電子束輻照對小麥幼苗生長、生理特性及相關(guān)基因表達(dá)的影響

摘 要 為了探討電子束輻照對‘普冰151’小麥幼苗生理及相關(guān)基因表達(dá)的影響，采用150 Gy、250 Gy和350 Gy加速器電子束輻照處理小麥干種子，測定不同輻照劑量處理對小麥幼苗株高、根長等生長特性以及相關(guān)生理特性，分析光合和抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)差異。結(jié)果表明：隨著輻照劑量增加，小麥幼苗的苗高、根長、生物量均降低，與對照相比，250、350 Gy處理幼苗生長受到顯著抑制（Plt;0.05）；隨著輻照劑量的升高，抗氧化酶活性均呈先升后降變化趨勢，150、250 Gy處理顯著提高 SOD和CAT活性（Plt;0.05），低中劑量的輻照有促進(jìn)保護(hù)酶活性增加的作用；不同輻照處理均顯著降低了葉片葉綠素a含量和最大光能轉(zhuǎn)換效率值（Fv/Fm）；隨著輻照劑量的提高，葉片超氧陰離子（O-·2）、MDA含量和質(zhì)膜透性增加，說明輻照劑量增高引起活性氧代謝失調(diào)；與對照組相比，輻照處理下光合相關(guān)基因 TaPEPC-5、 TaPPDK-1、TaMDH-7、TaRuBisco-2、TaNADP-ME-1表達(dá)有所上調(diào)，可能與調(diào)動光合能力有關(guān)。150、250 Gy輻照處理明顯提高了小麥葉片SOD、CAT活性以及TaSOD、TaPOD、TaCAT基因的表達(dá)水平，說明中高劑量有提高抗氧化的作用。

關(guān)鍵詞 高能電子束；誘變育種；光合基因；抗氧化酶

小麥?zhǔn)侵袊饕募Z食作物之一，品種改良是提高我國小麥產(chǎn)量的關(guān)鍵[1]。物理誘變育種是其中最便捷的方法[2]，輻射誘變是培育新品種和創(chuàng)制新種質(zhì)的有效途徑之一[3-4]。輻射誘變育種通常是利用γ射線、激光、離子束等對植物體進(jìn)行空間誘變，從而產(chǎn)生遺傳變異[5]。其中60Co-γ射線是輻照誘變育種中應(yīng)用最廣的一種方法，可在較短時間內(nèi)培育出新品種。

電子束輻照技術(shù)從上世紀(jì)90年代才廣泛受到人們的關(guān)注，該技術(shù)輻照成本低、效率高、易于控制、不產(chǎn)生放射性廢物[6-8]，已經(jīng)成為理想的γ射線輻照的替代技術(shù)[9]，目前發(fā)展迅猛，有很廣闊的發(fā)展前景[10]。該方法已成功應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品貯藏與保鮮，以提高食品質(zhì)量和安全性[11-12]。電子束輻照還可以用于小麥種子進(jìn)行預(yù)播前的種子消毒以優(yōu)化播種[13]。

電子束輻照在植物育種中的研究報道較少，對不同輻照劑量對小麥生長發(fā)育過程的影響和適宜劑量不太明確。 本研究采用電子加速器所產(chǎn)生的電子射線輻射處理小麥種子，分析不同劑量輻照對水培小麥幼苗葉片生長特性、生理特性及相關(guān)基因表達(dá)的影響，篩選合適的輻照劑量，為闡明電子束輻照誘變機(jī)理及農(nóng)作物物理誘變育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 輻照處理 試驗選用小麥品種為‘普冰151’，由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院張正茂教授提供。挑選籽粒飽滿、大小均勻的小麥種子分為4組，每組600 g，處理組使用10 MeV電子直線加速器（DZ型，中廣核輻照技術(shù)有限公司）進(jìn)行輻照處理，輻照劑量分別為0、150、250和350 Gy，劑量率為1 Gy·min-1，其中0 Gy為對照組（未輻照）。

1.1.2 水培小麥幼苗 將處理后的種子洗凈后置于墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，放置在培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽，前3 d設(shè)置黑暗環(huán)境，待種子發(fā)芽約1 cm時，將其移至光照培養(yǎng)箱（光照強(qiáng)度：80 μmol·m-2·s-1，溫度：22 ℃，光照周期：16 h光照/8 h黑暗），用1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)液。

1.2 試驗方法

1.2.1 幼苗生長特性的測定 水培第14天測量小麥株高、根長、鮮質(zhì)量及地上、地下生物量。每個指標(biāo)隨機(jī)選取10株幼苗用于統(tǒng)計分析。

1.2.2 生理指標(biāo)的測定 葉綠素含量測定采用96%乙醇研磨比色法；丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸比色法；超氧陰離子（O-·2）測定采用比色法；過氧化物酶（POD）含量測定采用愈創(chuàng)木酚氧化法；超氧化物歧化酶（SOD）含量測定采用 NBT光化還原法；過氧化氫酶（CAT）含量測定采用紫外吸收法；質(zhì)膜透性測定采用電導(dǎo)法。以上測定方法均參照高俊鳳[13]主編的《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》 ，每個處理設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。

葉綠素?zé)晒鉁y定：將小麥放到黑暗條件下處理至少30 min，后用弱光（小于0.1 μmol·m-2·s-1）照射，使用基礎(chǔ)型調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x（Junior-PAM，德國）測定單個小麥葉片的初始熒光（F0），然后照射飽和脈沖光（10 000 μmol·m-2·s-1）0.8 s，測定暗適應(yīng)最大熒光（Fm）。每個處理測定3個葉片，每個葉片重復(fù)測3次，取平均值。

1.2.3 光合相關(guān)基因及抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)分析 取14 d齡的小麥葉片，加入液氮研磨成粉，按照TRIzol試劑盒說明提取總RNA，測量OD值以確定總RNA濃度，-80" ℃保存，備用。之后以RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，參照 PrimeScriptTM RT reagent Kit 試劑盒（TaKaRa，Dalian，China）說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后于-20 ℃保存，備用。

利用Primer 3Plus設(shè)計光合作用相關(guān)基因（ TaPEPC-5、 TaPPDK-1、TaMDH-7、TaNADP-ME-1、TaRuBisco-2、TaPsb27）和抗氧化酶相關(guān)基因（TaSOD、TaPOD、TaCAT）引物（表1），以TaActin為內(nèi)參基因進(jìn)行實時熒光定量PCR。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照 SYBR Premix Ex TaqTMII 試劑盒（TaKaRa，Dalian，China）說明書，采用實時定量PCR儀（CFX96，BioRad，Hercules，California，USA）進(jìn)行熒光實時定量PCR測定。

每個樣品做3個生物學(xué)重復(fù)和3個技術(shù)性重復(fù)。Green I與DNA雙鏈結(jié)合后可以發(fā)出熒光，通過檢測PCR反應(yīng)結(jié)果中的熒光信號強(qiáng)度，使用 Microsoft Office Excel 2013 進(jìn)行分析，利用 2-△△CT法分析目的基因的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)首先使用Microsoft Office Excel 2013進(jìn)行分析，用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ ANOVA），采用*Plt;0.05、**Plt; "0.01、***Plt;0.001和****Plt;0.000 1的t檢驗方法進(jìn)行顯著性水平分析，采用Graphpad prism 7.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量輻照處理對小麥幼苗生長發(fā)育特性的影響

隨著輻照劑量增加，幼苗株高和根長都呈下降趨勢（圖1）。與對照組相比，150、250、350 Gy處理下苗高分別降低10.570%、18.400%和 "23.003%；根長分別降低1.209%、12.808%和 "13.089%。與對照組相比，250 Gy和350 Gy處理對苗長、根長、地下和地上生物量的抑制作用都達(dá)到顯著水平（Plt;0.05），而且劑量越高對小麥幼苗地上生物量的影響越大，說明輻照主要是通過抑制地上生物量而對小麥生長產(chǎn)生了抑制作用。

2.2 不同劑量輻照處理對小麥幼苗葉綠素和O-·2含量的影響

隨著輻照劑量增大，與對照組相比，150、250、350 Gy 3組處理的葉片中葉綠素a含量都顯著降低（Plt;0.05），分別降低9.65%、14.79%、 "18.40%（圖2）。隨著輻照劑量增加，幼苗葉片中O-·2含量顯著上升（Plt;0.05），輻照劑量越高組織內(nèi)活性氧物質(zhì)增加越多。

2.3 不同劑量輻照處理對小麥幼苗MDA含量、質(zhì)膜透性的影響

隨著輻照劑量增加，MDA含量也呈上升變化，但MDA含量只有350 Gy 輻照處理組較對照組有顯著的增加（Plt;0.05），說明輻照劑量增加導(dǎo)致葉片的活性氧物質(zhì)的增加，進(jìn)而引起膜脂過氧化，使MDA含量升高。

隨著輻照劑量增加，葉片質(zhì)膜透性逐漸增大。與對照組相比，250、350 Gy處理的質(zhì)膜透性都到達(dá)到顯著增加水平（Plt;0.05），150 Gy處理組電導(dǎo)率升高21.703%，但未達(dá)到顯著水平。結(jié)果表明輻照劑量升高會導(dǎo)致質(zhì)膜透性增加，在350 Gy劑量范圍內(nèi)，輻照劑量越高，細(xì)胞質(zhì)膜破壞越嚴(yán)重（圖3）。

2.4 不同劑量輻照處理對小麥幼苗保護(hù)酶活性及基因表達(dá)的影響

圖4表明，隨著輻照劑量升高，小麥葉片中SOD、POD、CAT活性均呈先升高后降低的趨勢，對應(yīng)酶基因表達(dá)也呈現(xiàn)先升高后降的變化趨勢。150、250 Gy輻照處理明顯提高了小麥葉片SOD、CAT活性以及TaSOD、TaPOD、TaCAT基因的表達(dá)水平，而高輻照劑量無促進(jìn)作用，表明在150、250 Gy輻照處理下小麥抗逆境脅迫能力有所增強(qiáng)，低輻照劑量促進(jìn)SOD、POD、CAT合成，有利于提高活性氧的清除能力。低輻照劑量下，3種抗氧化酶基因的相對表達(dá)水平升高，促進(jìn)作物產(chǎn)生抗氧化酶，以便抵抗活性氧，提高作物抗脅迫能力；高輻照劑量下，相對表達(dá)水平下降，小麥抗脅迫能力下降。

2.5 不同劑量輻照處理對小麥幼苗葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/p>

葉綠素?zé)晒鈪?shù)最大光能轉(zhuǎn)換效率值 "Fv/Fm反映了植物的潛在最大光合能力。由表2表明，輻照劑量增加，F(xiàn)0和Fv/Fm都呈下降的變化趨勢，150 Gy處理下Fm升高，250 Gy和350 Gy處理下均顯著降低，說明輻照劑量越高，對葉片光合能力的影響越大，植物受到的傷害程度 "越高。

2.6 不同劑量輻照處理對小麥光合相關(guān)基因表達(dá)的影響

在250、350 Gy輻照劑量下 TaPEPC-5、 "TaPPDK-1均明顯上調(diào)，與對照組相比，兩個基因在250 Gy處理下分別上調(diào)86.187%、 "108.300%，在350 Gy處理下分別上調(diào) "140.284%、130.884%。 "TaMDH-7在150、250 Gy輻照劑量下無明顯變化，在350 Gy下明顯上調(diào)。 "TaNADP-ME-1、 "TaRuBisco-2的表達(dá)量隨輻照劑量升高均呈先上升后降低趨勢， "TaNADP-ME-1在250 Gy處理下表達(dá)量達(dá)到最大。 "TaRuBisco-2在150 Gy處理下表達(dá)量達(dá)到最大。與對照組相比，3個處理組的 "TaNADP-ME-1分別上調(diào) "53.180%、152.484%、103.970%，在150、250 Gy處理下， "TaRuBisco-2分別上調(diào) "95.939%、 "51.347%，而在350 Gy處理下， "TaRuBisco-2下調(diào)15.735%。與對照組相比，250 Gy處理下的TaPsb27下調(diào)33.130%，而150 Gy和350 Gy處理組無明顯變化（圖5）。

3 討" 論

本研究中隨著輻照劑量的升高，小麥幼苗的苗高、根長、鮮質(zhì)量、生物量均下降，劑量越高生長受到抑制就越明顯，與王澤港等[14]在γ輻照處理小麥種子和陳金躍等[15]在γ輻照處理玉米種子的結(jié)果相似。李春牛等[16]采用60Co-γ處理茉莉花果實，結(jié)果表明高劑量輻照可使茉莉花葉片中抗氧化酶活性下降；崔玲艷等[17]采用UV-B對馬鈴薯進(jìn)行輻照，結(jié)果表明適當(dāng)增加輻射劑量提高了植株抗氧化酶活性。本研究發(fā)現(xiàn)150、250 Gy處理下抗氧化酶活性提高，而在350 Gy下抗氧化

酶活性有所下降，與崔玲艷的結(jié)果相似。梁俊青[18]報道輻照處理小麥的保護(hù)酶呈現(xiàn)先增后降的變化，也與本研究結(jié)果一致。電子束照射和60Co-γ照射對植物的誘變效果因植物種類、照射劑量和照射方式等因素而異，需要根據(jù)實際應(yīng)用和研究目的來確定具體的照射方法和照射劑量。無論采用何種照射方法，誘變育種都需要經(jīng)過多輪篩選和淘汰，以獲得符合要求的變異新品種。

葉綠素?zé)晒馓匦员挥糜谥参锕夂献饔玫难芯?，F(xiàn)v/Fm值可以反映植物的光合能力，作為研究作物生理狀況和受脅迫程度等的間接方法[19]。張婭等[20]用鈉鹽或鈣鹽單獨處理小麥幼苗葉片，F(xiàn)v/Fm值均顯著下降，而鈉鹽和鈣鹽結(jié)合處理有緩解Fv/Fm值下降的作用。本研究發(fā)現(xiàn)輻照劑量升高，F(xiàn)v/Fm值明顯下低，說明輻照劑量越高，植物所受脅迫越嚴(yán)重，與活性氧代謝失調(diào)引起的膜損傷和光合系統(tǒng)受損相關(guān)。

輻照處理下小麥葉片中 TaPEPC-5、 TaPPDK-1、 "TaMDH-7、 "TaNADP-ME-1、 "TaRuBisco-2的表達(dá)水平均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，但是輻照處理引起小麥幼苗生長能力減弱，O-·2含量增加、膜受損等變化，這些上調(diào)的光合相關(guān)基因可能與脅迫后光合能力補(bǔ)償以及光合復(fù)合體保護(hù)機(jī)制有關(guān)。但是由于輻照處理會導(dǎo)致不可逆的損傷，最終引起小麥的生長能力減弱和光合能力下降。因此，在輻射誘變育種中，篩選適宜的輻照劑量對于增加誘變頻率具有重要的理論與實踐意義。在本試驗選取的輻照劑量中，250 Gy可作為適宜的電子加速器源射線輻照小麥誘變育種的候選參考劑量。

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Effects of Electron Beam Irradiation on Wheat Growth Vigor，Photosynthetic Characteristics，and Photosynthesis and Antioxidant-related Genes’" Expression

Abstract Food safety faces significant challenges due to the rapid growth of human population，the reducion of agriculture land area，and climate change. Irradiation mutagenesis methods，such as those usingγ rays，laser，or ion beams，provide promising techniques for crop breeding.These methods are highly efficient，cost-effective，widely applicable and environmentally-friendly.In this study，electron beam irradiation was applied to wheat seeds to investigate its effects on plant growth vigor，physiology and photosynthetic and antioxidant-related gene expressions，and to determine the optimal dose of irradiation for wheat breading.The dry seeds of wheat variety ‘Pubing 151’ was exposed to three different doses of electron beam irradiation-150 Gy，250 Gy and 350 Gy by using a 10 MeV electron linac，with non-irradiated seeds as control. The effects of different irradiation doses on the growth characteristics of hydroponic wheat seedlings，such as plant height，root length，biomass，were analyzed." Chlorophyll fluorescence，，malondialdehyde（MDA） content，electrical conductivity，superoxide anion（O-·2）content，superoxide dismutase （SOD） activity，the Catalase （CAT） activity and peroxidase （POD） activity were also measured. The results showed that the seedling height，root length，biomass of wheat seedlings decreased with the increasing irradiation dose，and the growth of wheat seedlings treated with 250 Gy，and 350 Gy was inhibited significantly compared with the control seedlings （Plt;0.05）." The antioxidant enzyme activities were activated by low or middle strength irradiation. For instance，the activities of SOD and CAT in 150 Gy and 250 Gy treatments were significantly higher than the control and 350 Gy treatments （Plt;0.05），indicating that low and middle dose irradiation could increase the expression and activity of protective enzyme genes. The content of chlorophyll a and the maximum light energy conversion efficiency （Fv/Fm） significantly decreased by irradiation treatments. The content of MDA and O-·2，and the permeability of plasma membrane increased with the irradiation dose，indicating that electron beam irradiation caused the metabolic disorder related to active oxygen species. Compared with the control group，electron beam irradiation up-regulated the photosynthesis-related genes，such as "TaPEPC-5， TaPPDK-1， TaMDH-7， TaRuBisco-2， TaNADP-ME-1.This up-regulation may be related to the compensatory photosynthetic ability and the protective activity of photosynthetic apparatus.In conclusion，electron beam irradiation significantly affects the growth vigor，physiological characteristics，and expression of photosynthesis and antioxidant-related genes in wheat. High-dose irradiation not only inhibits growth and photosynthesis activity but also causes metabolic disorder involving reactive oxygen species. Therefore，optimizing radiation dose is both theoretically and practically necessary for effective radiation mutagenesis breading. Among the three doses applied in this study，250 Gy is highly recommended for wheat mutagenesis breeding.

Key words Electron beam irradiation; Mutagenesis breeding; Photosynthetic gene; Antioxidant enzyme