢(shì)菌為鏈格孢屬和枝孢屬真菌，功能預(yù)測(cè)顯示它們既是動(dòng)物病原菌又是植物病原菌。研究表明，動(dòng)物病原菌可導(dǎo)致植物病害，植物病原菌也能在昆蟲、動(dòng)物和人類等寄主體內(nèi)定殖，即所謂的“跨界侵染（Cross-kingdom infection）”[28]。白蠟蟲整個(gè)生活史幾乎都是在寄主植物上完成的，這為部分真菌跨界侵染提供了機(jī)會(huì)，這可能也是樣本SL中混合營(yíng)養(yǎng)型真菌較多的主要原因。部分鏈格孢屬和枝孢屬真菌作為動(dòng)物病原菌，可感染多種昆蟲[29-31]。王雪慶等[32]和孫濤等[33]曾從健康雌性白蠟蟲成蟲及蠟花中檢測(cè)到豐度較低的鏈格孢菌和枝孢菌，表明這兩種真菌在低豐度時(shí)不會(huì)導(dǎo)致白蠟蟲感病。在滿足擴(kuò)張條件時(shí)，枝孢屬真菌會(huì)產(chǎn)生致病性，造成白蠟蟲雌成蟲大量死亡[11]。本研究發(fā)現(xiàn)樣本SL中鏈格孢屬和枝孢屬的測(cè)序豐度較高，且枝狀枝孢菌和六出花鏈格孢的分離率較高，表明其病原菌應(yīng)為枝狀枝孢菌和六出花鏈格孢。

樣本Yy的優(yōu)勢(shì)菌為刺盤孢屬（松針刺盤孢）、橫斷孢屬和木霉屬真菌。刺盤孢屬和橫斷孢屬為植物病原菌，可引起植物炭疽病[34]和煤污病[35]。刺盤孢屬真菌也可侵染昆蟲，并導(dǎo)致其死亡[36-38]。另外，松針刺盤孢的分生孢子產(chǎn)生的氣味對(duì)雌果蠅有驅(qū)避作用，侵染后能降低果蠅產(chǎn)卵率和若蟲存活率[39]。本研究中松針刺盤孢屬和橫斷孢屬真菌侵染白蠟蟲后，可能同時(shí)誘發(fā)白蠟蟲寄主植物發(fā)生病害，降低寄主植物營(yíng)養(yǎng)成分，進(jìn)一步加重雌性若蟲的大量死亡。木霉屬真菌可作為拮抗菌抑制多種病原菌，但樣本Yy中木霉屬相對(duì)豐度遠(yuǎn)低于橫斷孢屬和刺盤孢屬的總豐度，可能對(duì)病原菌的拮抗作用較弱，不能有效抑制病原菌的大量生長(zhǎng)和繁殖，因而難以阻止白蠟蟲真菌性病害的發(fā)生。

漸狹蠟蚧菌是重要的昆蟲病原真菌[40]，其商品化藥劑對(duì)半翅目、鱗翅目害蟲（蚜蟲、木虱、煙草粉斑螟等）具有較高致病力[41-45]。此外，蠟蚧菌屬真菌也能抑制某些植物病原真菌和寄生菌，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)[46-47]。本研究發(fā)現(xiàn)漸狹蠟蚧菌是樣本SH、YT、CY、YY中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種（優(yōu)勢(shì)病原菌），而其余菌群的豐度極低。這可能是漸狹蠟蚧菌抑制了其他病原菌和腐生菌生長(zhǎng)，導(dǎo)致物種多樣性顯著下降。濕度通常是決定昆蟲病原菌致病力強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素，相關(guān)研究表明，漸狹蠟蚧菌對(duì)棉蚜蟲的致病力會(huì)隨著濕度的升高而增加[48]。本研究的采樣時(shí)間為高溫多雨的盛夏季節(jié)，當(dāng)時(shí)的氣候條件利于漸狹蠟蚧菌產(chǎn)生大量孢子并隨雨水?dāng)U散傳播，可能有效增強(qiáng)了漸狹蠟蚧菌的侵染力。這是首次發(fā)現(xiàn)漸狹蠟蚧菌侵染可引起雄性白蠟蟲大量發(fā)病和死亡。

昆蟲病原真菌的群落組成和物種豐度會(huì)受海拔高度、植被特點(diǎn)、氣候變化以及地理位置等各種環(huán)境因素的影響[49-50]。本研究發(fā)現(xiàn)，立地條件相似但種蟲來(lái)源不同的4份雄蟲樣本（SH、YT、CY和YY）在真菌群落結(jié)構(gòu)組成上高度相似；而種蟲均源于陜西的雄蟲樣本SL與SH的立地條件不同，它們的真菌群落組成具有顯著性差異。該結(jié)果表明，芷江縣罹病雄性白蠟蟲的真菌群落結(jié)構(gòu)差異主要由環(huán)境因子引起，與種蟲來(lái)源無(wú)關(guān)。另外，同種源、同立地環(huán)境的雄蟲樣本YY和雌蟲樣本Yy的真菌群落組成差異較大，表明引起雌、雄蟲死亡的病原菌并不相同。本研究揭示了引起該地白蠟蟲發(fā)病的主要病原菌，為白蠟之鄉(xiāng)的白蠟蟲病害防控提供了理論基礎(chǔ)。

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Pathogens" Analysis of Ericerus pela in Zhijiang Through a Culture-

dependent Approach and High-throughput Sequencing

Abstract To identify the main factors and" the pathogens responsible for the disease of Ericerus pela in Zhijiang，a culture-dependent approach combined with the high-throughput Illumina MiSeq technology was used to investigate the fungal community structure and diversity of six infected Ericerus pela samples （ five male samples and one female sample） collected from Lijiajie，Hujiatou，Tianjiaxi and Yangjiacun" in Zhijiang.The results showed a high similarity in fungal community structure" "among four male samples collected from Hujiatou，Tianjiaxi and Yangjiacun，with Lecanicillium attenuatum being the dominant pathogen （abundance more than 94%，isolation rate 28.12%）.The male sample from Lijiajie exhibited a significantly different community structure compared to those of the four male samples （Plt;0.05）.This sample demonstrated" relatively higher diversity，with Alternaria alstroemeriae （isolation rate 7.76%） and Cladosporium cladosporioides （isolation rate 9.75%） as the main pathogens.The female sample from Yangjiacun" showed distinct differences in fungal community structure compared to the male samples，with Colletotrichum fioriniae （isolation rate 18.50%） and Strelitziana sp.（abundance 25.77%） as the dominant pathogens.Moreover， the fungal community composition and structure in infected "Ericerus pela males significantly differ from those in infected females.These differences are mainly associated with the site environment rather than the origin of the breeding population of E.pela.

Key words Ericerus pela; Culture-dependent approach; Entomopathogenic fungi; Community structure and composition