紅豆杉健康與感葉斑病針葉的內(nèi)生微生物多樣性

摘 要 為探究人工林與天然林東北紅豆杉（Taxus cuspidata）健康葉與感葉斑病的病葉之間內(nèi)生真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異，分別剪取人工林與天然林10棵15 a生健康和感葉斑病紅豆杉的針葉，采用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序和生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：6組紅豆杉葉片中相同的真菌OTU（Operational Taxonomic Units）85個(gè)，占 OTU 總數(shù)的6.66%，相同的細(xì)菌OTU 26個(gè)，占 OTU 總數(shù)的3.72%。葦河鎮(zhèn)感葉斑病葉片較健康葉片的真菌OTU數(shù)增多，細(xì)菌OTU數(shù)減少；穆棱鎮(zhèn)天然林與人工林感葉斑病葉片較健康葉片的真菌OTU數(shù)減少，細(xì)菌OTU數(shù)增多。同時(shí)，天然林比人工林具有更多的真菌和細(xì)菌OTU數(shù)，細(xì)菌量差距較小。通過對(duì)紅豆杉針葉在門及屬水平的研究發(fā)現(xiàn)，同一地區(qū)天然林與人工林感病前后真菌群落結(jié)構(gòu)組成及變化趨勢(shì)基本相同。

關(guān)鍵詞 高通量測(cè)序；紅豆杉；葉斑??；真菌多樣性；細(xì)菌多樣性

東北紅豆杉（Taxus cuspidata）作為紅豆杉科（Taxaceae）紅豆杉屬（Taxus）植物，為中國(guó)一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)樹種，是分布于東北地區(qū)的第三紀(jì)孑遺樹種，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、觀賞價(jià)值和生態(tài)效益^[1-4]。東北紅豆杉天然種群本身生長(zhǎng)緩慢，天然結(jié)實(shí)率低，且對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較嚴(yán)，種群競(jìng)爭(zhēng)力較弱，再加上人為過度開發(fā)，東北紅豆杉天然林面積逐步縮小，已瀕臨滅絕^[5-6]。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于紅豆杉的研究主要在生態(tài)分布、扦插栽培以及物質(zhì)分析等方面，關(guān)于病害的研究較少。譙天敏等^[7]鑒定南方紅豆杉（T.wallichiana）根腐病病原為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），范曉龍等^[8]鑒定南方紅豆杉炭疽病病原為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），喬雨晴等^[9]鑒定曼地亞紅豆杉（T.axus media）枝枯病病原為棒狀新擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora），李陽(yáng)^[10]鑒定紅豆杉葉枯病病原為小孢擬盤多毛孢（Pestalotiopsis microspora）， Jeon等^[11]確定日本紅豆杉葉枯病病原菌為小孢擬盤多毛孢（P.microspora），近年來，隨著生物防治的逐漸完善，運(yùn)用植物內(nèi)生菌拮抗病原菌來防治葉斑病成為一種較為可行的方法^[12-14]。高通量測(cè)序能夠更為準(zhǔn)確快捷地了解微生物的性質(zhì)及其在自然界中的生態(tài)功能，通過高通量測(cè)序技術(shù)能夠一次性檢測(cè)出樣品中可能感染的多種病原物的基因序列，在病原檢測(cè)鑒定中應(yīng)用廣泛^[15-17]。

2021年在黑龍江省穆棱市穆棱鎮(zhèn)人工林內(nèi)發(fā)現(xiàn)了紅豆杉葉斑病的發(fā)生，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病害在染病葉片上發(fā)病，病變部位癥狀為：病變初期針葉尖端先變?yōu)辄S色，病變從針葉尖端朝著針葉基部逐漸擴(kuò)散，隨后整根枝條徹底枯死。紅豆杉葉斑病對(duì)紅豆杉危害較大，植物會(huì)多處發(fā)病。病害嚴(yán)重時(shí)隨著病原菌危害加劇，整株植物都會(huì)死亡，由此會(huì)給東北紅豆杉帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)分析人工林與天然林感紅豆杉葉斑病前后內(nèi)生微生物多樣性以及群落結(jié)構(gòu)的變化，探知優(yōu)勢(shì)微生物的分布，從而可用于指導(dǎo)篩選紅豆杉葉片內(nèi)生優(yōu)勢(shì)的葉斑病拮抗菌，并探究人工林與天然林以及不同地區(qū)人工林內(nèi)生微生物的差異，以期對(duì)東北紅豆杉的生物防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

采樣地點(diǎn)位于黑龍江省穆棱市穆棱鎮(zhèn)東北紅豆杉人工林、天然林及尚志市葦河鎮(zhèn)人工林。東北紅豆杉天然林樣地位于穆棱東北紅豆杉國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)（43°49′～44°06′ N，130°00′～" 130°28 E），樣地面積25 hm²。樣地地形走勢(shì)西南高，海拔最高781 m，最低658 m，高差123 m；年平均溫度在-2"" ℃，年平均降水量530 mm，土壤為暗棕壤。樣地內(nèi)森林群落優(yōu)勢(shì)種明顯，垂直層次復(fù)雜，是典型的中齡復(fù)層異齡林，其主要建群樹種為紫糖（Tilia amurensis）、紅松（Pinus koraiensis）、臭冷杉[JP2]（Abies nephrolepis）和楓樺（Betula costata）等，樣地內(nèi)共有胸徑（DBH）≥1 cm木本植物57種，隸屬于22科38屬。獨(dú)立個(gè)體為 63 877株，平均胸徑為7.83 cm，胸高斷面積 26.4 m²/hm²。樣地內(nèi)現(xiàn)有東北紅豆杉（T.axus cuspidate）成樹169株，天然更新幼苗350 ～ 450株。

穆棱鎮(zhèn)東北紅豆杉人工林（43°45′ N，131°00′ E）約500 hm²，1995年?duì)I建，土壤為暗棕壤，東北紅豆杉20 a以上開始結(jié)實(shí)，40 a以上果實(shí)質(zhì)量高，株行距為2.5 m×3 m，主要建群樹種為落葉松（Larix gmelinii），樣地內(nèi)現(xiàn)有東北紅豆杉共計(jì)100多萬株。

葦河鎮(zhèn)人工林位于葦河鎮(zhèn)林業(yè)局青山林木種子園，樣地面積5 000 hm²，其主要建群樹種為紅松（Pinus koraiensis）、紅豆杉（T.axus cuspidate）、樟子松（P.sylvestris）、沙松（A.holophylla）、水曲柳（F.mandschurica）、紫椴（T.amurensis），1994年開始種植東北紅豆杉，樣地內(nèi)現(xiàn)有東北紅豆杉2 000余株。

1.2 試驗(yàn)材料

2021年6月18日至20日，分別于黑龍江省穆棱市穆棱鎮(zhèn)人工林、天然林及尚志市葦河鎮(zhèn)人工林采集健康和感葉斑病紅豆杉葉片。采用“S”形十點(diǎn)采樣法，分別剪取10棵15 a生健康及感葉斑病紅豆杉針葉1.0 g，進(jìn)行表面消毒后得到穆棱鎮(zhèn)人工林、天然林及葦河鎮(zhèn)人工林各10.0 g健康樣品及10.0 g感病樣品。葦河鎮(zhèn)人工林健康樣品，感葉斑病樣品分別用S1和L1表示；穆棱鎮(zhèn)天然林健康樣品，感葉斑病樣品分別用S2和L2表示；穆棱鎮(zhèn)人工林健康樣品，感葉斑病樣品分別用S3和L3表示。將樣品分別置于2 mL的無菌離心管中，并于-80" ℃的超低溫冰箱中保存至DNA提取。

1.3 紅豆杉內(nèi)生微生物基因組 DNA 的提取及質(zhì)量檢測(cè)

紅豆杉樣品的基因組DNA參照 MP 試劑盒 Fast DNA Spin Kit for Soil 116560-200 的使用說明書進(jìn)行提取，將所提取到的 DNA 溶于50 μL無菌水中，混合均勻，置于-80 ℃保存，備用。之后使用NanoDrop 2000進(jìn)行基因組DNA濃度及純度檢測(cè)，使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行基因組DNA完整性檢測(cè)。待DNA完全溶解后，以TE緩沖液為空白對(duì)照，移取2 μL，使用超微量紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度。

1.4 16SrDNA 熒光定量 PCR 擴(kuò)增和高通量測(cè)序

利用2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)提取的 DNA的質(zhì)量，并將其送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序，之后基于 Miseq平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

真菌ITS選擇ITS1 和ITS2R 作為引物，分別為 5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′和 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′；細(xì)菌 16S rRNA 選擇 799F 和 1193R 作為引物，引物序列分別為 5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′和 5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′; 利用 Illumina MiSeq 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序和分析。

下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過 QIIME（ v1.8.0） 軟件過濾、拼接和去除嵌合體，去除各樣本中reads 尾部質(zhì)量值在 20 以下的堿基、切除 reads 中含N 部分序列，并去除數(shù)據(jù)中的短序列（長(zhǎng)度閾值200"" bp），隨后再對(duì)低復(fù)雜度的序列進(jìn)行過濾。采用Usearch（ v7.1） 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，物種比對(duì)注釋使用RDP classifier 軟件，保留置信區(qū)間大于0.8 的注釋結(jié)果。用R語(yǔ)言工具繪制稀釋性曲線，韋恩（Venn）圖，群落結(jié)構(gòu)圖及主坐標(biāo)分析圖（Principal Co-ordinates Analysis，PcoA）。利用 Mothur 軟件（version v.1.30.2 http：//www.mothur.org/wiki/Schloss_ SOP#Alpha_diversity）進(jìn)行 Chao1 （估計(jì)物種總數(shù)）指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)（Shannon） 、氣旋能量指數(shù)（Accumulated cyclone energy， Ace）、辛普森（Simpson）指數(shù)、Coverage（覆蓋度）指數(shù)計(jì)算分析，并在各分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析，得到微生物群落結(jié)構(gòu)組成。生境內(nèi)的多樣性指數(shù) （within-habitat diversity，Alpha）可用來反映生物群落的豐富度和多樣性。其中，Ace、Chao1指數(shù)可反映生物物種的豐富度，其數(shù)值越大表示該樣品物種豐富度越大，其中Ace指數(shù)用來估計(jì)樣本中物種組成均勻度的指數(shù)，Chao1指數(shù)用來估計(jì)樣本中所含OTU（Operational Taxonomic Units）數(shù)目的指數(shù)；Shannon、Simpson指數(shù)可以反映生物群落的多樣性，其中Shannon指數(shù)用來衡量群落的異質(zhì)性，其數(shù)值越大表示群落多樣性越高，Simpson指數(shù)代表隨機(jī)取樣的2個(gè)體屬于不同種的概率，其數(shù)值越大表示群落物種分布越均勻；Coverage指數(shù)則可以反映生物群落的覆蓋度，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測(cè)出的概率越高，該指數(shù)反映本次測(cè)序結(jié)果是否代表了樣本中微生物的真實(shí)情況。生境間多樣性 （between-habitat diversity，Beta）分析通過對(duì)不同微生物群落間的物種多樣性進(jìn)行組間比較分析，探索不同分組樣本間群落組成的相似性或差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序質(zhì)量分析

通過對(duì)穆棱鎮(zhèn)人工林、天然林及葦河鎮(zhèn)人工林健康紅豆杉及感葉斑病紅豆杉針葉6種樣品進(jìn)行高通量測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，S1、L1、S2、L2、S3、L3分別得到102 022、107 001、100 624、68 539、61 652和54 618條有效真菌序列及16 090、17 183、 18 905、15 575、15 207和12 316條有效細(xì)菌序列，對(duì)測(cè)序獲得的序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣，以抽到的序列數(shù)與其所代表的OTU數(shù)構(gòu)建稀釋曲線（圖1）。從圖1-A和圖1-B可以看出，6種針葉內(nèi)生微生物的稀釋曲線均趨于平坦，表明測(cè)序數(shù)據(jù)能很好地反映各樣品中真菌及細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性，更多的測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)發(fā)現(xiàn)新的OTU貢獻(xiàn)率較小。

將測(cè)序所得的有效序列按97%的相似度進(jìn)行OTU的劃分后整理繪制的韋恩圖（圖2）。由表1可知，在6種樣品中檢測(cè)到的真菌總OTU為1 276個(gè)，其中S1組有376個(gè)、L1組有515個(gè)、S2組有709個(gè)、L2組有689個(gè)、S3組有494個(gè)及L3組有357個(gè)OTU。由圖2-A可知，6組樣品中共有相同的OTU 85個(gè)，占 OTU 總數(shù)的6.66%，6組樣品中特有的 OTU分別為34、21、26、24、33及22個(gè)；在6組樣品中檢測(cè)到的細(xì)菌總OTU為699個(gè)，其中S1組有274個(gè)、L1組有251個(gè)、S2組有279個(gè)、L2組有219個(gè)、S3組有211個(gè)及L3組有301個(gè)OTU。由圖2-B可知，6組樣品中共有相同的OTU 26個(gè)，占 OTU 總數(shù)的3.72%，6組樣品中特有的 OTU分別為78、39、28、25、6及69個(gè)。以上結(jié)果表明：葦河鎮(zhèn)感葉斑病樣品相較健康樣品真菌OTU數(shù)增多，細(xì)菌OTU數(shù)減少；而穆棱鎮(zhèn)天然林與人工林感葉斑病樣品相較健康樣品真菌OTU數(shù)減少，細(xì)菌OTU數(shù)增多。同時(shí)，天然林樣品比人工林樣品具有更多的真菌與細(xì)菌OTU數(shù)，細(xì)菌量差距較小。

2.2 感病前后紅豆杉葉片的微生物群落門類組成

在97%的相似度水平對(duì)樣品序列進(jìn)行OTU聚類，由表1可知，6 組紅豆杉針葉微生物多樣性豐富，共鑒定得出真菌7個(gè)門，26個(gè)綱，78個(gè)目，184個(gè)科，354個(gè)屬，517個(gè)種；細(xì)菌25個(gè)門，55個(gè)綱，132個(gè)目，217個(gè)科，362個(gè)屬，530種。

在相似水平為97%的條件下，與Gold database數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，對(duì)所得序列進(jìn)行聚類分析，圖3所示為感病前后人工林與天然林內(nèi)生真菌和細(xì)菌在門水平上的群落結(jié)構(gòu)特征（物種多度占比大于0.1%的門）。由圖3-A可知，從真菌分類門水平看，人工林和天然林6種樣品檢測(cè)出3個(gè)相對(duì)多度較高的真菌類群，即： 子囊菌門 、擔(dān)子菌門及未鑒定出的真菌（unclassified_k__Fungi）。其中S1 與L1 相比 ，子囊菌門的相對(duì)多度由82.89%降至 59.40%，擔(dān)子菌門的相對(duì)多度由16.73%增至39.90%；S2 與L2 相比 ，子囊菌門的相對(duì)多度由46.94%增至82.25%，擔(dān)子菌門的相對(duì)多度由23.16%降至9.45%，unclassified_k__Fungi的相對(duì)多度由29.84%降至8.29%；S3 與L3 相比 ，子囊菌門的相對(duì)多度由46.38%增至74.20%，擔(dān)子菌門的相對(duì)多度由37.32%降至24.21%，unclassified_k__Fungi的相對(duì)多度由16.30%降至1.57%。結(jié)果表明：在門水平下，不同地區(qū)真菌群落結(jié)構(gòu)組成差異較大，葦河鎮(zhèn)人工林感病后子囊菌門的相對(duì)多度下降，擔(dān)子菌門的相對(duì)多度升高；穆棱鎮(zhèn)的人工林及天然林感病后子囊菌門的相對(duì)多度升高，擔(dān)子菌門的相對(duì)多度下降。同一地區(qū)天然林與人工林感病前后真菌群落結(jié)構(gòu)組成及變化趨勢(shì)基本相同，天然林感病后子囊菌門比人工林上升的更多，擔(dān)子菌門比人工林下降的更多。

由圖3-B可知，人工林和天然林6種樣品主要檢測(cè)出8個(gè)相對(duì)多度較高的細(xì)菌類群，即： 變形菌門（Proteobacteria），放線菌門（Actinobacteriota），厚壁菌門（Firmicutes），擬桿菌門（Bacteroidota），粘球菌門 （Myxococcota），酸桿菌門（Acidobacteriota），浮霉菌門（Planctomycetota），裝甲菌門（Armatimonadota）。其中變形菌門與放線菌門為6種針葉共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，S1 、L1 、S2 、L2 、S3和L3中變形菌門的相對(duì)多度分別為67.17%、 76.05%、52.51%、48.31%、64.82%和20.44%，放線菌門的相對(duì)多度分別為8.42%、 11.62%、41.38%、34.99%、23.63%和52.41%。厚壁菌門與擬桿菌門為S1 、L1 、S3和L3共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，厚壁菌門的相對(duì)多度分別為11.35%、1.95%、0.75%和18.67%，擬桿菌門的相對(duì)多度分別為10.33%、1.44%、8.10%和3.30%；粘球菌門為L(zhǎng)1、S2 、L2 及S3共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，相對(duì)多度分別為6.98%、4.49%、1.10%和1.10%；酸桿菌門只在L1和L2中為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，相對(duì)多度分別為 1.25%和12.58%；浮霉菌門在L3中為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，裝甲菌門在L2中為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。在門水平下，不同地區(qū)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成差異較大，葦河鎮(zhèn)人工林感病后變形菌門的相對(duì)多度升高，放線菌門的相對(duì)多度升高；穆棱鎮(zhèn)人工林及天然林感病后變形菌門的相對(duì)多度降低；穆棱鎮(zhèn)天然林感病后放線菌門的相對(duì)多度降低，穆棱鎮(zhèn)人工林感病后放線菌門的相對(duì)多度升高；葦河鎮(zhèn)人工林及穆棱鎮(zhèn)人工林中擬桿菌門的相對(duì)多度下降。

根據(jù)物種分類結(jié)果，由于樣品中所檢測(cè)出的真菌及細(xì)菌種類繁多，許多物種含量十分少，因此篩選出優(yōu)勢(shì)物種，并對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌及優(yōu)勢(shì)細(xì)菌進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)并將在兩組樣品中含量均小于1%的物種合并至其他類別。由圖4-A可知， Genolevuria屬、unclassified_f__Taphrinaceae及枝孢霉屬（Cladosporium）為6組共有的優(yōu)勢(shì)真菌；外囊菌屬（Taphrina）、尾孢屬（Cercospora）、亞隔孢殼屬（Didymella）及短梗霉屬（Aureobasidium）為S1 、L1 、S3和L3中共有的優(yōu)勢(shì)真菌，unclassified_f__Trichomeriaceae為S2 、L2 、S3和L3中共有的優(yōu)勢(shì)真菌；盤雙端毛孢屬（Seimatosporium）為L(zhǎng)1 、L2和L3中共有的優(yōu)勢(shì)真菌；Retiarius屬為S2和L2中共有的優(yōu)勢(shì)真菌，線黑粉酵母屬（Filobasidium）、unclassified_o__Tremellales為S3和L3中共有的優(yōu)勢(shì)真菌，穴殼屬（Dothiora）為L(zhǎng)2和L3中共有的優(yōu)勢(shì)真菌。S1中特有的優(yōu)勢(shì)真菌為副孢霉屬（Paramycosphaerella）、柱隔孢屬（Ramularia）、Mycodiella屬、Arthrocatena屬、膜盤菌屬（Pezoloma）、unclassified_f__Hyaloscyphaceae、小莢孢腔菌屬（Sporormiella）及盤單毛孢屬（Monochaetia），L1特有的優(yōu)勢(shì)真菌為彎梗孢屬（Camptophora）、Claussenomyces屬，S2中特有的優(yōu)勢(shì)真菌為unclassified_o__Chaetothyriales、unclassified_f__Didymellaceae、unclassified_o__Erythrobasidiales，L2中特有的優(yōu)勢(shì)真菌為毛葡孢屬（Bradymyces）、Pectenia屬、unclassified_oCapnodiales、赤霉菌屬（Gibberella）、Capronia屬、Phylliscum屬、unclassified_o__Pleosporales、Udeniomyces屬及Sugitazyma屬，S3中特有的優(yōu)勢(shì)真菌為彎擔(dān)菌屬（Curvibasidium）、銀耳屬（Tremella）、鐮孢屬（Fusarium）及帚枝霉屬（Sarocladium），L3中特有的優(yōu)勢(shì)真菌為假蕉孢殼屬（Diatrypella）。結(jié)果表明：外囊菌屬、尾孢屬、亞隔孢殼屬及短梗霉屬為人工林特有的優(yōu)勢(shì)真菌；Retiarius屬為天然林特有的優(yōu)勢(shì)真菌；盤雙端毛孢屬為感葉斑病樣品中共有的優(yōu)勢(shì)真菌；穴殼屬為穆棱人工林和天然林感葉斑病樣品中共有的優(yōu)勢(shì)真菌。

由圖4-B可知，6種樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成不盡相同，且相對(duì)多度的差異也較大。馬賽菌屬（Massilia）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）及unclassified_f__Microbacteriaceae為6組共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌；勞爾氏菌屬（Ralstonia）為S1 、L1 、S3和L3中共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌；中村氏菌屬（Nakamurella）、弗萊德門菌屬（Friedmanniella）為S2 、L2 、S3和L3中共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，泛菌屬（Pantoea）、克雷伯菌屬（Klebsiella）為S1和L1中共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，從毛單胞菌屬（Comamonas）為S3和L3中共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，貪噬菌屬（Variovorax）為S1和S2中共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，動(dòng)球菌屬（Kineococcus）為S2和S3中共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，嗜酸菌屬（Acidiphilium）、根瘤菌屬（Bradyrhizobium）為L(zhǎng)1和L2中共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。S1中特有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為擬桿菌屬（Bacteroides）、地芽孢桿菌屬（Geobacillus）、湖沉積桿菌屬（Limnobacter）、代爾夫特菌屬（Delftia）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、大腸埃希菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、噬氫菌屬（Ottowia）、亞硝化單胞菌（Nitrosomonas）及Clostridium_sensu_stricto_8，S2中特有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為甲基桿菌屬（Methylobacterium-Methylorubrum）、湖沼菌屬（Limnohabitans）、諾卡氏菌屬（Nocardioides）、Klenkia屬，L2中特有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為Jatrophihabitans屬、unclassified_f__Acidobacteriaceae_Subgroup_1、norank_f__Caulobacteraceae、布氏菌屬（Bryocella）、norank_f__Acetobacteraceae、顆粒菌屬（Granulicella）、新鞘脂菌屬（Novosphingobium）、大理石雕菌屬（Marmoricola）、四折疊球菌屬（Quadrisphaera）及放線孢菌屬（Actinomycetospora），S3中特有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）及寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas），L3中特有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、SM1A02、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、馬杜拉放線菌屬（Actinomadura）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、裂孢菌屬（Thermobifida）。結(jié)果表明：勞爾氏菌屬為紅豆杉人工林特有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌；貪噬菌屬為紅豆杉健康樣品中共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，動(dòng)球菌屬為穆棱紅豆杉樣品中共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，嗜酸菌屬、根瘤菌屬為感葉斑病樣品中共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。

2.3 群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

2.3.1 Alpha多樣性 [HT]如表2所示，本研究將相似度為97%的序列劃分為1個(gè) OTU進(jìn)行多樣性指數(shù)計(jì)算，并以五個(gè)衡量指數(shù)詳細(xì)列出了6種樣品中微生物的豐富度和多樣性分布情況。所有樣品真菌及細(xì)菌的覆蓋度（Coverage）均超過99%，表明真菌及細(xì)菌的測(cè)序深度已達(dá)到較高水平，數(shù)據(jù)可靠。

感病前后人工林與天然林6種紅豆杉針葉樣品中真菌與細(xì)菌群落的 Alpha 多樣性指數(shù)部分有差異。6種樣品的真菌群落中S2（穆棱鎮(zhèn)天然林健康樣品）的 Chao1指數(shù)最高，即測(cè)得OTU數(shù)最高，其次分別為 L2、L1、S3、L3、S1；6種樣品的細(xì)菌群落中L3的 Chao1指數(shù)最高，其次分別為S2、S1、L1、L2、S3。

6種樣品的真菌群落中L2的 Shannon指數(shù)最高，即群落多樣性最高，其次分別為S1、S3、S2、L3、L1，6種樣品的細(xì)菌群落中L2的 Shannon指數(shù)最高，其次分別為S1、S2、S3、L1、L3。6種樣品的真菌與細(xì)菌群落中Shannon指數(shù)均差異較大，Simpson多樣性指數(shù)所表現(xiàn)的多樣性規(guī)律與Shannon多樣性指數(shù)結(jié)果相反。結(jié)果表明：穆棱鎮(zhèn)天然林健康樣品的物種豐富度最高，Chao1指數(shù)的變化與OTU數(shù)的趨勢(shì)相同；葦河鎮(zhèn)人工林及穆棱鎮(zhèn)人工林感葉斑病樣品相較健康樣品真菌與細(xì)菌群落多樣性降低；而穆棱鎮(zhèn)天然林感葉斑病樣品相較健康樣品真菌與細(xì)菌群落多樣性 升高。

2.3.2 Beta多樣性 [HT]主坐標(biāo)分析（PCoA分析）可用來研究樣本群落組成的相似性或差異性，此分析以點(diǎn)的形式將多組數(shù)據(jù)的差異性反映在二維坐標(biāo)圖上，點(diǎn)與點(diǎn)之間距離的遠(yuǎn)近代表樣品中群落的差異程度。由圖5-A可以看出，S1與L1，S3[CM（21]與L3分別在同一區(qū)域且S2與L2的距離最短；由圖5-B可以看出，S1與L1，S2與L2，S3與L3分別在同一區(qū)域且兩者之間的距離最短。結(jié)果表明：感病前后樣品中的真菌、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及相對(duì)多度都發(fā)生了變化；不同地區(qū)樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)組成差距較大；同地區(qū)天然林與人工林的微生物群落結(jié)構(gòu)組成差距較大。

3 討" 論

本研究通過Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)，分別對(duì)葦河鎮(zhèn)人工林、穆棱鎮(zhèn)天然林及人工林的紅豆杉健康葉和感葉斑病葉片內(nèi)生微生物的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：葦河鎮(zhèn)感葉斑病樣品相較健康樣品真菌OTU數(shù)增多，細(xì)菌OTU數(shù)減少；而穆棱鎮(zhèn)天然林與人工林感葉斑病樣品相較健康樣品真菌OTU數(shù)減少，細(xì)菌OTU數(shù)增多。同時(shí)，天然林樣品比人工林樣品具有更多的真菌與細(xì)菌OTU數(shù)，細(xì)菌量差距較??；穆棱鎮(zhèn)天然林樣品相較人工林樣品具有更多的真菌OTU數(shù)及較少的細(xì)菌OTU數(shù)。

通過對(duì)6種紅豆杉針葉樣品在門及屬水平上差異的研究發(fā)現(xiàn)，門水平下，不同地區(qū)真菌及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成差異較大，葦河鎮(zhèn)人工林感病后子囊菌門的相對(duì)多度下降，擔(dān)子菌門的相對(duì)多度升高；穆棱鎮(zhèn)的人工林和天然林感病后子囊菌門的相對(duì)多度升高，擔(dān)子菌門的相對(duì)多度下降；葦河鎮(zhèn)人工林感病后變形菌門的相對(duì)多度升高，放線菌門的相對(duì)多度升高；穆棱鎮(zhèn)人工林及天然林感病后變形菌門的相對(duì)多度降低；穆棱鎮(zhèn)天然林感病后放線菌門的相對(duì)多度降低，穆棱鎮(zhèn)人工林感病后放線菌門的相對(duì)多度升高；葦河鎮(zhèn)人工林及穆棱鎮(zhèn)人工林中擬桿菌門的相對(duì)多度下降。在屬水平下，外囊菌屬、尾孢屬、亞隔孢殼屬及短梗霉屬為人工林特有的優(yōu)勢(shì)真菌；Retiarius屬為天然林特有的優(yōu)勢(shì)真菌；盤雙端毛孢屬為感葉斑病樣品中共有的優(yōu)勢(shì)真菌；穴殼屬為穆棱感葉斑病樣品中共有的優(yōu)勢(shì)真菌。勞爾氏菌屬為紅豆杉人工林特有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌；貪噬菌屬為紅豆杉健康樣品中共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，動(dòng)球菌屬為穆棱紅豆杉樣品中共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，嗜酸菌屬、根瘤菌屬為感葉斑病樣品中共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。

通過紅豆杉感病樣品中特有的優(yōu)勢(shì)屬推測(cè)紅豆杉葉斑病的病原菌。盤雙端毛孢屬（Seimatosporium）為L(zhǎng)1 、L2和L3中共有的優(yōu)勢(shì)真菌，穴殼屬（Dothiora）為L(zhǎng)2和L3中共有的優(yōu)勢(shì)真菌。Seimatosporium為土壤中的常見菌屬，Dothiora的無性階段為瘍殼孢屬（Dothichiza）^[18]，是引起樹木潰瘍病的主要病原真菌類群之一，而其他植物葉斑病的病原菌多為鏈格孢菌（Alternaria），如商娜等^[19]確定白三葉草葉斑病病原菌為喬木鏈格孢（Alternaria arborescens），楊志英等^[20]確定茶葉斑病病原菌為長(zhǎng)柄鏈格孢菌（Alternaria longipes），劉俏等^[21]確定櫻桃葉斑病病原菌為鏈格孢（Alternaria alternata），張建強(qiáng)等^[22]確定芹菜葉斑病病原菌為細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissima），魯海菊等^[23]確定云南萬壽菊葉斑病病原菌為蕓苔生鏈格孢（Alternaria brassicicola）。通過分析發(fā)現(xiàn)Dothiora極有可能為紅豆杉葉斑病的病原菌。本研究通過高通量測(cè)序分析紅豆杉葉斑病的發(fā)生對(duì)紅豆杉葉片內(nèi)生微生物的種類及數(shù)量的影響，為紅豆杉葉斑病的發(fā)病機(jī)制及防控技術(shù)提供理論依據(jù)。

4 結(jié)" 論

紅豆杉葉斑病發(fā)生后，感葉斑病病葉與健康葉相比，葦河鎮(zhèn)感葉斑病樣品相較健康樣品真菌OTU數(shù)增多，細(xì)菌OTU數(shù)減少；而穆棱鎮(zhèn)天然林與人工林感葉斑病樣品相較健康樣品真菌OTU數(shù)減少，細(xì)菌OTU數(shù)增多。天然林比人工林具有更多的真菌與細(xì)菌物種且細(xì)菌物種數(shù)差距較小。

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Endophytic Microbial Diversityin Healthy and Leaf Spot Sensitive Needles of Taxus cuspidata

LIU Zheng and DONG Airong

（College of Forestry， Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）

Abstract To investigate the differences of endophytic fungal and bacterial community structure between healthy and spot-sensitive leaves of Taxus cuspidata in planted and natural forests， the needles of ten 15-year old healthy and spot-sensitive Taxus cuspidata were selected for Illumina Miseq high-throughput sequencing and subsequent bioinformatic analysis.The results showed 85 identical fungal operational taxonomic units （OTUs， accounting for 6.66% of the total OTUs） and 26 identical bacterial OTUs （3.72% of the total OTUs） across six groups of Taxus leaves. In the leaf spot of Weihe Town， the number of fungal OTU increased， while the number of bacterial OTU decreased compared with the healthy leaves.However，" in leaf spot of natural forest and planted forest in Muling Tow， the number of fungal OTU decreased， and the number of bacterial OTU increased compared with the healthy leaves.Additionally， the natural forest exhibited a higher number of fungal and bacterial OTUs than those in planted forest samples， respectively， with a marginal difference in bacterial quantity between natural and planted forests.Based on the difference of Taxus conifer samples at phylum and genus level， the composition and change trend of fungal community are similar before and after infection in both natural and planted forests within the same area.

Key words High-throughput sequencing; Taxus cuspidata; Leaf spot; Fungal diversity; Bacterial diversity

Received" 2023-05-30""" Returned 2023-10-04

Foundation item National Natural Science Foundation of China （No.31670494）.

First author LIU Zheng， female， master student.Research area：forest pathology.E-mail：liuzheng1266@163.com

Corresponding"" author DONG Airong， male， associate professor.Research area：forest pathology. E-mail：darlmy@tom.com

（責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31670494）。

第一作者：劉 崢，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯植±韺W(xué)。E-mail：liuzheng1266@163.com

通信作者：董愛榮，男，副教授，研究方向?yàn)樯植±韺W(xué)。E-mail：darlmy@tom.com