摘 要 為了解近年來甘肅省蘭州市犬細小病毒(Canine parvovirus,CPV)的基因型分布情況及遺傳進化方向,于蘭州市寵物醫(yī)院采集8份細小病毒陽性(試紙條檢測)的犬糞便樣品,使用F81細胞分離病毒;利用PCR、間接免疫熒光試驗、血凝試驗鑒定所分離的病毒;隨后分析病毒基因型和 "VP2基因的遺傳進化關(guān)系。結(jié)果顯示,共分離得到7株細小病毒,1株為New CPV-2a型CPV,5株為CPV-2c型CPV,1株為貓細小病毒(Feline parvovirus,F(xiàn)PV)。VP2氨基酸序列同源性及進化分析結(jié)果顯示,分離到的CPV-2c型毒株VP2同源性為100%,與北京、江蘇等地分離株的親緣關(guān)系較近;New CPV-2a型毒株與吉林、西安等地的分離株親緣關(guān)系較近;犬源貓細小病毒(LZ05)與已報道的FPV毒株相比,存在91S→A、322V→T獨特的突變,且與2020年北京一株犬源貓細小病毒分離株親緣關(guān)系最近。
關(guān)鍵詞 犬細小病毒;分離鑒定; VP2; 遺傳進化分析
犬細小病毒病的主要病原是犬細小病毒 "(Canine parvovirus,CPV),該病根據(jù)臨床表現(xiàn)分為心肌炎型、胃腸炎型和混合型[1]。其中,胃腸炎型較為多見,其臨床癥狀主要為血便、嘔吐、腸炎、脫水等[2]。犬細小病毒病的臨床發(fā)病率和死亡率極高,對寵物的健康造成了極大的威脅[3]。
CPV是細小病毒科(Parvoviridae)細小病毒屬家族(Parvovirus)的成員,為無囊膜的單股負鏈DNA病毒,病毒粒子直徑20~25 nm,呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)。病毒基因組全長4.5~5.5 kb,含有兩個開放閱讀框,ORF1和ORF2,分別編碼兩種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)和兩種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1和VP2)[4],其中,VP2是決定病毒的宿主特異性、抗原性及組織嗜性的主要蛋白,也是鑒定病毒基因型的主要靶標[5-6]。CPV-2被認為是由FPV跨種傳播而來[7],自1978年被發(fā)現(xiàn)以來,CPV-2毒株不斷進化并形成了多個亞型[6],包括CPV-2a、CPV-2b、New CPV-2a、New CPV-2b、CPV-2c。近年來,CPV-2c毒株迅速席卷世界各國,成為許多國家和地區(qū)CPV的主要流行毒株[8],不同地區(qū)的CPV-2c毒株在進化過程中形成了不同的分支,如亞洲/歐洲/美洲CPV-2c亞型。2018年以來,CPV-2c毒株在中國多地迅速流行,正在逐步替代CPV-2a和CPV-2b型毒株,成為國內(nèi)的主要流行毒株[1-9]。
預(yù)防犬細小病毒病的方式主要為疫苗接種,大多數(shù)CPV商品化疫苗是用CPV-2毒株制備;然而,由于免疫覆蓋率低、病毒變異、免疫程序不完善等原因,臨床上犬細小病毒病的發(fā)病率仍居高不下[10-11]。因此對臨床犬細小病毒進行分離鑒定及分子流行病學(xué)分析十分必要。本研究收集蘭州市寵物醫(yī)院細小病毒陽性犬的糞便樣品,分離鑒定樣品中的細小病毒毒株,并對分離株的VP2蛋白進行遺傳進化分析,以期明確蘭州市犬細小病毒的流行情況和分子特征,為犬細小病毒病的預(yù)防和疫苗的研制提供參考。
1 材料與方法
1.1 材" 料
1.1.1 樣本的采集與細胞系 2021年7月-2022年7月,從蘭州市 5 家寵物醫(yī)院(城關(guān)區(qū)1 家,七里河區(qū)2 家,安寧區(qū)1 家,西固區(qū)1 家)采集細小病毒陽性(試紙條檢測)犬的糞便樣品,放在滅菌過的 2 mL EP管中,封口,標記采樣日期、發(fā)病動物品種等信息,-20 ℃冰箱保存。
貓腎傳代細胞系(F81)購自中國科學(xué)院上海細胞庫,并由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)實驗室保存。
1.1.2 主要試劑 MEM-Alpha培養(yǎng)基、胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品,青霉素-鏈霉素溶液購自賽默飛世爾科技公司;病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司;引物由擎科生物科技有限公司合成;2×Taq PCR Master Mix購自Takara生物技術(shù)有限公司;抗細小病毒犬源單克隆抗體由蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室與甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物與免疫實驗室聯(lián)合制備并保存;FITC標記的山羊抗犬IgG抗體為Bio-Rad公司產(chǎn)品;DAPI溶液購自Solarbio生物科技有限公司。
1.2 方" 法
1.2.1 樣品處理 向采集的糞便樣品中加入2 mL無菌PBS,37 ℃震蕩10~20 min;4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min,取1 mL上清于滅菌EP管中,加等量氯仿,充分震蕩1 min;12 000" "r/min離心10 min,取上清轉(zhuǎn)移至無菌EP管中,按照500 U/mL的濃度加入雙抗(青霉素-鏈霉素),37 ℃作用2~3 h,用0.22 μm濾器過濾后保存于-80 ℃冰箱,備用。
1.2.2 病毒的分離培養(yǎng) F81細胞傳代培養(yǎng),待其貼壁后,用PBS清洗一遍,加1 mL無血清MEM-α培養(yǎng)基,再加入100 μL處理后的樣品,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h,每間隔10 min輕輕晃動一次;2 h后棄上清,補加細胞維持液(含3%胎牛血清),同時設(shè)立不接毒的細胞對照,每天觀察細胞生長狀態(tài)及病變情況。當細胞病變達到80%以上時,收取細胞培養(yǎng)物;72 h仍未出現(xiàn)病變的,于72 h收取細胞培養(yǎng)物。 "-80 ℃冰箱反復(fù)凍融3次后,4 ℃、12 000 r/min離心 "8 min,收集上清液。用以上方法盲傳3代后進行PCR鑒定,選擇CPE明顯且PCR檢測結(jié)果為陽性的,繼續(xù)傳代3次后做進一步鑒定。
1.2.3 PCR鑒定 根據(jù)參考文獻[12]合成犬、貓細小病毒通用鑒定引物及 "VP2全長基因的擴增引物。提取第3代病毒培養(yǎng)物的DNA,用鑒定引物進行PCR檢測。反應(yīng)體系為:模板DNA" "2 μL,上、下游引物各1 μL,2×Taq PCR Master Mix 25 μL,ddH2O補至50 μL。反應(yīng)程序為: "95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性15 s,56 ℃退火 "15 s,72 ℃延伸1 min,共35個循環(huán);72 ℃延伸 "5 min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。
1.2.4 血凝(HA)試驗 采集新鮮抗凝豬血,處理后制備1%豬紅細胞懸液。在96孔V型血凝板中加入25 μL待檢病毒液,并連續(xù)2倍倍比稀釋,最后一孔作為陰性對照;然后每孔再加入 "25 μL 1.0%豬紅細胞懸液,振蕩混勻1 min,室溫反應(yīng)30 min后觀察結(jié)果。以出現(xiàn)50%凝集病毒液的最大稀釋倍數(shù)作為該病毒的血凝效價,血凝效價低于1∶8的,判定為陰性,等于或者高于 "1∶8的,則判定為陽性[11]。
1.2.5 間接免疫熒光試驗(IFA) 消化后的F81細胞接種于24孔板(每孔約5.0×103個細胞),將病毒液10倍稀釋后,按照每孔400 μL同步接毒,同時設(shè)陰性對照。37 ℃細胞培養(yǎng)箱孵育36 h后,棄上清,用-20 ℃預(yù)冷的甲醇∶丙酮 "(1∶1)固定液,室溫下固定20 min。用PBS洗細胞3次,按5 μg·mL-1濃度加入抗細小病毒犬源單克隆抗體(該抗體通過單個B細胞抗體技術(shù)制成,經(jīng)驗證可以與CPV和FPV發(fā)生特異性反應(yīng)),37 ℃孵育1 h,PBS洗細胞3次,然后加入FITC標記的山羊抗犬IgG抗體(1∶1 000稀釋),37 ℃孵育1 h,用PBS洗細胞4次,DAPI 溶液孵育10 min,PBS浸洗4次,在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
1.2.6 ""VP2全長擴增及測序 取200 μL病毒液,提取DNA后,以病毒DNA為模板,PCR擴增 "VP2全長。具體反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同 "“1.2.3”,退火溫度為58 ℃。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測,將擴增結(jié)果為陽性的PCR產(chǎn)物送至愛基百客(武漢)生物科技有限公司進行測序。
1.2.7 VP2氨基酸序列同源性分析 運用SnapGene軟件對測序結(jié)果進行拼接,將獲得的 "VP2基因序列與NCBI上已公布的CPV標準毒株(登錄號:M38245、M24003、MN451666、EF599098、AY742955、GU380303),CPV疫苗株(登錄號:FJ011098、FJ97847);FPV標準毒株(登錄號:EU659111),F(xiàn)PV疫苗株(登錄號:EU498681、EU498680)及72株國內(nèi)外不同基因型的CPV分離株進行比對分析。運用DNAStar程序分析所分離毒株的基因型、氨基酸序列同源性及變異情況,用MEGA 7.0 Neighbor-joining程序(參數(shù)設(shè)置為1 000 replications)繪制系統(tǒng)進化樹并用iTOL程序進行修飾。
2 結(jié)果與分析
2.1 病毒的分離培養(yǎng)
1~8號陽性樣品經(jīng)處理后接種于F81細胞,盲傳3代。除6號樣品外,其余7個樣品接種細胞后,細胞均在48 h內(nèi)出現(xiàn)皺縮、變形(兩端呈絲狀)、脫落等細胞病變效應(yīng)(圖1)。
2.2 PCR鑒定結(jié)果
提取第3代病毒培養(yǎng)液的DNA,用犬、貓細小病毒通用鑒定引物進行PCR檢測(圖2)。除6號樣品外,以其他樣品DNA為模板均能擴增出大小為451 bp左右的陽性條帶,且陰性對照無條帶。將這些毒株分別命名為LZ01、LZ02、LZ03、LZ04、LZ05、LZ07、LZ08。
2.3 血凝試驗結(jié)果
將第6代病毒培養(yǎng)液與1.0%的新鮮豬紅細胞懸液進行微量血凝試驗(表1),這些毒株血凝效價為1∶23~1∶27,其中LZ04分離株的凝集價最高。
2.4 間接免疫熒光試驗結(jié)果
將第6代細胞培養(yǎng)物同步接種F81細胞 "36 h后,用間接免疫熒光方法鑒定分離毒株。熒光顯微鏡下可見細胞核經(jīng)DAPI染色呈藍色,接毒細胞呈綠色熒光(圖3),證實分離的病毒為細小病毒。
2.5 "VP2全長擴增結(jié)果
PCR擴增細小病毒分離株的 "VP2基因全長,結(jié)果如圖4所示,從7個病毒分離株中均可擴增出2 177 bp大小的目的片段。經(jīng)測序、拼接后將序列上傳至NCBI,5株CPV-2c、1 株New CPV-2a和1 株犬源FPV毒株的 "VP2序列的登錄號分別為OQ869252、OQ869253和OQ869254。
2.6 毒株基因型分析
使用Snap gene和MEGA 7.0軟件分析 "VP2基因測序結(jié)果,參照標準毒株和文獻[13],根據(jù)VP2蛋7白14 個關(guān)鍵氨基酸位點對分離的細小病毒株進行基因型鑒定。結(jié)果顯示(表2),分離到的7 株細小病毒中,1 株為New CPV-2a型毒株,5 株為CPV-2c型毒株。LZ05毒株的 "VP2關(guān)鍵氨基酸位點均與FPV一致,因此判定為FPV毒株。LZ01/LZ03/LZ04/LZ07/LZ08與CPV標準株相比均發(fā)生5G→A,370R→Q的突變;LZ05與其他FPV分離株相比發(fā)生91S→A、322V→T的突變。
2.7 VP2氨基酸序列同源性分析
使用DNAStar軟件對犬、貓細小病毒 "VP2基因的氨基酸序列進行同源性分析,結(jié)果顯示(圖5),6株CPV分離株與CPV標準株氨基酸序列同源性為98.1%~99.7%,與CPV疫苗株氨基酸序列同源性為97.4%~98.1%;本次所分離到的5株CPV-2c型毒株(LZ01/LZ03/LZ04/LZ07/LZ08)的氨基酸序列同源性為100%;犬源FPV毒株(LZ05)與FPV標準株氨基酸序列同源性為99.7%,與FPV疫苗株氨基酸序列同源性為99.1%~99.3%,與中國北京、越南、泰國、埃及及意大利等地區(qū)犬源FPV氨基酸序列同源性為99.5%~99.7%。
2.8 VP2遺傳進化分析
VP2氨基酸序列遺傳進化樹分析可見(圖 6),CPV與FPV分為兩個不同的類群,且CPV在進化過程中具有明顯的地域性。本次分離得到的這 6 株CPV分離株均屬于由中國、韓國、越南等地分離株組成的亞洲地區(qū)分離株群體。LZ02位于New CPV-2a亞群中,與2017年浙江(ZJ1579),2021年吉林(YBWQ)、江蘇(JSYZ-93)、西安(XA-newCPV2a-0-2)及印度的分離株(PFA1)親緣關(guān)系較近;LZ01/LZ03/LZ04/LZ07/LZ08均屬于亞洲CPV-2c亞群,與2017年廣西(CPV-GX1581),2019年江蘇(CN/JS1707),2022年北京(CPV-BJ-C10、CPV-BJ-C3)及 2020 年韓國分離株(K01708-1)的親緣關(guān)系較近,此分支還包括2017年蘭州的一個分離株(CPV/canine/LZ/2/2017),但與其親緣關(guān)系較遠;此外,本次分離到的犬源FPV毒株(LZ05)與2021年中國北京分離到的犬源FPV毒株(2020/1)親緣關(guān)系最近,但是屬于不同的分支,與其他國家犬源FPV分離株親緣關(guān)系較遠,與疫苗株屬于不同類群。[FL)]
3 討" 論
自2010年在中國吉林省首次發(fā)現(xiàn)以來,CPV-2c型毒株在中國的檢出率呈上升趨勢。據(jù)報道,目前在吉林[14]、江蘇、上海、浙江[15]、合肥[16]等地,CPV-2c毒株已經(jīng)取代CPV-2a和CPV-2b,成為主要毒株類型。本次從蘭州市7份CPV陽性犬糞便樣品中分離到5株CPV-2c亞型毒株,表明CPV-2c亞型毒株正在逐漸取代CPV-2a/2b亞型,成為蘭州市寵物犬中的主要流行毒株,這與中國CPV毒株的主要流行趨勢一致。此外,與經(jīng)典毒株序列相比,本次CPV-2c分離株VP2氨基酸序列有兩個突變位點:第5位G→A、第370位R→Q,這兩位點的突變在國內(nèi)多個分離株中均有報道,被認為是亞洲CPV-2c亞型的獨特位點[17],也是亞洲和歐洲CPV-2c亞群的關(guān)鍵差異位點。
VP2氨基酸序列同源性分析結(jié)果顯示,本研究分離到的6株CPV毒株與CPV-2疫苗株氨基酸序列同源性較低,說明疫苗對目前蘭州市流行毒株的保護效力需要重新評估。本次分離的New CPV-2a型毒株(LZ02)與吉林、江蘇、西安等地的分離株親緣關(guān)系較近,且屬于同一分支,說明其可能有共同的起源;5株CPV-2c型毒株VP2序列完全一致,且與中國的廣西、江蘇、北京分離株以及韓國的K01708-1分離株的親緣關(guān)系較近,說明其可能具有相同的進化方式。此外,本次獲得的分離株的VP2序列與2017年蘭州分離株LZ/2/2017親緣關(guān)系較遠,說明近幾年蘭州地區(qū)CPV流行毒株已經(jīng)發(fā)生了較大的變異。
值得注意的是,本研究在犬的糞便中分離到一株FPV毒株,這種現(xiàn)象在巴基斯坦[18]、泰國[19-20]、越南[21]、埃及[22]以及中國北京[1]均有相應(yīng)報道。該毒株VP2氨基酸序列與FPV標準毒株及其他犬源FPV相比,發(fā)生了91S→A、322V→T的突變,其蛋白功能是否發(fā)生改變,是否能夠同時感染犬和貓,以及跨物種傳播的原因,還有待后續(xù)研究證實。VP2氨基酸序列遺傳進化樹顯示,其與中國北京犬源FPV(2020/1)毒株親緣關(guān)系最近,推測可能由北京分離株進化而來。近幾年頻繁從犬類糞便中分離或檢測到FPV,這可能與犬的食糞行為有關(guān)[1],也可能由于某些突變,使FPV的宿主范圍擴大,對犬類健康構(gòu)成了新的威脅。因此,需要提高對這一現(xiàn)象的重視,并加強對細小病毒的分子監(jiān)測。
綜上所述,蘭州市犬CPV-2c亞型毒株感染持上升趨勢,且其VP2氨基酸序列與國內(nèi)主要流行毒株有較高的同源性。此外,本研究還從犬糞便樣品中分離得到一株FPV,表明犬/貓細小病毒存在著混合或交叉感染的現(xiàn)象。隨著CPV的傳播以及 "VP2基因的不斷變異,未來可能會出現(xiàn)新的毒株,這對目前所用疫苗的有效性構(gòu)成新的挑戰(zhàn)。因此,做好CPV的分子流行病學(xué)監(jiān)測對于預(yù)測該病的發(fā)展以及開發(fā)更有效的疫苗或診斷試劑至關(guān)重要。
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Isolation,Identification of Parvovirus from Canine in Lanzhou and Phylogeny Analysis of" VP2 Gene Sequences
Abstract To investigate the genotype distribution and genetic evolution of canine parvovirus (CPV) in Lanzhou in recent years, eight fecal samples tested positive" using a canine parvovirus rapid test kit were collected from pet hospitals in Lanzhou. F81 cells were used for isolating parvovirus strains; PCR,indirect immunofluorescence and hemagglutination assays were conducted to identify the isolated strains;" additionally,the genotype and genetic evolution relationship were analyzed. The results showed that seven parvovirus strains were isolated,one strain belonged to" the New CPV-2a type,five strains were classified as CPV-2c type,and one strain was identified as Feline parvovirus (FPV). The homology of amino acid sequences and evolutionary analysis showed that the VP2" sequences of these CPV-2c strain was 100% homologous and closely related to the strains found in Beijing and Jiangsu. The New CPV-2a strain exhibited similarities to those found in Jilin and Xi’an. Compared with the reported strains,F(xiàn)PV of canine origin (LZ05) had unique mutations (91S→A and 322V→T),and was found to be" most closely related to a strain isolated in Beijing in 2020.
Key words Canine parvovirus; Isolation and identification; "VP2;Genetic evolutionary analysis