陸地棉GhUGP1基因的克隆與表達(dá)分析

摘 要 為進(jìn)一步了解UGPase在棉花中的作用，根據(jù)全基因組測序結(jié)果，篩選且克隆了在陸地棉纖維發(fā)育過程中的關(guān)鍵基因 GhUGP1。利用生物信息學(xué)方法對其核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行分析，通過同源重組技術(shù)，將 GhUGP1基因的編碼序列構(gòu)建到原核表達(dá)載體pMAL-C4x上，通過IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)來確定IPTG誘導(dǎo)蛋白的最佳條件，最后利用Western Blot鑒定重組蛋白。結(jié)果顯示， GhUGP1（XP_040931642.1）全長序列 "6 572 bp，編碼區(qū)1 404 bp，編碼467個(gè)氨基酸，預(yù)測分子質(zhì)量約為51.493 ku，等電點(diǎn)為5.86。氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)在陸地棉、亞洲棉、木槿等不同物種間UGP序列的相似率為90.63%。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示GhUGP1蛋白與亞洲棉UGP蛋白親緣關(guān)系最近，同源性最高并在一個(gè)分支上。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示該蛋白為核膜共定位。蛋白誘導(dǎo)時(shí)由于IPTG濃度梯度結(jié)果差別不明顯，選擇IPTG終濃度為0.3 mmol/L，而溫度梯度和時(shí)間梯度結(jié)果差異明顯，確定最佳誘導(dǎo)溫度為28 ℃，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為6 h，蛋白溶解及純化的溫度和時(shí)間為28 ℃誘導(dǎo)6 h。Western Blot結(jié)果表明重組蛋白的大小正確，最終成功獲得了大小為95.9 ku的pMAL-C4x-GhUGP1重組蛋白，為后期對 GhUGP1功能深度解析提供幫助。

關(guān)鍵詞 陸地棉； GhUGP1基因；克??；序列分析；原核表達(dá)

棉花（Gossypium spp）是不可或缺的經(jīng)濟(jì)作物，棉花纖維在已知的天然纖維中純度最高，在全球紡織業(yè)中具有重要價(jià)值，為人類提供了巨大的利益，是全球重要的原材料[1]。雖然國內(nèi)棉花總產(chǎn)較高，但是纖維品質(zhì)較差，因此改善纖維品質(zhì)成為棉花育種的重點(diǎn)。纖維品質(zhì)包括纖維長度、強(qiáng)度、馬克隆值等。其中纖維強(qiáng)度主要由細(xì)胞壁強(qiáng)度決定，植物細(xì)胞壁包含纖維素、半纖維素和果膠三大類多糖，以及酚類化合物和細(xì)胞壁蛋白。果膠可連接纖維素、非纖維素和其他基質(zhì)，因此其對改良棉花纖維品質(zhì)具有重要作用[2]。在果膠合成的三條途徑中，UDP-葡萄糖途徑備受關(guān)注。尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（UGP）對于多糖生物合成來說十分關(guān)鍵[3]，并且對植物生長發(fā)育也起到重要作用[4]。其中，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）在植物各個(gè)組織和器官中均有存在，并且UGPase與糖代謝密切相關(guān)[5]。在糖代謝的途徑中，UGPase可逆催化尿苷三磷酸（UTP）和葡萄糖-1-磷酸（Glucose1-phosphate）反應(yīng)生成尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和焦磷酸（PPi），這是一個(gè)可逆反應(yīng)，反應(yīng)公式為Glucose-1-phosphate+UTPPPi＋UDPG[6]。其中UDPG可作為胞外信號分子來影響植物生長[7]，也是形成纖維素、半纖維素等重要細(xì)胞壁聚合物的前體[8]。UGPase最先于1953年在酵母細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)UGPase可分為兩類，分別是UGPase-A和UGPase-B，且各自結(jié)構(gòu)差異明顯沒有同源性[11]。UGPase在自然界中分布較廣，目前已在部分動(dòng)物[12]、植物[13-15]及微生物[16]中發(fā)現(xiàn)并研究，但對于植物來說只有被子植物中含有UGPase[17]。在棉花中UGP基因參與纖維素及糖類化合物的合成，并可能在棉花纖維發(fā)育中起重要作用[18-19]。

本研究通過對陸地棉轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)分析并用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，篩選到陸地棉纖維發(fā)育過程中的關(guān)鍵基因 GhUGP1，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析并構(gòu)建原核表達(dá)載體，通過設(shè)置異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）濃度、時(shí)間及溫度梯度發(fā)現(xiàn)利用IPTG誘導(dǎo)蛋白的最佳條件，成功在體外表達(dá)，為后續(xù)深入研究蛋白互作，UGP基因功能及創(chuàng)制纖維品質(zhì)優(yōu)良的種質(zhì)材料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

高保真酶TransStart FastPfu DNA Polymerase（含2.5 mmol/L dNTPs）、TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix購自北京全式金生物公司；DNA Marker（D2000）、快速質(zhì)粒小提試劑盒（DP105）、（DP441）RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、大腸桿菌DH5α和BL21DE3）均購自天根生化科技（北京）有限公司；GatewayTMBP ClonaseTMII 酶混合物和GatewayTMLR ClonaseTM酶混合物購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；IPTG、4×蛋白上樣緩沖液（含巰基還原劑）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluorid，PMSF）、30%制膠液（29∶1）購自北京索萊寶科技有限公司；MBPSep Dextrin Agarose Resin 6FF（MBP標(biāo)簽蛋白高度交聯(lián)純化樹脂）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司Tween 20/吐溫20（Reagent grade）購自碧云天生物；pDONORZeo（Zeo+）和pMAL-C4x（Amp+）載體由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所作物分子植物育種課題保存；SL0911農(nóng)桿菌侵染液（煙草專用）購自北京酷來搏科技有限公司；其他試劑均為化學(xué)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 GhUGP1基因熒光定量驗(yàn)證 對棉花開花后0、5、10、15、20、25 d時(shí)期的纖維進(jìn)行取樣，利用天根DP441試劑盒提取樣品的RNA，用全式金試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，用15 g/L瓊脂糖檢測條帶。利用Snap Gene軟件設(shè)計(jì) GhUGP1基因（Ghir_A08G004240.1）的qRT-PCR引物。使用全式金qPCR SuperMix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR，儀器LightCycler 480 Instrument II，反應(yīng)體系和儀器程序參照說明書。內(nèi)參基因?yàn)镚hUBQ7（該基因在棉花各組織，細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，且不受外源或內(nèi)源因素的影響）[20]， "3個(gè)重復(fù)，運(yùn)用2-△△Ct法計(jì)算。

1.2.2 GhUGP1基因序列的獲得及原核表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)棉花全基因組測序結(jié)果以TM-1 cDNA克隆 GhUGP1基因并將其連接到pMAL-C4x（MBP）載體上。根據(jù) GhUGP1基因（Ghir_A08G004240.1）的CDS序列設(shè)計(jì)并合成添加BP接頭引物進(jìn)行擴(kuò)增（表1），擴(kuò)增體系為50 μL：cDNA 3 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、dNTPS（2.5 mmol/L）10 μL、PCR Stimulant（5×）0.5 μL、5×Fly Buffer 10 μL、Trans Start Fast Pfu Fly Buffer 1 μL、ddH2O 23.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性98 ℃ 5 min，以下程序32個(gè)循環(huán)（變性98 ℃ 5 min、退火55 ℃ 30 s、延伸72 ℃" "90 s），最終延伸72 ℃ 5 min。用15 g/L瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物。

利用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建載體，利用BP反應(yīng)將目的片段連入中間載體pDONOR/Zeo，反應(yīng)體系為：1.5 μL ddH2O、1 μL" pDONER/Zeo（Zeo+）、2 μL PCR產(chǎn)物、0.5 μL Gateway BP Clonase。25 ℃放置4 h轉(zhuǎn)化至DH5α，涂于含博來霉素（Zeo）抗性的培養(yǎng)皿。挑取單克隆檢測完畢后將陽性菌液送去上海生工生物技術(shù)有限公司（http：//www.sangon.com /sangon）測序。測序正確后提取質(zhì)粒。

利用LR反應(yīng)構(gòu)建超表達(dá)載體及原核表達(dá)載體，反應(yīng)體系為：1.5 μL ddH2O、1 μL pGWB405（Spe+）/pMAL-C4x（Amp+）、1 μL pDONER/Zeo-GhUGP1質(zhì)粒、0.5 μL Gateway LR Clonase。室溫放置4 h，轉(zhuǎn)入DH5α，涂于含氨芐青霉素（Amp）抗性的培養(yǎng)皿，挑取單克隆檢測，提取質(zhì)粒后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)，挑取單克隆陽檢，選擇陽檢正確的菌液，保菌并進(jìn)行后續(xù) "試驗(yàn)。

1.3 GhUGP1基因的序列分析

通過多種在線工具對 GhUGP1的序列進(jìn)行分析。利用Expasy在線工具查找蛋白的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)。利用NCBI中的ORF" finder預(yù)測開放閱讀框架。利用NCBI中的Blast對其蛋白序列進(jìn)行同源性分析、DNAMAN對多重序列進(jìn)行比對。利用MEGA" 7.0內(nèi)置的ClustalW程序進(jìn)行多序列比對后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。bootstrap值設(shè)置為5 000、p-distance模型采用鄰近法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建GhUGP1蛋白與其他物種蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 亞細(xì)胞定位分析

利用Gateway技術(shù)將 GhUGP1的編碼區(qū)構(gòu)建到表達(dá)載體中形成融合質(zhì)粒 pGWB405-GhUGP1，將測序正確的質(zhì)粒利用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，陽檢后選擇正確的菌液保菌， "-80 ℃保存。取2 mL活化后的農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行離心收菌，使用煙草侵染液重懸菌體，并調(diào)節(jié)重懸液的OD600值為0.7～0.8，避光靜置2～3 h后用注射器注射侵染生長5～8周的健康幼嫩的煙草葉片，每株煙草注射2～3個(gè)葉片，使菌液在煙草葉片內(nèi)部擴(kuò)散，將侵染后的煙草植株標(biāo)記并在黑暗條件下放置48 h后使用激光共聚焦顯微鏡檢測熒光信號表達(dá)情況。

1.5 目的蛋白的誘導(dǎo)及可溶性分析

將轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)后陽檢正確且活化的大腸桿菌菌液按1∶50的比例加入含有Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)，取5 mL菌液分裝于5個(gè)試管內(nèi)，再分別加入IPTG使其終濃度達(dá)到0.1、0.3、0.5、0.7及0.9 mmol/L即可，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清，向沉淀中加入50 μL的1×磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）重懸菌體，再加入等量的4×蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min，在冰上冷卻后取15 μL進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定IPTG的最佳 "濃度。

根據(jù)上述的試驗(yàn)結(jié)果再分別設(shè)置時(shí)間梯度（0、2、4、6、8 h）和溫度梯度（18 ℃、28 ℃、37 ℃）培養(yǎng)結(jié)束后分別收集菌液。將收集的菌液4 ℃、 "8 000 r/min離心10 min，倒掉上清，于沉淀中加入50 μL的1×PBS溶液使其重懸，再加入50 μL 4×蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min，在冰上冷卻后取20 μL進(jìn)行SDS-PAGE檢測，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定IPTG誘導(dǎo)的最佳時(shí)間及溫度。

在重組蛋白pMAL-C4x-GhUGP1成功誘導(dǎo)表達(dá)后，再根據(jù)摸索出的最佳誘導(dǎo)表達(dá)的條件。對目的蛋白進(jìn)行可溶性分析。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后取600 mL菌液4 ℃、8 000 r/min離心10 min，向沉淀菌體中加入20 mL 1×PBS溶液重懸，采用超聲破碎，頻率60 kHz，超聲處理30 s，每次間隔 "3～5 s，持續(xù)6～10 min。4 ℃、8 000 r/min離心10 min，于上清沉淀中分別加入4×蛋白上樣緩沖液，取20 μL進(jìn)行SDS-PAGE檢測，分析蛋白的可溶性。

1.6 目的蛋白的純化

pMAL-C4x-GhUGP1重組蛋白純化：將10 mL破碎后的菌液4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清微濾處理并加入裂解液與2 mL 靜置后的MBPSep Dextrin Agarose Resin 6FF（MBP標(biāo)簽蛋白高度交聯(lián)純化樹脂）混勻，4 ℃搖晃1 h使蛋白與樹脂充分結(jié)合，過柱收集流出液；用 "5 mL洗脫緩沖液（1 mol/L Tris-Cl" pH=8.0， "10 mmol/L還原型谷胱甘肽）收集洗脫液，用于SDS-PAGE檢測。

1.7 Western Blot檢測重組蛋白

將目的蛋白和純化蛋白經(jīng)過處理后，進(jìn)行SDS-PAGE檢測。結(jié)束后將蛋白膠放入提前預(yù)冷好的轉(zhuǎn)膜液中浸泡5～10 min，利用Bio-Rad半干轉(zhuǎn)膜儀將浸泡好的蛋白膠轉(zhuǎn)到PVDF膜上，20 V恒壓轉(zhuǎn)膜1 h即可。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜夾出，正面朝下放入10 mL含有5%脫脂奶粉的1×PBS溶液常溫?fù)u晃封閉1 h，封閉結(jié)束后按照1∶8 000的比例加入一抗，常溫孵育3 h或者4 ℃搖晃過夜。用PBST溶液將膜漂洗3遍，每遍5 min。然后將膜放入5～10 mL 1×PBS溶液中，按 "1∶10 000的比例添加二抗，常溫孵育3 h，用PBST溶液將膜漂洗3～5遍，每遍5～10 min。然后在漂洗干凈的PVDF膜上加入Western發(fā)光檢測液A、B。用保鮮膜封好于暗匣內(nèi)放置 "10～30 min，結(jié)束后用蒸餾水輕輕沖洗，待膜晾干后進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhUGP1基因熒光定量驗(yàn)證

通過qRT-PCR對 GhUGP1在棉纖維不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)（圖1），該基因在棉花纖維發(fā)育期的表達(dá)量逐漸上升，在花后20 d時(shí)表達(dá)量最高，說明其可能參與棉花纖維的發(fā)育并在纖維發(fā)育伸長時(shí)起到重要作用。

2.2 pMAL-C4x-GhUGP1原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以陸地棉cDNA為模板，BP-GhUGP1-F和BP-GhUGP1-R為引物，擴(kuò)增獲得1000bp至2 000 bp之間的目的條帶（圖2-A），與 GhUGP1基因片段大小基本相符?；厥誔CR產(chǎn)物進(jìn)行BP反應(yīng)，后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有Zeo抗性的固體培養(yǎng)基中，經(jīng)陽檢測序后獲得1 404 bp的片段（圖2-B），表明pDONER/Zeo-GhUGP1入門載體構(gòu)建成功。提取BP質(zhì)粒后進(jìn)行LR反應(yīng)，陽檢后將正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有Amp抗性的固體培養(yǎng)基中，經(jīng)陽檢測序后獲得1 404 bp的片段（圖2-C），表明pMAL-C4x-GhUGP1原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.3 GhUGP1基因的序列分析

經(jīng)NCBI網(wǎng)站的ORF finder程序預(yù)測發(fā)現(xiàn)，這條序列含有完整的閱讀框， GhUGP1全長序列6 572 bp，編碼區(qū)長1 404 bp，編碼467個(gè)氨基酸，預(yù)測分子質(zhì)量約為51.493 ku，等電點(diǎn)為5.86。將 GhUGP1基因的氨基酸序列與其他植物的UGP1蛋白序列進(jìn)行了氨基酸序列比對分析，結(jié)果如圖3所示，整體相似性較高，為93.61%，說明UGP1在這些植物中較保守。

經(jīng)NCBI網(wǎng)站的BLAST程序獲得多個(gè)物種與GhUGP1的同源蛋白。使用MEGA" 7.0軟件的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）。結(jié)果顯示，陸地棉GhUGP1蛋白與亞洲棉（Gossypium arboreum）UGP親緣關(guān)系最近，與木槿（Hibiscus syriacus）親緣關(guān)系較近，可能是因?yàn)殛懙孛蕖喼廾藜澳鹃韧瑸楸蛔又参镩T錦葵科，因此它們之間的親緣關(guān)系相比其他物種較近。

2.4 GhUGP1基因的亞細(xì)胞定位分析

為進(jìn)一步研究 GhUGP1的亞細(xì)胞定位情況構(gòu)建了 GhUGP1與GFP的融合載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌陽檢后，侵染煙草葉片，觀察 GhUGP1在煙草葉片中的熒光信號，共聚焦熒光顯微鏡檢測顯示， GhUGP1在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上都有熒光信號，表明 GhUGP1基因所編碼的蛋白質(zhì)共定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核上（圖5）。

2.5 IPTG誘導(dǎo)蛋白的最佳條件

為了確定IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度，在轉(zhuǎn)化了pMAL-C4x-GhUGP1，且OD600為0.6～0.8的菌液中分別用不同IPTG終濃度（0、0.1、0.3、0.5、0.7及0.9 mmol/L）進(jìn)行37 ℃誘導(dǎo)3 h，結(jié)果顯示，目的條帶的大小約為95.9 ku（圖6-A），與預(yù)測結(jié)果相符，表明GhUGP1在大腸桿菌中成功表達(dá)，且根據(jù)條帶的清晰度確定IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度為0.3 mmol/L。

為了確定IPTG的最佳誘導(dǎo)時(shí)間，在轉(zhuǎn)化了pMAL-C4x-GhUGP1，且OD600為0.6～0.8的菌液中用相同IPTG終濃度（0.3 mmol/L）分別進(jìn)行37 ℃誘導(dǎo)0、2、4、6、8 h，結(jié)果顯示，pMAL-C4x-GhUGP1能在大腸桿菌中成功表達(dá)，且在誘導(dǎo)6 h時(shí)的條帶較清晰（圖6-B），因此可以確定IPTG誘導(dǎo)的最佳時(shí)間為6 h。

為了確定IPTG的最佳誘導(dǎo)溫度，在轉(zhuǎn)化了pMAL-C4x-GhUGP1，且OD600為0.6～0.8的菌液中用相同IPTG終濃度（0.3 mmol/L）分別進(jìn)行18、28、37 ℃，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示（圖6-C），且IPTG誘導(dǎo)的最佳溫度為28 ℃。

最終，最佳條件為IPTG的終濃度為0.3 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為28 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間為6 h，并用這些結(jié)果進(jìn)行后續(xù)的可溶性分析及Western Blot檢測。

2.6 蛋白的可溶性分析、純化及Western Blot檢測于28 ℃誘導(dǎo)pMAL-C4x-GhUGP1的表達(dá)，將誘導(dǎo)表達(dá)后所得的菌液超聲破碎后分別取上清和沉淀部分進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，發(fā)現(xiàn)重組蛋白主要存在于沉淀中（圖7），但是上清中也有部分蛋白，因此pMAL-C4x-GhUGP1為可溶性蛋白。SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)，重組蛋白pMAL-C4x-GhUGP1被成功洗脫，條帶較為單一，表明純化成功（圖7）。將pMAL-C4x-GhUGP1重組蛋白進(jìn)行Western blotting檢測，結(jié)果表明，純化后的GhUGP1重組蛋白，在PVDF膜上約95.9 ku處有一明顯條帶（圖7），與預(yù)期結(jié)果一致，說明重組蛋白pMAL-C4x-GhUGP1與抗體發(fā)生特異性結(jié)合。

3 討" 論

UGPase是植物糖代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，主要通過偶聯(lián)蔗糖磷酸合酶（SPS）和蔗糖合酶（SuSy）來參與植物的糖代謝。蔗糖合酶主要是分解蔗糖形成葡萄糖與果糖[21]，而葡萄糖（Glc）又是棉花纖維伸長過程中的所需物質(zhì)[22]，有研究發(fā)現(xiàn)蔗糖合酶表達(dá)量與纖維起始數(shù)目多少和纖維伸長度呈線性關(guān)系，在棉花纖維起始和伸長過程中具有重要作用[23]。

Wang等[24]發(fā)現(xiàn)在棉花中GhUGP基因的表達(dá)量受乙烯誘導(dǎo)的影響，在擬南芥中異源表達(dá)后植株的淀粉、可溶性糖及纖維素含量增加。本研究中qRT-PCR結(jié)果顯示 GhUGP1在棉花纖維發(fā)育期的表達(dá)量逐漸上升，UGP基因可能參與調(diào)節(jié)棉花纖維發(fā)育，是棉花纖維發(fā)育的重要候選基因。Pang等[25]發(fā)現(xiàn)UGP1基因的表達(dá)量提高后，纖維中寡糖的含量降低，UDPG的合成提高，從而調(diào)控細(xì)胞壁的合成。還有研究發(fā)現(xiàn)UGP基因在植物體內(nèi)的表達(dá)會受外界條件的影響，施加碳源和氮源能有效提高香菇菌絲UGP基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平[26]。佟巖等[27]發(fā)現(xiàn)在鐵皮石斛中UGP基因的表達(dá)量受外界溫度的影響。郭鑫[28]發(fā)現(xiàn)興安落葉松中的LgUGPase1和LgUGPase2基因主要參與植物的代謝調(diào)控，并對外界環(huán)境和植物激素有一定的響應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)低濃度Cd2+促進(jìn)三角褐指藻生長，并提高三角褐指藻中UGP基因的表達(dá)量[29]。張帆等[30]發(fā)現(xiàn)在水稻過表達(dá)OsUGP后UGPase酶活性，并且胞內(nèi)多糖含量和胞外多糖含量都上升，表明OsUGP對多糖合成具有正向作用。近年來，研究人員還從黨參[31]、落葉松[32]、海帶[33]中分離克隆出了UGPase基因。這些結(jié)果都為UGP基因家族的研究提供了寶貴的材料。

本研究從陸地棉中克隆出 GhUGP1基因編碼區(qū)為1 404 bp，編碼467個(gè)氨基酸，預(yù)測分子質(zhì)量約為51.493 ku，通過UGP氨基酸序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，GhUGP1氨基酸片段與其他植物有較高的同源性（93.61%），表明UGP基因編碼區(qū)保守性較高，與前人報(bào)道的結(jié)果類似[34]。qRT-PCR結(jié)果顯示 GhUGP1可能參與棉花纖維發(fā)育，與前人結(jié)果一致[35]。將其構(gòu)建到表達(dá)載體pWGB405和pMAL-C4x上，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示該蛋白為核膜共定位，通過蛋白誘導(dǎo)梯度試驗(yàn)確定了當(dāng)IPTG終濃度為0.3 mmol/L、誘導(dǎo)溫度為28 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間為6 h時(shí)重組蛋白可被成功誘導(dǎo)且效果最佳，后獲得可溶性的pMAL-C4x-GhUGP1蛋白并進(jìn)行了純化，Western Blot試驗(yàn)驗(yàn)證了純化后蛋白的正確性，所以克隆和鑒定棉花中的UGPase基因?qū)γ藁ㄌ谴x途徑及纖維發(fā)育研究具有重要意義。

棉花作為新疆的重要經(jīng)濟(jì)，提高棉花產(chǎn)量，改良棉花纖維品質(zhì)成為棉花產(chǎn)業(yè)可續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。本研究根據(jù)棉花全基因組測序結(jié)果克隆出 GhUGP1基因的編碼區(qū)，并構(gòu)建出了表達(dá)載體，利用IPTG成功誘導(dǎo)pMAL-C4x-GhUGP1重組蛋白。為后續(xù)在棉花中研究尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶在纖維發(fā)育中的功能及分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

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Cloning and Expression Analysis of "GhUGP1 Gene" from Gossypium hirsutum

Abstract This study aimed to understand the role of UGPase in cotton further. GhUGP1， a key gene in fibre development of Gossypium hirsutum， was screened and cloned based on whole genome sequencing results.Bioinformatics was then employed to analyze GhUGP1 nucleotide and amino acid sequences， and its coding sequences were subsequently inserted into a prokaryotic expression vector pMAL-C4x through the homologous recombination technique.IPTG-induced protein expression was used to determine the optimal conditions for IPTG-induced protein.Finally， Western Blot was used to identify the recombinant protein.The results showed that the full-length sequence of "GhUGP1 （XP_040931642.1） is 6 572 bp， with a coding region of 1 404 bp， encoding 467 amino acids， a predicted molecular mass" of about 51.493 ku， and an isoelectric point of 5.86.Amino acid sequence comparison analysis revealed that the similarity rate of UGP sequences among different species， such as Gossypium hirsutum， Gossypium arboreum， and Hibiscus syriacus was 90.63%.The results of evolutionary tree analysis showed that the GhUGP1 protein was closest to the UGP protein from Gossypium arboreum， with the highest homology， and on the same branch.The results of subcellular localization showed that the protein was co-localized at the nuclear membrane.The results of protein induction were not obvious due to the IPTG concentration gradient; thus， we chose the condition that the final concentration of IPTG was 0.3 mmol/L.The results of the temperature gradient and time gradient were obvious： the optimal induction temperature was 28 ℃， the optimal induction time was 6 h， and the temperature and time of protein solubilization and purification were 28 ℃ with induction for 6 h.The Western Blot results showed that the size of the recombinant protein was correct， and finally， the pMAL-C4x-GhUGP1 recombinant protein with a size of 95.9 ku was successfully obtained， which will help to analyze the function of GhUGP1 in depth at a later stage.

Key words Gossypium hirsutum； GhUGP1 gene； Cloning;" Sequence analysis;" Prokaryotic expression