大腸桿菌L-乳酸工程菌消除外源D-乳酸以提高光學(xué)純度的研究

摘要：L-乳酸的同分異構(gòu)體D-乳酸會(huì)引起代謝性酸中毒、腸道屏障受損或其他未知的危害，因此需要減少用作食品酸味劑的L-乳酸中的D-乳酸含量。該研究通過(guò)加入硝酸鈉以加強(qiáng)大腸桿菌L-乳酸工程菌在厭氧條件下對(duì)外源D-乳酸的消除；同時(shí)敲除L-乳酸脫氫酶基因（lldD基因、ykgEFG基因）以降低其對(duì)L-乳酸的消耗。搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)證明，敲除L-乳酸脫氫酶基因的工程菌HBUT-LB，在添加20 mmol/L硝酸鈉后，可有效清除1 g/L的外源性D-乳酸。在7 L發(fā)酵罐中利用含有D-乳酸的廉價(jià)原料進(jìn)行發(fā)酵，添加20 mmol/L硝酸鈉相對(duì)于未添加硝酸鈉，工程菌HBUT-LB的D-乳酸消耗速率提高460%，L-乳酸的光學(xué)純度從99.32%提升到99.99%。同時(shí)，最終發(fā)酵液中無(wú)硝酸鈉與亞硝酸鈉殘留。結(jié)果表明，大腸桿菌工程菌HBUT-LB在發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)添加硝酸鈉，可有效消除外源D-乳酸，提高L-乳酸的光學(xué)純度，具有精制超高光學(xué)純度L-乳酸的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：L-乳酸的光學(xué)純度；L-乳酸脫氫酶基因；硝酸鈉

中圖分類號(hào)：TS202.3""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號(hào)：1000-9973（2024）12-0179-06

Study on Elimination of Exogenous D-Lactic Acid by Escherichia coli L-Lactic

Acid Engineering Bacteria for Improving Optical Purity

YU Jie1， MAIREHABA·Yusufu1， WANG Jin-hua1，2，3， WANG Yong-ze1，2，3，

GAO Wa1，2，3， ZHAO Xiao1，2，3*

（1.School of Life and Health Sciences， Hubei University of Technology， Wuhan 430068， China; 2.Key

Laboratory of Fermentation Engineering， Ministry of Education， Hubei University of Technology，

Wuhan 430068， China; 3.Cooperative Innovation Center for Industrial Fermentation

Co-constructed by Ministry of Education and Hubei Province， Hubei

University of Technology， Wuhan 430068， China）

Abstract： D-lactic acid， an isomer of L-lactic acid， can cause metabolic acidosis， intestinal barrier damage or other unknown hazards， so there is a need to reduce the amount of D-lactic acid in L-lactic acid used as a food acidifier. In this study， the sodium nitrate is added to enhance the elimination of exogenous D-lactic acid by Escherichia coli L-lactic acid engineering bacteria under anaerobic conditions as well as the deletion of L-lactate dehydrogenase genes （lldD gene，ykgEFG gene） to reduce their consumption of L-lactic acid.Through shaking flask fermentation experiment， it is proven that the engineering bacterium HBUT-LB， which has knocked out the L-lactate dehydrogenase gene， can effectively remove 1 g/L exogenous D-lactic acid after adding 20 mmol/L sodium nitrate.Fermentation is carried out in a 7 L fermenter using inexpensive raw materials containing D-lactic acid. The consumption rate of D-lactic acid increases by 460% with adding 20 mmol/L sodium nitrate compared to without adding sodium nitrate， and

the optical purity of L-lactic acid increases from 99.32% to 99.99% in the engineering bacterium HBUT-LB. At the same time， there is no sodium nitrate and sodium nitrite residue in the final fermentation broth. The results show that the addition of sodium nitrate during the fermentation with engineering strain HBUT-LB can effectively eliminate the exogenous D-lactic acid， improve the optical purity of L-lactic acid， which has industrial application value in refining L-lactic acid with ultra-high optical purity.

Key words： optical purity of L-lactic acid; L-lactate dehydrogenase gene; sodium nitrate

收稿日期：2024-06-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（31501677）；教育部工業(yè)發(fā)酵省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心2023年開(kāi)放基金（4303-00149）；企業(yè)合作項(xiàng)目（2022101（1））

作者簡(jiǎn)介：余杰（1999—），男，碩士研究生，研究方向：生物工程。

*通信作者：趙筱（1982—），女，講師，博士，研究方向：微生物遺傳改造和發(fā)酵。

L-乳酸作為一種食品添加劑，被廣泛應(yīng)用于調(diào)味品、酸奶制品等食品中。它可以增加食品的口感，延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期，具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，需要注意的是，L-乳酸的同分異構(gòu)體D-乳酸對(duì)人體有一定的毒性。長(zhǎng)期攝入D-乳酸可能會(huì)導(dǎo)致腸道屏障受損、代謝性酸中毒或其他未知的危害。因此，在使用L-乳酸作為食品添加劑時(shí)，需盡量減少D-乳酸的含量，從而保證食品的安全和品質(zhì)［1-2］。

工業(yè)發(fā)酵L-乳酸時(shí)，可通過(guò)以下途徑提高L-乳酸的純度。對(duì)于不存在D-乳酸生產(chǎn)途徑的菌株，如芽孢桿菌、米根霉等，主要通過(guò)減少發(fā)酵過(guò)程中如丙酮酸、琥珀酸等副產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而提高其化學(xué)純度，即提高L-乳酸的純度［3-4］；對(duì)于存在D-乳酸生產(chǎn)途徑的菌株，如大腸桿菌、鼠李糖乳桿菌等，在減少副產(chǎn)物產(chǎn)生的同時(shí)，還需通過(guò)減少D-乳酸的生產(chǎn)途徑以減少D-乳酸產(chǎn)生，從而提高L-乳酸的純度［5-6］。以上兩種策略主要針對(duì)降低菌株自身代謝時(shí)產(chǎn)生的副產(chǎn)物，但沒(méi)有考慮到發(fā)酵過(guò)程中若摻雜外源D-乳酸從而影響L-乳酸光學(xué)純度的情況，同時(shí)也鮮有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道針對(duì)此類問(wèn)題的解決方案。在工業(yè)化同型發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸時(shí)，通常使用玉米漿、葡萄糖結(jié)晶廢糖液等廉價(jià)原料作為發(fā)酵原料［7-9］。如果保存條件不佳，這些原料中就會(huì)有少量D-乳酸，從而影響最終發(fā)酵產(chǎn)物L(fēng)-乳酸的光學(xué)純度。

大腸桿菌具有天然利用乳酸為碳源的能力，由dld基因編碼的D-乳酸脫氫酶是一種FAD依賴性外周膜脫氫酶，能將D-乳酸催化為丙酮酸［10］。由lldD基因編碼的L-乳酸脫氫酶是一種FMN依賴性膜相關(guān)脫氫酶，能催化L-乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸［11］。在這兩個(gè)過(guò)程中，都需要末端電子受體使FAD和FMN再生。因此，在利用大腸桿菌工程菌進(jìn)行L-乳酸發(fā)酵時(shí)，加入末端電子受體有利于D-乳酸的轉(zhuǎn)化。有文獻(xiàn)顯示大腸桿菌的ykgEFG基因的低拷貝表達(dá)可恢復(fù) Δdld-Ⅱ ΔlldF缺失突變株（Shewanella oneidensis）在L-乳酸上的生長(zhǎng)，推測(cè)ykgEFG基因可能與L-乳酸代謝相關(guān)［12］。在發(fā)酵過(guò)程中，為避免L-乳酸被消耗，需要敲除代謝L-乳酸的相關(guān)基因（lldD、ykgEFG）。

本研究在大腸桿菌L-乳酸工程菌發(fā)酵過(guò)程中加入硝酸鈉，旨在提高其在厭氧環(huán)境下對(duì)D-乳酸的轉(zhuǎn)化能力。同時(shí)，敲除L-乳酸脫氫酶相關(guān)基因（lldD基因、ykgEFG基因）以減少硝酸鈉對(duì)L-乳酸消耗的影響，進(jìn)一步考察硝酸鈉對(duì)大腸桿菌工程菌發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的光學(xué)純度的影響，為生產(chǎn)高純度L-乳酸提供了有力的支持。該研究對(duì)于提高發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中的效率和產(chǎn)物質(zhì)量具有重要的實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒、引物

出發(fā)菌株為大腸桿菌工程菌HBUT-L（ΔfrdBC、ΔadhE、ΔpflB、ΔldhA：：ldhL）、質(zhì)粒pSIM6、質(zhì)粒pKD4，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

實(shí)驗(yàn)所需引物見(jiàn)表1。

1.1.2 試劑與設(shè)備

Taq Master Mix酶：南京諾唯贊生物科技股份有限公司；玉米漿與葡萄糖結(jié)晶廢糖液：濰坊盛泰藥業(yè)有限公司。

PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司；Sartorius BB-8846880賽多利斯發(fā)酵罐 Sartorius Stedim Biotech公司；Waters e2695高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

氨芐篩選平板：含50 mg/L氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基；卡那篩選平板：含50 mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基：含20 g/L葡萄糖的NBS培養(yǎng)基［13］；廉價(jià)原料發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿與葡萄糖結(jié)晶廢糖液的混合液。

1.2 方法

1.2.1 工程菌HBUT-LA的構(gòu)建與驗(yàn)證

1.2.1.1 打靶片段的制備與純化

為了獲得帶有Kan基因的片段，使用質(zhì)粒pKD4為模板，并通過(guò)P1和P2進(jìn)行Polymerase Chain Reaction （PCR）。

1.2.1.2 lldD基因的敲除與驗(yàn)證

通過(guò)CaCl2法將質(zhì)粒pSIM6轉(zhuǎn)化到菌株HBUT-L上，通過(guò)氨芐篩選平板篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子HBUT-L/pSIM6［14-15］。在誘導(dǎo)出Red重組所需蛋白質(zhì)后，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化法使打靶片段進(jìn)入菌體內(nèi)，待培養(yǎng)3 h后，涂布于卡那篩選平板中培養(yǎng)［16］。用引物P3和P4、P5和P6，通過(guò)PCR法進(jìn)行驗(yàn)證，若無(wú)lldD基因則命名為HBUT-LA。

1.2.2 工程菌HBUT-LB的構(gòu)建與驗(yàn)證

利用引物P7和P8進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到打靶片段，在工程菌HBUT-LA的基礎(chǔ)上敲除ykgEFG基因，并通過(guò)P9和P10、P11和P12進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若無(wú)ykgEFG基因則命名為HBUT-LB。

1.2.3 基因缺陷型菌株的發(fā)酵驗(yàn)證

在250 mL搖瓶中，以菌株HBUT-L、HBUT-LA、HBUT-LB為發(fā)酵菌株，以20 g/L葡萄糖、1 g/L酵母粉為碳、氮源，在37 ℃、150 r/min條件下進(jìn)行厭氧發(fā)酵，檢測(cè)發(fā)酵液的L-乳酸的產(chǎn)量。

1.2.4 外源添加黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）對(duì)菌株HBUT-LB轉(zhuǎn)化D-乳酸影響的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

在50 mL搖瓶中，以菌株HBUT-LB為發(fā)酵菌株，以20 g/L葡萄糖、1 g/L D-乳酸為碳源，1 g/L酵母粉為氮源，另外添加15 mmol/L黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD），在37 ℃、150 r/min條件下進(jìn)行厭氧發(fā)酵，檢測(cè)發(fā)酵液中的D-乳酸含量。

1.2.5 不同末端電子受體對(duì)菌株HBUT-LB轉(zhuǎn)化D-乳酸影響的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

在250 mL搖瓶中，以菌株HBUT-LB為發(fā)酵菌株，以20 g/L葡萄糖、1 g/L D-乳酸鈉為碳源，1 g/L酵母粉為氮源，另外分別添加20 mmol/L二甲基亞砜、富馬酸鈉、硝酸鈉作為末端電子受體進(jìn)行厭氧發(fā)酵，檢測(cè)發(fā)酵液中的L-乳酸的產(chǎn)量和D-乳酸的含量。

1.2.6 硝酸鈉對(duì)菌株HBUT-L、HBUT-LA、HBUT-LB的影響

在250 mL搖瓶中，以菌株HBUT-L、HBUT-LA、HBUT-LB為發(fā)酵菌株，以20 g/L葡萄糖、1 g/L D-乳酸鈉為碳源，1 g/L酵母粉為氮源，通入過(guò)濾除菌后的CO2氣體5 min以除去發(fā)酵罐中的氧氣，保證厭氧環(huán)境，添加20 mmol/L的硝酸鈉，在37 ℃、150 r/min條件下進(jìn)行厭氧發(fā)酵，并檢測(cè)發(fā)酵液中L-乳酸的產(chǎn)量和D-乳酸的含量。

1.2.7 最適硝酸鈉濃度的探究

在250 mL搖瓶中，以菌株HBUT-LB為發(fā)酵菌株，以20 g/L葡萄糖、1 g/L D-乳酸鈉為碳源，1 g/L酵母粉為氮源，在37 ℃、150 r/min條件下，加入不同濃度的硝酸鈉（0，10，20，30，40，50 mmol/L）進(jìn)行厭氧發(fā)酵并檢測(cè)發(fā)酵液中OD600值、L-乳酸的產(chǎn)量和D-乳酸的含量。

1.2.8 菌株HBUT-LB利用廉價(jià)原料的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

廉價(jià)原料的保存處置：取玉米漿和葡萄糖結(jié)晶廢糖液，均在不同條件下（常溫潮濕處、低溫干燥處）放置6個(gè)月后，測(cè)定其中L-乳酸的產(chǎn)量和D-乳酸的含量。

在7 L發(fā)酵罐中，以菌株HBUT-LB為發(fā)酵菌株，以常溫潮濕條件下處理6個(gè)月后的10 g/L玉米漿和含100 g/L葡萄糖的葡萄糖結(jié)晶廢糖液為碳、氮源，通入過(guò)濾除菌后的CO2氣體5 min以除去發(fā)酵罐中的氧氣，保證厭氧環(huán)境，在37 ℃、150 r/min條件下，裝液量為4 L，中和劑為23% Ca（OH）2，添加20 mmol/L硝酸鈉，進(jìn)行厭氧發(fā)酵并檢測(cè)發(fā)酵液中L-乳酸的產(chǎn)量和D-乳酸的含量。

1.2.9 分析與檢測(cè)

L-乳酸、D-乳酸［17］：采用液相色譜法檢測(cè)。檢測(cè)條件：Waters液相色譜儀；Sumichiral OA-5000L手性色譜柱；流動(dòng)相：0.2 mmol/L H2SO4（溶劑：5% IPA）；PDA檢測(cè)器；波長(zhǎng)250 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流速0.5 mL/min。

硝酸鹽、亞硝酸鹽：檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)［18］。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因敲除的驗(yàn)證

敲除lldD基因的電泳圖見(jiàn)圖1。

理論上泳道1出現(xiàn)條帶大小為526 bp，泳道2，3無(wú)條帶出現(xiàn)，泳道4出現(xiàn)條帶大小為849 bp。由圖1可知，理論與結(jié)果一致，表明lldD基因敲除成功。

敲除ykgEFG基因的電泳圖見(jiàn)圖2。

理論上泳道1出現(xiàn)條帶大小為2 917 bp，泳道2，3無(wú)條帶出現(xiàn)，泳道4出現(xiàn)條帶大小為588 bp。由圖2可知，理論與結(jié)果一致，表明ykgEFG基因敲除成功。

2.2 基因缺陷型菌株的發(fā)酵驗(yàn)證

探究了lldD基因、ykgEFG基因?qū)-乳酸的產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，菌株HBUT-L、HBUT-LA、HBUT-LB均在36 h達(dá)到最大的L-乳酸產(chǎn)量，分別為16.9，17.8，18.5 g/L。在L-乳酸產(chǎn)量方面，菌株HBUT-LB相比于菌株HBUT-LA提高了3.93%，相比于菌株HBUT-L提高了9.47%，菌株HBUT-LA相對(duì)于菌株HBUT-L提高了5.33%。發(fā)酵結(jié)果表明，敲除lldD基因、ykgEFG基因后能減少L-乳酸的消耗［19-20］。

2.3 外源添加黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）對(duì)菌株HBUT-LB轉(zhuǎn)化D-乳酸影響的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

為了探究是否是D-乳酸脫氫酶（dld）的輔基FAD限制了D-乳酸的轉(zhuǎn)化效率，通過(guò)外源添加FAD，考察菌株轉(zhuǎn)化D-乳酸的效率是否與FAD有關(guān)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，當(dāng)未添加FAD時(shí)，菌株僅消耗了0.21 g/L D-乳酸，L-乳酸的產(chǎn)量為18.4 g/L；當(dāng)加入15 mmol/L FAD時(shí)，菌株基本能消耗完1 g/L D-乳酸，相對(duì)于未添加FAD提高了376%，L-乳酸的產(chǎn)量為19.1 g/L。結(jié)果表明，F(xiàn)AD限制了D-乳酸的轉(zhuǎn)化。

2.4 不同末端電子受體對(duì)菌株HBUT-LB轉(zhuǎn)化D-乳酸影響的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

為了降低工業(yè)發(fā)酵的成本，通過(guò)加入末端電子受體以實(shí)現(xiàn)FAD的循環(huán)再生。大腸桿菌中常用的末端電子受體為氧氣、二甲基亞砜、富馬酸鈉、硝酸鈉。由于L-乳酸的發(fā)酵大多處于厭氧環(huán)境，因此不選擇以氧氣作為末端電子受體。將菌株HBUT-LB在各種末端電子受體下進(jìn)行厭氧發(fā)酵，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，當(dāng)以富馬酸鈉為末端電子受體時(shí)，D-乳酸基本未被消耗，推測(cè)原因?yàn)榫闔BUT-LB已敲除富馬酸還原酶基因（frdBC），從而導(dǎo)致菌株無(wú)法以富馬酸鈉作為末端電子受體。當(dāng)以二甲基亞砜與硝酸鈉作為末端電子受體時(shí)，菌株基本消耗完1 g/L D-乳酸。當(dāng)以硝酸鈉作為末端電子受體時(shí)，L-乳酸的生產(chǎn)速率相比于以二甲基亞砜作為末端電子受體時(shí)提高了20.50%。因此，選用硝酸鈉作為末端電子受體。

2.5 硝酸鈉對(duì)菌株HBUT-L、HBUT-LA、HBUT-LB發(fā)酵的影響

通過(guò)搖瓶實(shí)驗(yàn)探究了硝酸鈉對(duì)菌株HBUT-L、HBUT-LA、HBUT-LB轉(zhuǎn)化外源D-乳酸及生產(chǎn)L-乳酸的影響，結(jié)果見(jiàn)表3和圖5。

由表3和圖5可知，當(dāng)未加入硝酸鈉時(shí)，菌株HBUT-L、HBUT-LA、HBUT-LB均未消耗完D-乳酸。當(dāng)加入硝酸鈉時(shí)，3株菌株均在30 h時(shí)消耗完1 g/L D-乳酸，說(shuō)明加入硝酸鈉能有效提高L-乳酸工程菌對(duì)D-乳酸的轉(zhuǎn)化。另外，在L-乳酸產(chǎn)量方面，出發(fā)菌株降低了16.48%，菌株HBUT-LA提升了2.21%，菌株HBUT-LB提升了2.70%。菌株HBUT-LA相對(duì)于出發(fā)菌株提升了25.85%，菌株HBUT-LB相對(duì)于出發(fā)菌株提升了29.25%，說(shuō)明通過(guò)敲除lldD和ykgEFG基因可避免在有電子受體的情況下L-乳酸被轉(zhuǎn)化，從而保證其終產(chǎn)量。

2.6 最適硝酸鈉濃度的探究

通過(guò)梯度實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株HBUT-LB厭氧發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸時(shí)添加的硝酸鈉濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6可知，添加不同濃度的硝酸鈉（10～50 mmol/L）均可有效消除1 g/L D-乳酸。最適的硝酸鈉濃度為20 mmol/L，此時(shí)菌株的最大OD600值、L-乳酸的生產(chǎn)速率分別為4.89， 0.633 g/（L·h），相比于未加入硝酸鈉時(shí)分別提高了5.39%、20.11%。隨著硝酸鈉濃度的增加，菌株的生長(zhǎng)、L-乳酸的生產(chǎn)速率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，推測(cè)原因是硝酸鈉濃度高于6 mmol/L時(shí)轉(zhuǎn)化為亞硝酸鈉后，亞硝酸會(huì)逐漸積累，亞硝酸鈉濃度高于12 mmol/L后會(huì)抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)［21-23］。

2.7 菌株HBUT-LB利用廉價(jià)原料的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證工業(yè)生產(chǎn)中因?qū)Πl(fā)酵原料的保存條件不良而導(dǎo)致其中D-乳酸含量發(fā)生變化的情況，對(duì)玉米漿和葡萄糖結(jié)晶廢糖液進(jìn)行不同條件的保存處理，見(jiàn)表4。

由表4可知，常溫潮濕處保存相比于低溫干燥處保存，玉米漿中D-乳酸含量由0.908%提高到1.404%，L-乳酸含量由0.268%提高到4.264%，葡萄糖結(jié)晶廢糖液D-乳酸含量由0.148%提高到0.902%，L-乳酸含量由0.008%提高到0.144%，說(shuō)明廉價(jià)發(fā)酵原料在保存時(shí)，常溫潮濕的環(huán)境相比于低溫干燥的環(huán)境更容易產(chǎn)生外源性的D-乳酸與L-乳酸，這可能是因?yàn)槌爻睗竦沫h(huán)境更有利于微生物生長(zhǎng)，而這些微生物（如大腸桿菌等）可代謝生成D-乳酸與L-乳酸。

在7 L發(fā)酵罐中，使用菌株HBUT-LB，以保存在常溫潮濕環(huán)境中的玉米漿和葡萄糖結(jié)晶廢糖液為碳、氮源進(jìn)行發(fā)酵。

由圖7中A可知，0 h時(shí)培養(yǎng)基中含有0.9 g/L D-乳酸。未加入硝酸鈉時(shí)，菌株HBUT-LB在42 h內(nèi)僅能消耗0.23 g/L D-乳酸；加入硝酸鈉后，D-乳酸可在32 h內(nèi)被完全消耗，消耗速率為0.028 g/（L·h）。由圖7中B可知，未加入硝酸鈉時(shí)，菌株HBUT-LB在42 h時(shí)達(dá)到最大的L-乳酸產(chǎn)量98 g/L，生產(chǎn)速率為2.333 g/（L·h），光學(xué)純度為99.32%；當(dāng)加入硝酸鈉時(shí)，菌株HBUT-LB在38 h時(shí)達(dá)到最大的L-乳酸產(chǎn)量98.8 g/L，生產(chǎn)速率為2.6 g/（L·h），光學(xué)純度為99.99%。說(shuō)明通過(guò)添加硝酸鈉，工程菌HBUT-LB在發(fā)酵過(guò)程中可有效消除廉價(jià)原料中的外源D-乳酸，在保證L-乳酸最終產(chǎn)量的同時(shí)，將光學(xué)純度從99.32%提高至99.99%。與此同時(shí)，L-乳酸的生產(chǎn)周期縮短，產(chǎn)酸速率顯著提升11.44%。

由于大腸桿菌中存在硝酸還原酶與亞硝酸還原酶，因此，大腸桿菌具有代謝硝酸鹽與亞硝酸鹽的能力，在廉價(jià)原料發(fā)酵結(jié)束時(shí)在發(fā)酵液中經(jīng)測(cè)定后發(fā)現(xiàn)基本沒(méi)有硝酸鈉與亞硝酸鈉。

3 結(jié)論

本研究選取大腸桿菌L-乳酸工程菌株HBUT-L作為出發(fā)菌株，敲除了與L-乳酸利用相關(guān)的基因（lldD、ykgEFG），構(gòu)建了菌株HBUT-LB。根據(jù)菌株HBUT-LB在不同末端電子受體中的生長(zhǎng)參數(shù)，選擇的最佳末端電子受體為硝酸鈉。在廉價(jià)原料的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，使用在常溫潮濕處放置6個(gè)月的玉米漿和葡萄糖結(jié)晶廢糖液作為碳、氮源，并添加硝酸鈉。結(jié)果顯示，相較于未添加硝酸鈉，D-乳酸的消耗速率提高了460%，L-乳酸的生產(chǎn)速率提高了11.44%，L-乳酸的光學(xué)純度從99.32%提高至99.99%。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，通過(guò)對(duì)發(fā)酵液中的硝酸鈉與亞硝酸鈉進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌基本將硝酸鈉與亞硝酸鈉代謝完全。

為了清除發(fā)酵原料中存在的外源D-乳酸，本研究所用方法無(wú)需額外增加去除D-乳酸的處理步驟，而是在工程菌發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的同時(shí)將其去除，從而保證最終產(chǎn)物L(fēng)-乳酸的超高光學(xué)純度。該方法不僅可以降低工業(yè)發(fā)酵成本，而且能提高發(fā)酵收益，具有重要的工業(yè)化應(yīng)用潛力。

參考文獻(xiàn)：

［1］左希敏，劉濤.乳酸發(fā)酵技術(shù)的最新研究進(jìn)展［J］.中國(guó)調(diào)味品，2019，44（1）：195-197.

［2］張真翊，張宏.短腸綜合征治療方案中糞菌移植潛在價(jià)值分析與展望［J］.中國(guó)綜合臨床，2022，38（4）：382-385.

［3］N·通丘爾，小玉健太郎，P·南塔拉吉特，等.用于由各種碳源產(chǎn)生L-乳酸或及其鹽的嗜氧乳酸芽孢桿菌：中國(guó)，CN109072259B［P］.2022-08-26.

［4］尹豐偉，孫小龍，付永前，等.一種馴化米根霉的方法及生產(chǎn)乳酸的方法：中國(guó)，CN112501107B［P］.2023-03-14.

［5］許黎明，成春燕，呂軍.鼠李糖乳桿菌D-乳酸脫氫酶基因ldhD的敲除［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2016，35（6）：1421-1427.

［6］KYL-NIKKIL K， HUJANEN M， LEISOLA M， et al. Metabolic engineering of Lactobacillus helveticus CNRZ32 for production of pure L-（+）-lactic acid［J］.Applied and Environmental Microbiology，2000，66（9）：3835-3841.

［7］王曉杰，夏春榮，劉曉蘭.米曲霉發(fā)酵100%玉米漿的工藝條件優(yōu)化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2024，50（19）：103-109.

［8］任曉潔，班恒，賀壯壯，等.生物轉(zhuǎn)化玉米漿生產(chǎn)生物菌肥的共生發(fā)酵特性［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2022，38（17）：205-213.

［9］劉棗，付相敏，潘海亮，等.玉米漿對(duì)大腸桿菌JH-B22發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸的影響［J］.化學(xué)與生物工程，2017，34（11）：11-14.

［10］馮靜茹，于立雪，田康明，等.大腸桿菌D-乳酸脫氫酶（FAD）的分子克隆與酶學(xué)性質(zhì)［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2021，47（17）：22-26.

［11］FUTAI M， KIMURA H. Inducible membrane-bound L-lactate dehydrogenase from Escherichia coli purification and properties［J］.Journal of Biological Chemistry，1977，252（16）：5820-5827.

［12］PINCHUK G E， RODIONOV D A， YANG C， et al. Genomic reconstruction of Shewanella oneidensis MR-1 metabolism reveals a previously uncharacterized machinery for lactate utilization［J］.Proceedings of the National Academy of Science，2009，106（8）：2874-2879.

［13］VIJAYAKUMAR J， ARAVINDAN R， VIRUTHAGIRI R. Recent trends in the production， purification and application of lactic acid［J］.Chemical and Biochemical Engineering Quarterly，2008，22（2）：245-264.

［14］何成霞，鄒強(qiáng)，劉達(dá)玉，等.天蠶素抗菌肽（cecropin A）融合蛋白的表達(dá)及其分離純化工藝研究［J］.中國(guó)調(diào)味品，2021，46（10）：38-42，58.

［15］吳長(zhǎng)力，陳穎琪，陳桂柳，等.泡菜中植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的克隆表達(dá)［J］.中國(guó)調(diào)味品，2019，44（9）：9-12.

［16］EMERSON D F， WOOLSTON B M， LIU N， et al. Enhancing hydrogen-dependent growth of and carbon dioxide fixation by Clostridium ljungdahlii through nitrate supplementation［J］.Biotechnology and" Bioengineering，2019，116（2）：294-306.

［17］CHAI Y R， KOLTER R， LOSICK R， et al. A widely conserved gene cluster required for lactate utilization in Bacillus subtilis and its involvement in biofilm formation［J］.Journal of Bacteriology，2009，191（8）：2423-2430.

［18］余海蘭，方京京.高效液相色譜法同步測(cè)定蔬菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（7）：97-99.

［19］SWEENEY J， MURPHY C D， MCDONNELL K. Towards an effective biosensor for monitoring AD leachate： a knockout E. coli mutant that cannot catabolise lactate［J］.Applied Microbial and Cell Physiology，2015，99（23）：10209-10214.

［20］KATO Y， INABE K， HARAGUCHI Y， et al. L-Lactate treatment by photosynthetic cyanobacteria expressing heterogeneous L-lactate dehydrogenase［J］.Scientific Reports，2023，13（1）：7249.

［21］STEWART V， LU Y， DARWIN A J. Periplasmic nitrate reductase （NapABC enzyme） supports anaerobic respiration by Escherichia coli K-12［J］.Journal of Bacteriology，2002，184（5）：1314-1323.

［22］WANG H， TSENG C P， GUNSALUS R P. The napF and narG nitrate reductase operons in Escherichia coli are differentially expressed in response to submicromolar concentrations of nitrate but not nitrite［J］.Journal of Bacteriology，1999，181（17）：5303-5308.

［23］張勇婷.亞硝酸鹽誘導(dǎo)細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類抗生素耐受機(jī)制的研究［D］.杭州：浙江大學(xué)，2021.